Metodi di studio delle interazioni proteina-proteina. Metodi biochimici

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1 Metodi di studio delle interazioni proteina-proteina Metodi biochimici

2 Interazioni proteina-proteina Giocano un ruolo fondamentale nell organizzazione strutturale e funzionale della cellula Interazioni stabili: complessi proteici Interazioni transienti: controllano la maggioranza di processi cellulari

3 L interazione proteina- proteina può essere identificata analizzando l effetto prodotto L interazione proteina-proteina può: 1. Modificare le costanti cinetiche di un enzima 2. Indirizzare il substrato verso una determinata via metabolica (substrate channeling) 3. Determinare la formazione di un nuovo sito di binding (F1 ATPasi) 4. Cambiare la specificità di una proteina per un suo substrato (interazione dei fattori di trascrizione con l RNA polimerasi indirizza l enzima verso diversi promotori)

4 Metodi biochimici: cromatografia di affinità overlay crosslinking co-immunoprecipitazione Metodi biofisici: FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer SPR: Surface Plasmon Resonance Metodi genetici : phage display sistema a doppio ibrido e varianti (protein complementation assay)

5 CROMATOGRAFIA DI AFFINITA Il metodo si basa sulla formazione reversibile del complesso BPL Il legame tra ligando L e binding-protein BP deve essere reversibile BP + L BINDING PROTEIN LIGANDO k +1 k -1 BPL COMPLESSO k +1 [BP]. [L]=k -1 [BPL] k -1 k +1 = K D [BP]. [L] [BPL]

6 CROMATOGRAFIA DI AFFINITA Immobilizzazione della proteina sonda su resina cromatografica purezza della proteina da immobilizzare influenza di modificazioni post-sintetiche e cofattori concentrazione della proteina immobilizzata (>Kd) tecnica molto sensibile si possono usare miscele proteiche molto complesse si possono usare proteine mutate Complessi con K D <10-4 M sono difficili da identificare Complessi con K D >10-10 M difficilmente si possono eluire in condizioni native

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8 Matrice: una matrice ideale deve avere le seguenti caratteristiche: Contenere gruppi chimici adatti per il legame covalente Essere stabile nelle condizioni di legame Essere inerte Possono essere suddivise in due categorie principali: POLIMERI NATURALI: POLISACCARIDI POLIMERI SINTETICI (agarosio, destrano, cellulosa) (polistirene, poliacrilati))

9 Ligandi Devono avere uno o più gruppi adatti per il legame covalente non coinvolti con il legame con la binding protein. I gruppi più comuni sono NH 2, COOH, SH, OH Residui reattivi delle proteine

10 In genere si interpone al ligando un braccetto spaziatore di dimensione variabile che aumenta l accessibilità della binding protein al ligando

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12 Procedura di accoppiamento mediante bromuro di cianogeno (gruppi amminici) Si attiva la resina a ph alcalino Si risospende la binding-protein Si bloccano i rimanenti gruppi attivi Si lava

13 Accoppiamento con esteri della N-idrossisuccinimmide (gruppi amminici)

14 Accoppiamento mediante epossidi ph basico (gruppi NH 2,SH,OH) L-NH 2 L-SH L-OH Reazione di sostituzione nucleofila

15 Procedimento per legare proteine contenenti gruppi SH 2 piridil-tione assorbe a 343 nm L attacco prevede uno scambio tra gruppi tiolici formazione di ponti disolfuro tra proteina e resina liberazione di 2 piridil tione

16 Reazione di accoppiamento tra gruppi carbossilici e gruppi amminici mediante carbodiimmidi (Formazione legame ammidico) La carbodiimmide reagisce con il gruppo carbossilico a ph 4.5 per formare l ossiacilurea Il carbonio carbonilico dell ossiacilurea subisce l attacco nucleofilo dal gruppo amminico per formare un legame ammidico con liberazione di urea

17 PROTEINE RICOMBINANTI CON AFFINITY TAG (Pull-down) Fusion-protein vector: Promotors etc. ATG Cloning site ATG Transcription/translation Product is fusion of Your protein and Affinity tag Peptidi o proteine di fusione che possono essere purificate mediante l interazione con piccole molecole immobilizzate sulle resine. Ad esempio His-Tag, glutatione S-transferasi, maltosio binding protein si legano a resine che contengono rispettivamente un metallo chelato, il glutatione ed il maltosio Peptidi che possono essere purificati su resine in cui sono immobilizzate le proteine partner (calmodulin binding protein) CBP si lega a resine in cui è stata immobilizzata la calmodulina Peptidi che possono essere purificati su resine in cui sono immobilizzati anticorpi (peptide FLAG etc)

18 CROMATOGRAFIA DI AFFINITA SU METALLO CHELATO Acido nitrilotriacetico NTA -Tag: sequenza di sei His -Il peptide si lega alla resina anche in condizioni denaturanti -Eluizione con tampone contenente imidazolo o anche variando il ph

19 Glutatione S trasferasi

20 IMMUNOPRECIPITAZIONE E un metodo per purificare un antigene Si fa reagire un anticorpo (monoclonale o policlonale) contro target specifico Si aggiunge la proteina A immobilizzata su sefarosio Si precipita l immunocomplesso per centrifugazione Ogni proteina non precipitata dal supporto- proteina A o G viene lavate via CO-IMMUNOPRECIPITAZIONE La reazione di immunoprecipitazione può far precipitare oltre all antigene altre macromolecole che interagiscono con l antigene

21 Valutazione co-immunoprecipitazione I componenti dell immunocomplesso sono eluiti e analizzati su SDS- PAGE seguita da Western blot per verificare l identità dell antigene Confermare che la proteina co-precipitata si ottenga solo con l anticorpo contro la proteina esca Verificare che l anticorpo non riconosca direttamente la proteina coprecipitata Determinare se l interazione sia diretta o indiretta Determinare che l interazione avvenga nella cellula e non sia una conseguenza della lisi

22 Affinity blot Overlay o Far Western blotting La tecnica prevede: separazione delle proteine da analizzare in SDS-PAGE blotting su nitrocellulosa o PVDF incubazione con la sonda di interesse (proteina di cui si vuol studiare l interazione). La sonda può essere: Radioattiva Biotinilata Visualizzata con uno specifico anticorpo Si utilizzano spesso proteine di fusione contenenti TAG per i quali sono disponibili anticorpi Limiti: SDS-PAGE avviene in condizioni riducenti e denaturanti alle quali non sempre è possibile mantenere le interazioni proteina-proteina

23 Overlay o affinity blot Proteine da analizzare SDS-PAGE Incubazione del filtro con la sonda (proteina radioattiva ) migrazione Trasferimento su filtro di nitrocellulosa bande proteiche Autoradiografia

24 Cross-linkers I cross-linker permettono di legare covalentemente due proteine che interagiscono Sono molecole che contengono due gruppi funzionali reattivi uguali (omobifunzionali) o diversi (eterobifunzionali) separati da un braccio spaziatore Gruppi funzionali delle proteine che possono reagire con i cross-linker: gruppi amminici, carbossilici, sulfidrilici, carboidrati (carbonili) Gruppi reattivi dei cross-linker: spesso sono gli stessi usati per le immobilizzazioni

25 Schemi di reazione dei cross-linker. Gruppi amminici Immidoesteri Sono instabili a ph neutro Esteri dell N-idrossi-succinimmide Efficienti a ph neutro

26 Maleimmidi Schemi di reazione dei cross-linker. Gruppi sulfidrilici a ph neutro formano legami tioetere stabili Alogenuri alchilici Piridil-disolfuri Formano ponti disolfuro. Il 2-piridil-tione assorbe a 343 nm.

27 Schemi di reazione dei cross-linker. Gruppi carbonilici Idrazidi Reagiscono con gruppi carbonilici che derivano dalla ossidazione dei carboidrati

28 Schemi di reazione dei cross-linker. Crosslinker fotoreattivi Aril-azidi Sono chimicamente inerti e attivate dalla luce UV, il gruppo nitrene reattivo che si forma reagisce con doppi legami, legami C-H e N-H

29 Criteri di scelta dei cross-linker Specificità chimica Lunghezza del braccio spaziatore Solubilità in acqua e permeabilità alle membrane Gruppi reattivi uguali (omobifunzionali) o differenti (eterobifunzionali) Cross-link reversibile o irreversibile Possibilità di marcatura radioattiva Possibilità di cross-link two-step

30 Cross-linker omobifunzionali DTSSP 3,3 -Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate) BS 3 Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate Il cross-link è reversibile con DTT Il cross-link è irreversibile EGS (Ethylene glycol bis[succinimidylsuccinate]) Il cross-link è reversibile a ph 8.5 con idrossilamina

31 Cross-linker eterobifunzionali Sulfo-LC-SPDP (Sulfosuccinimidyl 6-(3'- [2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate) Sulfo-EMCS ([N-e-Maleimidocaproyloxy] sulfosuccinimide ester)

32 Uso dei cross-linker per caratterizzare l architettura molecolare di un complesso Complesso proteico purificato (non strettamente necessario) Cross-linking Proteolisi Separazione ed identificazione dei peptidi modificati, mediante spettrometria di massa (LC-MS)

33 La Ferroportina, trasportatore di ferro nei vertebrati, forma omodimeri