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1 I Clostridi

2 FAMIGLIA: Bacillaceae Comprende microrganismi sporigeni; Comprende numerosi generi, tra cui 2 importanti per la patologia umana: Clostridium e Bacillus GENERE: Clostridium BACILLI, GRAM +, SPORIGENI, RELATIVAMENTE GRANDI, ANAEROBI OBBLIGATI: i) non producono enzimi in grado di inattivare i prodotti tossici dell azoto e dell ossigeno (catalasi, perossidasi, superossido dismutasi ecc.); ii) hanno enzimiche operano bene solo allo stato ridotto. UBIQUITARI: si moltiplicano nel lume intestinale degli erbivori e le spore, emesse con lefeci, contaminano l ambiente sopravvivendo a lungo (possono essere sparse con il vento e sono presenti nella polvere)

3 ALCUNE SPECIE ELABORANO POTENTI ESOTOSSINE Specie Malattia/tossina prodotta C. tetani Agente eziologico del TETANO; Tossina tetanica (tetanospasmina) C. botulinum Agente eziologico del BOTULISMO, una grave intossicazionealimentare; Tossina botulinica C. perfringens Agente eziologico della GANGRENA GASSOSA, una grave patologia che si sviluppa in seguito all'infezione di ferite con spore. I microrganismi producono gas in seguito ai processi di fermentazione ed elaborano numerose tossine ad azione necrotizzante (es. tossina alfa) C. difficile Responsabile di una SINDROME DIARROICA associata all'uso prolungato di antibiotici

4 I clostridi: batteri sporigeni Clostridium tetani Clostridium botulinum Clostridium perfrigens Clostridium difficile anaerobi Attecchimento e la moltiplicazione favorita da: 1. necrosi del tessuto e quindi diminuito afflusso di sangue e quindi di O 2 2. presenza contemporanea di batteri aerobi 3. Acatalasemia (diminuita concentrazione ematica di catalasi, enzima che converte il perossido di idrogeno in acqua e ossigeno)

5 I clostridi: batteri sporigeni Sono bacilli Gram positivi di 3-8 mm di lunghezza In gran parte sono mobili per la presenza di flagelli peritrichi Raramente capsulati Producono spore a localizzazione somatica terminale

6 Clostridi Vivono come saprofiti nel suolo o nell intestino di alcuni animali Le infezioni nell uomo sono dovute a introduzione accidentale nei tessuti profondi dei clostridi o delle spore o dell assunzione con alimenti di tossine

7 Clostridium Tetani Gram + o gram variabile, manca del sistema dei citocromi e produce ATP, mediante reazioni di fosforilazione del substrato, fermentando zuccheri e aminoacidi. Poco virulento, con scarsa capacità di diffusione. Penetrazione di spore nei tessuti profondi C.tetani Penetrazione accidentale di spore nei tessuti Localizzazione del C. tetani nel luogo di penetrazione (non diffonde) Produzione della Tossina tetanica

8 Clostridium tetani Il tetano (tetanos = rigidità) è caratterizzato da spasmi muscolari (paralisi spastica) con concomitante paralisi flaccida (muscoli oculari). Compromissione della funzionalità muscolare a livello respiratorio (soffocamento dovuto al rigurgito del contenuto dello stomaco). Epistotono Riso sardonico

9 Clostridium tetani: la tossina Esotossina con grande affinità per il tessuto nervoso (membrane sinaptiche dei nervi motori a livello dei recettori specifici) Esotossina Legame - mediante i recettori- alle membrane sinaptiche delle terminazione dei nervi motori I recettori sono rappresentati da glicolipidi privi di fosforo e ricchi di acido sialico, in grado di fissare la tossina

10 150Kd Tossina tetanica Proteasi intrinseca H100Kd L50Kd È una potente NEUROTOSSINA Esiste 1 solo tipo antigenico Struttura: precursore 150 KDa attivazione mediante taglio proteolitico ad opera di proteasi rilasciate dal batterio insieme alla tossina Si lega ai gangliosidi delle cellule nervose (B) Porzione attiva (A): blocco sinapsi inibitorie È UN ENDOPEPTIDASI Zn DIPENDENTE che presenta come bersaglio di azione la SINAPTOBREVINA, una proteina coinvolta nella esocitosi delle vescicole sinaptiche Paralisi spastica Liberazione impulsi eccitatori (qualsiasi contrazione muscolare si accompagna alla contrazione della muscolatura antagonista)

11 Neuro trasmettitori inibitori Neurotrasmettitori eccitatori STIMOLAZIONE CONTINUA BLOCCATI: inibizione del rilascio di mediatori inibitori come delle sinapsi glicina e GABA inibitorie (dando Tale blocco da via libera agli impulsi eccitatori. luogo ad impulsi il blocco degli impulsi inibitori provoca una serie di spasmi generalizzati che interessano i m. estensori e flessori PARALISI SPASTICA Diffonde lungo i cilindrassi dei nervi motori e raggiunge il midollo spinale dove blocca la trasmissione a livello eccitatori (paralisi spastica)

12 Clostriudium tetani: Terapia siero anti-tetanico Prevenzione: vaccino Gli anziani sono il gruppo più a rischio perché molti sono privi della vaccinazione. Ci sono molte persone al di sopra dei 40 anni che non hanno mai ricevuto una serie primaria del vaccino. Per mantenerne l efficacia va comunque ripetuta ogni dieci anni Vaccinazione obbligatoria: 3, mese anni 100 persone ogni anno muoiono a causa del tetano (USA) La maggior parte dei casi si verificano nella prima infanzia (sotto i 5 anni di età) a causa della mancanza di una vaccinazione. Nei paesi in via di sviluppo (mancanza di vaccinazione) ogni anno muoiono 800,000 persone

13 Clostriudium botulinum Mortale nel 60% dei casi Intossicazione dovuta ad ingestione di cibi (carni non cotte: la tossina viene distrutta ad 80 C per 30 min.) contaminati e nei quali il batterio si moltiplica producendo tossina. Raramente nelle infezioni da ferite superficiali. Sono stati identificati otto sierotipi del microrganismo (A, B, C1, C2,D, E, F, G).I vari sierotipi hanno caratteristiche diverse di patogenicità per gli uomini e gli animali, ciascuno di essi elabora una tossina antigeneticamente distinta. Può trovarsi anche nell intestino di animali infettati attraverso soluzioni di continuo della mucosa orale dell animale a causa dell ingestione di foraggio contaminato

14 Clostriudium botulinum Gli alimenti epidemiologicamente più importanti sono le conserve alimentari artigianali, carni conservate non cotte Il batterio si moltiplica a livello intestinale e libera la tossina. Il micro-ambiente intestinale (basso potenziale di ossidoriduazione) permette il processo germinativo) Tossina: viene assorbita a livello intestinale (non è inattivata dagli enzimi proteolitici) e agendo a livello della giunzione neuromuscolare Impedisce la trasmissione dell impulso nervoso, con conseguente paralisi flaccida

15 Le neurotossine botuliniche (BoNT) sono i più potenti veleni noti e sono la causa di tutti i sintomi di una malattia neuroparalitica, nota come botulismo.

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17 B A Vescicole contenenti acetilcolina A Fibra muscolare La tossina impedisce il rilascio dell acetilcolina dalle vescicole Stimolazione muscolare BLOCCATA PARALISI FLACCIDA Morte per paralisi della muscolatura respiratoria

18 Clostriudium botulinum Morte improvvisa del neonato (a causa della peculiare popolazione batterica nei primi giorni dopo la nascita ) Negli Stati Uniti si osservano 110 casi di botulino per anno (dei quali il 25% sono dovuti ad ingestione di cibo, 72% sono infezioni del neonato e il rimanente sono dovute a ferite)

19 Clostriudium botulinum Sintomi: da 6 ore 2 settimane (in media ore) dopo l ingestione del cibo. Diplopia, difficoltà di linguaggio e di deglutizione, debolezza muscolare dalle spalle, al tronco fino agli arti inferiori. Paralisi respiratoria Le alterazioni a livello respiratorio e la successiva paralisi possono richiedere la necessità della terapia intensiva per settimane Se diagnosticata presto, i casi vengono trattati con anatossina in grado di bloccare la tossina circolante Possono essere usati anche degli emetici per l eliminazione meccanica del cibo. Ricerca della tossina nell alimento (inoculazione in topi) Terapia: sieroprofilassi

20 Clostridium perfrigens Gangrena gassosa Intossicazioni alimentari

21 Clostridium perfrigens Determina la gangrena gassosa (lesione traumatica) La zona circostante il focolaio di infezione appare edematosa e alla palpazione si avverte un crepitio dovuto all accumulo di gas (H 2 ) nel sottocutaneo. Tutte le ferite sono potenzialmente a rischio di contaminazione Essendo i clostridi poco virulenti la loro moltiplicazione è consentita solo da estese zone di necrosi.

22 Tossina alfa di C. perfrigens

23 Clostriudium perfrigens La malattia è caratterizzata da edema, necrosi, colliquazione e formazione di gas della parte infetta; si ha anche sovrapposizione di infezione da piogeni in grado di aumentare la gangrena. La necrosi può estendersi con tossicosi generale Coinvolgimento tessuto muscolare mio-necrosi anaerobica. Questa situazione è facilitata dalla contaminazione di terriccio contenente sali di calcio solubili (la tossina è una fosfolipasi C che necessita di Ca per il suo funzionamento). Identificazione anaerobiosi e identificazione biochimica.

24 Clinica della gangrena gassosa Incubazione Da tre ore ad alcune settimane Ferita con aspetto gangrenoso e crepitio per presenza di gas Tossiemia con febbre /38 C, tachicardia, sintomi gastrointestinali, emolisi massiva, insufficienza renale,delirio Coma, con successivo exitus del paziente

25 Clostridium perfrigens Intossicazioni alimentari Ingestione di cibi in cui sia presente la tossina (p.i. 8 a 24 ore, mediamente 12 ore) Sintomatologia: diarrea e vomito Alcuni stipiti di perfrigens sono in grado di elaborare una tossina enterotossica che si produce solo in condizioni in cui sia possibile la sporificazione. Questa tossina è infatti associata alla tunica sporale con caratteristica di super antigene.

26 Intossicazioni alimentari da C. perfrigens Ceppi enterotossici di C.perfrigens con tossina enterotossica associata alla tunica sporale Ingestione cibi contaminati (carni) dalle forme vegetative o dalle spore Sporulazione e localizzazione all intestino tenue e produzione tossina Aumento permeabilità capillari con diarrea, dolore e vomito

27 Clostridium difficile: colite pseudomembranosa In seguito ad intensi trattamenti antibiotici che modificano la popolazione batterica intestinale creando condizioni idonee alla moltiplicazione dei Clostridi Tossina A Rottura delle giunzioni inter-cellulari (epitelio mucoso) Distacco della membrana basale Eliminazione di liquidi nel lume intestinale Emorragie (diarrea muco-sanguinolenta)

28 Le Chlamydie

29 GENERALITA Le Chlamydie sono un gruppo di microorganismi, obbligatoriamente intracellulari,che hanno perso la capacità di produrre autonomamente l energia a loro necessaria,divenendo parassiti energetici delle cellule ospiti. La famiglia delle Chlamydiaceae comprende un genere, Chlamydia con tre specie di interesse medico C. psittaci C.pneumoniae C.trachomatis le prime due responsabili di infezioni polmonari, la terza responsabile del linfogranuloma venereo, del tracoma e di numerose infezioni a prevalente trasmissione sessuale.

30 Life cycle of C. trachomatis In un tipico ciclo cellulare sono riconoscibili due tipi cellulari: una cellula piccola e densa detta corpo elementare, la forma infettiva incapace di dividersi cheè resistente all essiccazione e rappresenta il mezzo di propagazione dell organismo, e una cellula più grande e meno densa, chiamata corpo reticolato, che si divide per scissione binaria ed è la forma vegetativa dell microrganismo. La trasmissione avviene per via aerea

31 Infezione da C.trachomatis C.trachomatis rappresenta la più frequente causa di infezioni sessualmente trasmesse nei paesi sviluppati con sequele gravi ed impegnative anche da un punto di vista socio-economico,soprattutto nella malattia infiammatoria pelvica,infertilità e gravidanza ectopica.e stato dimostrato inoltre che,come altre infezioni dell apparato genitale, può favorire la trasmissione sessuale del virus dell HIV. Per quanto detto,è necessario quindi disporre di opportuni mezzi di controllo e diagnosi.

32 Diagnosi e campioni biologici Per una diagnosi ottimale si deve avere a disposizione il test di riferimento ed il campione biologico più idoneo e prelevato nel modo corretto. Il test di riferimento è la coltura cellulare. I campioni biologici più idonei sono il secreto cervicale ed uretrale. L attuale utilizzo di test di amplificazione genica ed alcuni recenti test per la determinazione dell antigene,ha reso possibile l utilizzazione di campioni non invasivi,più facilmente accettati dai pazienti e altrettanto affidabili. Nell uomo utilizzando campioni di urina del primo getto si sono avuti buoni risultati con tutti i test. Più problematica è invece la diagnosi nella donna,dato che la localizzazione dell infezione può essere cervicale ed uretrale.

33 C. trachomatis Infezioni asintomatiche: Popolazione ad alto rischio: 70% di donne infette 50% di uomini infetti adolescenti sessualmente attive (<20 anni)

34 Concause associate all infezione da C. trachomatis Elevato numero di partner sessuali Nuovi partner sessuali Mancato uso di dispositivi contraccettivi Concomitante infezione gonococcica Uso di contraccettivi orali

35 Conseguenze cliniche dell infezione da C. trachomatis DONNE % Infezione cervicale ed uretrale 30 % Solo infezione cervicale 5-30 % Solo infezione uretrale Cerviciti Uretriti Endometriti Malattia infiammatoria pelvica (PID) Ascesso ghiandola del Bartolini Gravidanza extrauterina Salpingiti Sterilità UOMINI Uretriti Epididimiti Artrite Sindrome di Reiter: artrite,uretrite,congiuntivite,uveite,ulcere orali NEONATI Congiuntivite neonatale Polmoniti

36 Test diagnostici

37 1 - Esame colturale Crescita su cellule Mc Coy Non produce effetto citopatico Evidenziazione mediante uso di anticorpi monoclonali fluorescenti Sensibilità : % Specificità : 100 % Vantaggi: test di riferimento Svantaggi: Risposta tardiva (72 ore) Laboratorio attrezzato per colture cellulari Rispetto dei tempi di consegna trasporto dei campioni

38 2 - TEST PER LA DETERMINAZIONE DELL ANTIGENE 2A - Immunofluorescenza diretta (IFD) 2B - Test immunoenzimatici (EIA) 2C - Test rapidi (EIA)

39 2a - Immunofluorescenza diretta (IFD) Antigene : MOMP (Proteina maggiore presente sulla membrana esterna del batterio) Sensibilità : uomini % donne % Specificità : uomini87 99 % donne % Vantaggi: rapido eseguibile in tutti i laboratori verifica dell idoneità del campione Svantaggi: soggettivo diversi cutt-off applicabile per un basso numero di campioni Test diagnostici Perugia, 4 novembre 2002

40 2b - Test immunoenzimatici (EIA) Antigene : LPS (Lipopolisaccaride genere-specifico) più abbondante e solubile della MOMP Sensibilità : uomini65 95 % donne % Specificità : > 90 % Vantaggi: rapido Lettura oggettiva applicabile per un gran numero di campioni eseguibile in tutti i laboratori Svantaggi: falsi positivi

41 2c - Test rapidi LA TECNOLOGIA UTILIZZATA è QUELLA EIA Vantaggi: - possono essere eseguiti direttamente presso l ambulatorio medico - risposta disponibile in circa 30 minuti - nella stessa seduta, in caso di positività, viene data direttamente la terapia Svantaggi: - falsi positivi - non possono essere usati in popolazione a bassa prevalenza o in soggetti asintomatici

42 3 - TEST PER LA DETERMINAZIONE DELL ACIDO NUCLEICO 3A - Test di ibridizzazione 3B - Test di amplificazione genica

43 Sensibilità : 85 % Specificità : 98 % Rispetto all esame colturale Sensibilità : 77 93% Rispetto ai metodi di amplificazione genica Vantaggi: 3a - Test di ibridizzazione rapido Svantaggi: necessita di un test di conferma

44 3b - Test di amplificazione genica Sensibilità : altissima Specificità : > 99% Vantaggi: sensibilità specificità Svantaggi: laboratorio attrezzato per biologia molecolare falsi positivi falsi negativi per la presenza di inibitori

45 Conclusioni Tutta la più recente produzione scientifica indica nei test di amplificazione genica i metodi di scelta per la diagnosi di infezione da C.trachomatis negli uomini e nelle donne,nella popolazione a bassa ed alta prevalenza. L utilizzo di campioni diversi da quelli tradizionalmente saggiati (urine) permette di effettuare screening anche su gruppi di pazienti che altrimenti sarebbe difficile esaminare, con un analisi del rapporto costi-benefici a favore dello screening. L ostacolo all uso di questi test è rappresentato dal costo, anche se destinato a diminuire con l aumento dei prodotti commerciali a disposizione. Tuttavia,le urine possono costituire un campione difficile da gestire, la presenza di inibitori può compromettere il test.

Clostridium perfrigens

Clostridium perfrigens Clostridi Bacilli G+, mobili, raramente capsulati. producono spore con diametro maggiore di quello batterico Anaerobi obbligati, non hanno citocromi e catalasi, producono ATP fermentando zuccheri o aminoacidi.

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