ALTERAZIONI DELLA RIPOLARIZZAZIONE MIOCARDICA NEI PAZIENTI IN TERAPIA DIALITICA PERITONEALE.

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1 ALTERAZIONI DELLA RIPOLARIZZAZIONE MIOCARDICA NEI PAZIENTI IN TERAPIA DIALITICA PERITONEALE. INTRODUZIONE I pazienti affetti da insufficienza renale cronica terminale in terapia sostitutiva presentano un aumento del rischio globale cardiovascolare rispetto ai pazienti non nefropatici (1): è noto che il 20% dei pazienti sottoposti a terapia sostitutiva della funzione renale muore nel primo anno e di questi il 25% va incontro ad una morte improvvisa (2). D altra parte la persistenza nel periodo post trapianto renale di specifiche cause cardiovascolari di morte, come l infarto miocardico, nella stessa incidenza pretrapianto, depone per l importanza di fattori di rischio preesistenti, quali l ipertensione arteriosa, l ipertrofia ventricolare sinistra, la dislipidemia, l intolleranza glucidica, le alterazioni del metabolismo calciofosforico (3) e quelle che riguardano i geni che sono deputati alla sintesi dell angiotensin converting enzyme (ACE): a tal proposito è stata dimostrata l associazione tra polimorfismo I/D del genotipo dell ACE e la progressione sia delle nefropatie che delle cardiopatie siano esse ischemiche che ipertrofiche (4) e quindi tale genotipo risulta essere un fattore di rischio per lo sviluppo di danno d organo subclinico e di eventi cardiovascolari maggiori (5), (6). La morte cardiovascolare è sicuramente la prima causa di morte nei pazienti in terapia sostitutiva della funzione renale (7), (8), che possono presentare sindromi coronariche acute vista la grave aterosclerosi coronarica con estese calcificazioni cui sono soggetti (9), (10), (11) ed alterazioni del ritmo cardiaco nel 50-70% (12), (13), (14) che se particolarmente gravi rappresentano una causa di morte improvvisa (15), (16), che viene definita come un decesso inaspettato, non traumatico, non autoprovocato, che si verifica in un paziente con o senza una patologia preesistente, che muore entro le sei ore 1

2 dall insorgenza dell evento terminale. La morte improvvisa è la causa più frequente di morte nelle zone più sviluppate del mondo e più della metà di queste persone muore di morte istantanea che viene definita come un decesso improvviso ed inaspettato che avviene entro alcuni secondi o minuti in persone che erano intente nella loro normale attività immediatamente prima dell evento fatale. Le patologie che più frequentemente sono state associate alla comparsa di morte improvvisa sono la coronaropatia, la miocardiopatia dilatativa, la miocardiopatia ipertrofica, la valvulopatia aortica, il prolasso della valvola mitrale, le cardiopatie congenite cianogene, la sindrome da QT lungo, anomalie elettrofisiologiche cardiache strutturali che nella maggior parte dei casi determinano l insorgenza di una tachicardia o di una fibrillazione ventricolare per lo più scatenate da fenomeni di ischemia-riperfusione, ipossiemia, squilibri elettrolitici, aumento dell attività del sistema nervoso autonomo, farmaci ad azione cardiotossica: ne risulta una alterazione del battito cardiaco (17) che è la risultante di tre proprietà del muscolo cardiaco: automatismo, eccitabilità e conducibilità. L automatismo è la proprietà di generare e mantenere un impulso ritmico: è peculiare del muscolo cardiaco ed è indipendente da connessioni neurologiche (tanto che è presente anche nel cuore sottoposto a trapianto) anche se può essere modificato da stimoli umorali ed autonomici (sistema nervoso simpatico e parasimpatico che innervano riccamente il nodo seno atriale e quello atrioventricolare). Le strutture cardiache dotate di automatismo sono il nodo del seno localizzato all inserzione della vena cava superiore nell atrio destro e che è il principale segnapassi, il nodo atrioventricolare e le fibre specifiche che da questo si diffondono al ventricolo sistema di His-Purkinje-(segnapassi secondari o latenti). L eccitabilità è la capacità di rispondere ad uno stimolo inerente a cellule che hanno o no proprietà automatiche di segnapassi. La conducibilità è la proprietà delle fibre cardiache di propagare e diffondere il processo di eccitazione alla cellule vicine. L impulso cardiaco normale origina 2

3 dal nodo seno atriale attivando gli atri e tale attivazione determina all elettrocardiogramma di superficie la comparsa dell onda P. L impulso viene fisiologicamente ritardato nel nodo atrioventricolare per cui all elettrocardiogramma compare l intervallo PR, attraversa il fascio di His, le due branche ed il sistema di Purkinje per attivare poi il miocardio ventricolare. La corrente generata dall attivazione del miocardio ventricolare è responsabile del complesso QRS all elettrocardiogramma. Nelle cellule miocardiche il potenziale di transmembrana a riposo misurato con microelettrodi intracellulari, è negativo e l ampiezza della negatività dipende dal tipo di cellula: - 60 mv nelle cellule del nodo seno atriale, e 90 mv nelle fibre del Purkinje. La negatività intracellulare è potassio-dipendente, ed è il risultato di un efflusso di ioni potassio durante la fase 4, di riposo, del potenziale d azione transmembrana. L attivazione della cellula è associata ad un improvviso afflusso nella cellula di ioni sodio carichi positivamente che invertono la negatività intracellulare fino ad una carica positiva di circa mv (il cosidetto rimbalzo od overshoot). L improvvisa inversione della negatività intacellulare è la fase zero e l overshoot positivo è la fase uno del potenziale d azione transmembrana. Il risultato sull ECG delle fasi 0 ed 1 è il complesso QRS. Segue quindi la fase 2 che è caratterizzata da un voltaggio relativamente stabile. Le modificazioni nel voltaggio della fase 2 sono largamente dipendenti dai canali lenti per il calcio. Le cellule nella quali il potenziale dipendente dai canali lenti per il calcio ha un ruolo significativo nella genesi del potenziale d azione transmembrana comprendono quelle dei nodi seno atriale ed atrio ventricolare. La fase due del potenziale d azione transmembrana si riflette sull ECG con il tratto ST. La fase tre del potenziale d azione transmembrana, l onda T sull ECG, dipende da un efflusso di potassio, che reintegra l elettronegatività intracellulare. A questo punto del ciclo, la cellula ha un eccesso di sodio ed un deficit di potassio; il ritorno alla normale concentrazione ionica avviene durante la fase quattro, la 3

4 linea isoelettrica all ECG. Questo processo richiede un consumo di energia ed è svolto dalle pompe dipendenti dall adenosintrifosfatasi sodica, potassica, calcica. Nella cellula normale, il completo recupero della concentrazione ionica e della negatività intracellulare precede la successiva attivazione cardiaca. Il nodo seno atriale agisce come normale segnapassi primario (pacemaker). Durante la fase quattro, vi è un graduale afllusso di sodio nella cellula, o un diminuito efflusso di potassio, o entrambi i fenomeni, il che comporta una graduale diminuzione della elettronegatività in questa fase, nella quale, quando il potenziale d azione transmembrana si è ridotto al livello del potenziale soglia, si genera un potenziale d azione transmembrana. La perdita spontanea della negatività transmembrana durante la fase quattro di un potenziale d azione transmembrana definisce l automatismo (Fig 1). Normalmente la perdita graduale del potenziale in questa fase ossia l automatismo è tipica del pacemaker primario ossia del nodo del seno, mentre il resto del sistema di conduzione specifico ha la proprietà di automatismo latente. Raramente le fibre miocardiche sono dotate di automatismo e ciò accade solo in condizioni patologiche. Il potenziale d azione transmembrana generato automaticamente agisce come stimolo per le cellule vicine, che a loro volta stimolano cellule adiacenti, portando alla propagazione dell impulso. L attivazione delle cellule contigue da parte del potenziale d azione transmembrana, è causata da una riduzione del loro rispettivo potenziale di transmembrana a riposo fino al potenziale di soglia. La differenza di potenziale fra la fase quattro ed il potenziale di soglia definisce la eccitabilità: più ridotta è questa differenza più eccitabile sarà la cellula, poiché è necessario uno stimolo di minore intensità per ridurre il potenziale della fase quattro al livello della soglia. La velocità di conduzione non è necessariamente proporzionale alla eccitabilità: un aumento di questa, infatti, può portare ad una ridotta velocità di conduzione. Questo paradosso risulta dalla dipendenza della velocità di conduzione dall integrità 4

5 dello stimolo cioè il potenziale d azione transmembrana. L integrità del potenziale d azione transmembrana come stimolo dipende dall ampiezza dello stesso e dalla velocità di salita del voltaggio nella fase zero. Entrambi dipendono a loro volta dall ampiezza del voltaggio della fase quattro al momento della generazione del potenziale d azione transmemebrana, il cosidetto potenziale di partenza. In altre parole più negativo è il potenziale di partenza, migliore sarà il risultante potenziale d azione transmembrana e più rapida la conduzione; al contrario, un ridotto, o meno negativo potenziale di transmembrana al momento della attivazione, risulterà in una diminuita velocità di salita della fase zero ed in una minore ampiezza del potenziale d'azione transmembrana. Un potenziale d'azione transmembrana alterato può non riuscire a stimolare adeguatamente le cellule vicine e, come risultato, la conduzione può avvenire a velocità ridotta od essere bloccata. Le aritmie, quindi, compaiono o perché vi sono anomalie dell automatismo e della formazione dello stimolo, o perchè vi sono anomalie che riguardano la conduzione dello stimolo o perché entrambe le anomalie suddette sono presenti. Le modificazioni dell automatismo, quindi della frequenza e del ritmo cardiaco, sono in rapporto o all accentuazione (tachicardia) o riduzione (bradicardia) dell attività del segnapassi, oppure all accentuazione dell automatismo dei segnapassi latenti od ectopici che si manifestano con la comparsa di extrasistoli o di tachiaritmia. Le anomalie della conduzione comprendono il rallentamento ed il blocco della conduzione e sono dovute ad insufficienza dello stimolo ad eccitare le fibre lungo la via di conduzione, a ridotta eccitabilità delle fibre deputate a propagare l impulso e ad interruzione anatomica delle fibre di conduzione (18), (19), (20), (21) Nell ambito della insufficienza renale in fase predialitica e dialitica numerosi sono i fattori che realizzano, isolatamente o sinergicamente, una o più di queste condizioni aritmogene quali il sovraccarico pressorio negli ipertesi non dipper (22), la miocardioaptia ischemica, la cardiomiopatia ipertrofica, la disfunzione 5

6 ventricolare, la malattia pericardica, lo scompenso cardiaco, la neuropatia autonomica, squilibri elettrolitici, modificazioni dell'equilibrio acido-base con conseguenti modificazioni delle concentrazioni plasmatiche degli elettroliti stessi, squilibri ormonali e fattori iatrogeni. La morte aritmica, quindi, può essere dovuta sia ad aritmie su base ischemica (23) che a causa di QT lungo (aritmie da rientro da QT lungo). Il segmento QT (Fig 2) rappresenta il tratto elettrocardiografico compreso l onda Q e la fine dell onda T ed esprime la durata della ripolarizzazione ventricolare, che avviene tramite l attivazione dei canali ionici per il potassio: Lks che si attiva e disattiva lentamente e Lkr che sia attiva con estrema rapidità e prende il nome di HERG. Poiché la durata del tratto QT varia con la frequenza cardiaca, solitamente, attraverso la formula di Bazzett, la durata del QT viene rapportata alla durata del ciclo cardiaco (QT/ RR): ne deriva la misura del QT corretto o QTc che deve essere di 440 msec negli uomini e di 450 msec nelle donne. Un QT prolungato rappresenta un rischio aritmogenico tanto più grande tanto maggiore è l allungamento del QT stesso. Il rischio è di sviluppare delle aritmie ventricolari tipo torsione di punta, che sono potenzialmente letali, in quanto il rallentamento della ripolarizzazione rende possibile l insorgenza di un potenziale d azione precoce sostenuto dai canali lenti del calcio (24). Un altro parametro di aritmogenicità è la dispersione del QT sull ECG a dodici derivazioni. Per dispersione del QT si intende la differenza tra il QT più lungo e quello più breve misurato all' ECG di superficie (25). Questo è un indice di disomogeneità della ripolarizzazione ventricolare e della probabilità che all interno del miocardio si formino dei circuiti di micro o macrorientro che portano alla torsione di punta (26), predice la morte improvvisa nello scompenso cardiaco congestizio, nell infarto miocardico, nella cardiomiopatia ipertrofica e nella ipertrofia ventricolare sinistra (27), (28), condizioni nelle quali l ipertrofia dei miociti causa allungamento della durata del potenziale d azione, mentre l aumento della fibrosi interstiziale (29) si associa 6

7 alla riduzione di ampiezza del potenziale d azione e di membrana e quindi i farmaci che riducono l ipertrofia dei miociti e la fibrosi interstiziale come gli antiipertensivi e gli ace inibitori si comportano da antiaritmici pur non appartenendo a questa classe (30); inoltre entrano in gioco l aumentata sintesi di adrenalina e noradrenalina come compenso al deficit contrattile che sono in grado di scatenare aritmie sia direttamente sia attraverso i NEFA (acidi grassi non esterificati) (31). Le aritmie da rientro scatenate da alterazioni della durata del tratto QT, che possono anche essere congenite ed allora sono dovute ad anomalie nella conduttanza transmembrana al potassio legate ad anomalie del cromosoma sette (32), possono essere precipitate da fattori quali disionie gravi, coesistenza di comorbidità, assunzione di farmaci che allungano il QT, accumulo di farmaci, alterazioni farmacogenetiche a carico del gene CYP2D6 (slow metabolizers). Tra le comorbidità ricordiamo l amiloidosi ed il diabete mellito. L amiloidosi è una patologia determinata dalla deposizione negli organi bersaglio (soprattutto rene e cuore) di proteine insolubili, che al microscopio ottico a luce polarizzata danno vita ad una caratteristica birifrangenza verde, presentano una disposizione fibrillare alla microscopia elettronica, hanno affinità per il colorante rosso Congo (33), in quantità sufficienti ad alterarne la normale funzione. Distinguiamo una Amiloidosi Primaria (Amiloidosi tipo AL), nella quale le proteine anomale risultano costituite dalle catene leggere di immunoglobuline prodotte da un clone di plasmacellule (34), una Amiloidosi Familiare nella quale si ha la deposizione di proteine che derivano da diversi precursori tra cui i più importanti sono rappresentati da forme mutanti della transtiretina (prealbumina) (Amiloidosi tipo ATTR) (35). Esistono anche forme secondarie di amiloidosi (Amiloidosi AA) che per lo più sono dovute a processi flogistici cronici come quelli determinati dalle terapie sostitutive della funzione renale e che raramente interessano il cuore e che sono dovute alla deposizione di beta amiloide. Qualora, invece, si abbia la deposizione di fibrille negli spazi 7

8 interstiziali del miocardio, si verifica dapprima la perdita delle connessioni tra i miociti e quindi, con il progredire della malattia, la loro morte con conseguente comparsa di zone cardiache che presentano differenti condizioni di ripolarizzazione, condizione questa che predispone alla insorgenza di circuiti di rientro (36). Per quanto riguarda la patologia diabetica, è stata descritta nei pazienti che presentano un certo grado di neuropatia autonomica (37) una ridotta attività vagale che può portare ad un allungamento del tratto QT (38) ed all aumento del rischio di morte improvvisa (39), (40); una stretta correlazione, inoltre, emerge tra deficit di funzione nervosa autonomica e tassi elevati di escrezione urinaria di albumina nei giovani pazienti diabetici di tipo uno (41). Tuttavia l allungamento del QT può non solo derivare da una riduzione dell attività nervosa cardiaca parasimpatica, ma anche da alterazioni delle cellule miocardiche (42) che provocano una riduzione della stabilità elettrica predisponendo così alla comparsa delle aritmie e che sono dovute, per esempio, alla terapia con ace inibitori per la riduzione della proteinuria che possono provocare alterazioni elettrolitiche soprattutto se il paziente presenta una insufficienza renale, a sovraccarichi di volume e di pressione che aumentano lo stress della parete ventricolare. Inoltre è possibile che i pazienti affetti da diabete mellito possano andare incontro a gravi ipoglicemie ed in queste condizioni è possibile, soprattutto in occasioni di concentrazioni di glucosio molto basse, che il tratto QT si alteri (43) tanto da aumentare il rischio di morte da aritmia nei soggetti predisposti (44). I pazienti con alterata tolleranza al glucosio ed i pazienti diabetici tipo due con tratto QT allungato, hanno un rischio aumentato di morte improvvisa (45), causata da torsione di punta e da fibrillazione ventricolare (46). Inoltre è stato descritto un aumento dell attività simpatica durante il sonno nei pazienti diabetici di tipo due proteinurici (47) che può essere responsabile di alterazioni del tratto QT e determinare quindi un maggior rischio di morte improvvisa in questi soggetti. Nei pazienti diabetici, 8

9 tachiaritmie ventricolari fatali possono essere scatenate anche dall uso di ipoglicemizzanti orali quali le sulfaniluree che bloccano i canali del potassio adenosina trifosfato sensibili: ne risulta un allungamento della durata della ripolarizzazione e la comparsa di postdepolarizzazioni precoci (48), (49), (50). Alterazioni del ritmo cardiaco nei pazienti diabetici ed in quelli affetti da insufficienza renale cronica terminale da nefropatia diabetica o di altra natura (51), (52), possono anche essere dovuti al fatto che in tali patologie si ha la formazione di AGE (advanced glicated end products) che si originano dalla glicazione non enzimatica delle proteine circolanti e tessutali per cui si formano dei prodotti reversibili, le basi di Schiff, che vengono poi convertite in diverse famiglie di derivati di Amadori e quindi riarrangiati in AGE (53); nel paziente uremico gli AGE si formano anche in seguito a reazioni di lipoossidazione ed alla modificazione carbonilica delle proteine (54), (55), (56) ed il loro accumulo è dovuto alla ridotta filtrazione glomerulare in quanto il rene elimina gli AGE attraverso l apparato endolisosomiale dei tubuli prossimali (57). Tali sostanze risultano essere coinvolti nel processo di aterogenesi in quanto è stata dimostrata la loro presenza nelle placche aterosclerotiche (58) ed a livello endoteliale sono in grado di alterare i meccanismi che sono deputati a regolare l interazione tra cellule circolanti e letto vascolare in seguito all interazione con specifici recettori (RAGE) (59), per cui si ha la formazione di diacilglicerolo che attiva la proteinkinasi C delta (60) che si porta dal citosol in corrispondenza della membrana cellulare dove determina la fosforilazione di un enzima (61) che fa sì che una proteina di membrana, la fosfaditilserina, si porti dall interno (62) all esterno della stessa diventando così substrato per processi di coagulazione (63) e trombosi in seguito all attivazione del fattore V che determina a sua volta l attivazione calcio dipendente del fattore X che consente la formazione di trombina (64); in seguito poi al legame con le cellule endoteliali gli AGE determinano la comparsa di molecole di adesione (VACM-1) e quindi 9

10 l attrazione dei monociti sulla parete vascolare (65). Dal legame poi con monociti e macrofagi si ha la formazione di radicali liberi dell ossigeno (66) e quindi gli AGE sono in grado, in seguito alla stimolazione della chemiotassi dei monociti, alla liberazione di citochine pro flogogene dai macrofagi, alla formazione di radicali liberi dell ossigeno, alla proliferazione delle cellule miscolari lisce della parete vascolare ed alla aggregazione piastrinica (67), di favorire ed accelerare i processi di aterosclerosi. Tra le disionie responsabili di alterazioni del tratto QT ricordiamo l ipokaliemia che può determinare la comparsa di extrasistolia ventricolare politopa, tachicardia parossistica atriale e ritmo giunzionale in quanto determina un accentuato automatismo del segnapassi primario e di quelli latenti ed una riduzione della conducibilità dello stimolo (68), (69), (70), (71), l iperkaliemia che, determinando una riduzione della depolarizzazione diastolica per diminuito gradiente transmembrana di potassio, provoca una disfunzione nell attività del segnapassi ed una alterazione della conducibilità cardiaca (72), (73), (74), l ipomagnesemia in quanto il magnesio favorisce la interazione actina-miosina, la ricaptazione di calcio da parte del reticolo sarcoplasmico e regola i canali del calcio (75), (76), (77), (78), (79), (80), (81), (82), e la iper (83) o la ipocalcemia (84), (85), (86). Le alterazioni della calcemia sono frequenti nel paziente nefopatico in quanto la funzione renale, il metabolismo osseo e l omeostasi minerale (bilancio calciofosforo) sono strettamenti correlati grazie all intervento di paratormone (PTH), vitamina D e fosfatonine. Il calcio ed il fosforo sono i costituenti principali dell osso ove sono presenti sotto forma di cristalli di idrossiapatite. Il calcio è il catione principale dell organismo ove assomma a circa un chilogrammo di cui il 98% si ritrova nelle ossa; nel plasma è presente per circa l 1% e di questo il 50% risulta essere legato alle proteine plasmatiche, mentre per il 45% è presente sotto forma di calcio ionizzato e per la parte restante (5%) è legata ai citrati; il calcio extra ed intracellulare è all incirca l 1%. Del calcio introdotto con la dieta 10

11 (all incirca mg), il 50% viene assorbito nell intestino, mentre l altro 50% si ritrova si ritrova nelle feci insieme alla quota secreta. L assorbimento del calcio a livello intestinale avviene attivamente, grazie all intervento della vitamina D, e passivamente e nel duodeno operano entrambi questi meccanismi, mentre nel digiuno e nell ileo opera soprattutto il meccanismo passivo, mentre quello attivo lo ritroviamo soprattutto nell intestino cieco. Per quanto riguarda l estrusione del calcio, anch essa è regolata dalla vitamina D, avviene nella parte basolaterale della membrana grazie all intervento di una adenosintrifosfatasi che opera un trasporto attivo in parte in scambio con il sodio. Solo il calcio ionizzato può filtare a livello renale e per il 99% viene riassorbito attivamente nel tubulo contorto prossimale, nell ansa di Henle e nel tubulo contorto distale ove però il processo è limitato da un meccanismo di traporto massimo regolato dal PTH; da tutto ciò se ne deduce che la calciuria sarà uguale alla quota netta assorbita. Per quanto riguarda il fosforo, la sua quantità nell organismo è di circa seicento grammi, di cui l 85% si trova nelle ossa sotto forma di fosfato inorganico; in forma inorganica è presente anche nel plasma come H2P04- ed HP04--, mentre in forma organica si ritrova nelle cellule ove è esterificato, legato ai lipidi di membrana, e nelle molecole di ATP. Del fosforo introdotto con la dieta (all incirca mg), i 2/3 vengono assorbiti nell intestino grazie all azione di vitamina D e paratormone. A livello renale, il fosforo filtra liberamente e viene assorbito per il 90% nel tubulo contorto prossimale grazie a meccanismi limitati da un trasporto massimo ed a questo livello il paratormone agisce inibendo il riassorbimento, mentre il tubulo contorto distale funge da tampone per gli ioni idrogeno. La vitamina D è un ormone steroideo, origina per effetto della luce ultravioletta sulla cute sul 7-deidrocolesterolo o Provitamina D3, anche se può essere assorbita come tale nell intestino in quanto è presente nei cibi e due sono le fonti dietetiche principali: la vitamina D2 o ergocalciferolo di origine vegetale e la vitamina D3 o colecalciferolo di origine animale e quindi 11

12 le ritroviamo nell olio di pesce, tuorlo d uovo, fegato, soia. La vitamina D3 viene trasportata al fegato dalla vitamin D binding protein ed in questa sede viene convertita a 25(0H)D3 dall enzima microsomiale e mitocondriale vitamina D3-25-idrossilasi. Il 25(0H)D3 viene trasportato dalla vitamin D Binding Protein al tubulo prossimale del rene, dove viene convertito a 1,25(0H)2D3 (calcitriolo) dall enzima 1 alfa-idrossilasi (87); la sintesi di calcitriolo avviene però anche in altri tessuti (88), (89). In alternativa il 25(0H)D3 può essere convertito a 24R,25(0H)2D3, un metabolita relativamente inattivo grazie all intervento dell enzima 24-idrossilasi. L enzima 1 alfa-idrossilasi viene stimolato od inibito da variazioni dei livelli di PTH, calcio, fosforo, calcitriolo e suoi metaboliti così come l enzima 24-idrossilasi. L 1-25-(0H)2D3 viene trasportato alle cellule target legato alla vitamin D binding protein, entra nella cellula in forma libera ed interagisce con il suo recettore VDR (Vitamin D receptor) presente nel nucleo, si forma un eterodimero con un fattore accessorio (RXR retinoid X receptor) che interagisce con un Vitamin D responsive element (VDRE) che promuove od inibisce la trascrizione di mrna di proteine regolate da 1,25(0H)2D3 come le Calcium binding protein, l enzima 25(0H)2D3-24 idrossilasi, il paratormone, l osteocalcina, la fosfatasi alcalina e l osteopontina e quindi le cellule target risultano essere quelle epiteliali dell intestino, le paratiroidee, quelle ossee e le cellule tubulari distali del rene. E da tener presente che recettori per la vitamina D sono localizzati non solo negli organi bersaglio che intervengono nel metabolismo minerale, ma anche in altri tessuti quali quello immunitario (90), (91), mieloide (92), (93), (94), cuore (95), muscolo scheletrico (96), cervello e sistema nervoso (97), (98), (99) e questo spiega gli effetti pleiotropici della vitamina D che consistono in una up regulation del RANKL (ligando del recettore attivatore del fattore nucleare k-b), in una down regulation della OPG (osteoprotegerina), nel modulare la risposta immune andando ad agire sui linfociti helper, nell interagire con il sistema 12

13 renina angiotensina, nel regolare l attività del sistema nervoso e di quello muscolare e nell intervenire sulla crescita e sull apoptosi cellulare e sulla differenziazione dei cheratinociti (100), (101), (102), (103). Esistono inoltre delle evidenze che il calcitriolo determini degli effetti che non presuppongono una azione sul genoma, grazie alla interazione con un recettore di superficie distinto dal VDR nucleare (100). Nei tessuti target le molecole di 1,25(0H)2D3 vengono poi idrossilate e trasformate in acido calcitrioico, un metabolita inerte ed idrosolubile. Gli effeti biologici della 1,25(0H)2D3 sono quindi quelli di aumentare l assorbimento intestinale di calcio e fosforo, di aumentare il riassorbimento osseo, ed infine di consentire una normale mineralizzazione ossea in quanto provvede a fornire adeguati livelli di calcio e fosforo a livello del fronte di mineralizzazione. Il paratormone viene prodotto nelle cellule paratiroidee e dapprima si ha la formazione di una molecola proteica di 115 aminoacidi detta pre-pro paratormone che viene trasportata nel reticolo endoplasmatico rugoso e trasformata in una molecola di 90 aminoacidi detta pro-paratormone. Il paratormone finale, costituito da 84 aminoacidi, viene immagazzinato in granuli secretori citoplasmatici, da cui al bisogno viene immesso in circolo. Il Paratormone viene catabolizzato dalle cellule del Kupfer nel fegato e dalle cellule tubulari renali. La secrezione del paratormone avviene dopo pochi secondi in seguito ad ipocalcemia, mentre alcune ore ed alcuni giorni sono necessari rispettivamente perché si abbia la trascrizione del gene che determina la formazione del paratormone e la replicazione delle cellule paratoridee in seguito alla riduzione del calcitriolo e ad aumento dell fosforo (Fig 3),(104). La trascrizione del gene che codifica per il paratormone viene stimolata dalla ipocalcemia e presuppone la presenza del Calcium Sensing Receptor (105) (Fig 4) che appartiene ad una famiglia di recettori accoppiati a proteine G, che sono caratterizati da un ampio dominio extracellulare che comprende circa 700 aminoacidi, 7 domini transmembrana, coda citoplasmatica 13

14 carbossiterminale comprendente 200 aminoacidi (105), (106), dalla ritenzione di fosforo, dalla carenza di calcitriolo, dai glucocorticoidi e dagli estrogeni, mentre viene inibita dal calcitriolo che agisce legandosi ad un Vitamin D Receptor (107), (108) che si trova all interno del nucleo e che media l inibizione della trascrizione genica del PTH nel momento in cui viene attivato da una quantità adeguata di calcitriolo, dalla calcitonina e dalla ipercalcemia che può anche stimolare la degradazione intracellulare del paratormone. Quando si hanno variazioni della calcemia, entra in azione il calcium sensing receptor che si attiva in condizioni di ipercalcemia in seguito alla interazione degli ioni calcio con il dominio extracellulare del recettore che va incontro ad un cambiamento della sua conformazione. La proteina G mette in azione la fosfatidil inositolofosfolipasi C la quale a sua volta provoca l attivazione della protein chinasi C che dà inizio alla trasduzione del segnale a cascata tipico della mitogenactivated protein chinasi che a sua volta determina la fosforilazione della fosfolipasi A2 con conseguente rilascio di acido arachidonico che viene successivamente trasformato in leucotrieni biologicamente attivi che inibiscono la secrezione del paratormone (109), (110), (111). Quando i livelli extracellulari di calcio sono bassi il calcium sensing receptor non viene stimolato e quindi la sintesi e la secrezione del paratormone non vengono inibite, i livelli plasmatici di patatormone iniziano a salire (109). In condizioni di calcemia nella norma, il calcium sensign receptor viene attivato solo parzialmente ed agisce da freno sulla sintesi del paratormone (112). La secrezione del paratormone, quindi, viene regolata principalmente dalla calcemia, con una relazione sigmoidale inversa molto ripida tra livelli di paratormone e calcio sia in vivo che in vitro e che determina variazioni molto ampie del paratormone per piccole alterazioni della calcemia e consente di mantenere il livello plasmatico di calcio sostanzialmente costante e la curva (Fig 5) (113) viene definita da quattro parametri che sono la secrezione massima di PTH (A), inclinazione della curva 14

15 al set point che indica la concentrazione di calcio che determina la inibizione del 50% della secrezione massima (B), set-point (C) e secrezione minima di PTH (D). Le azioni del PTH si esplicano sul tessuto osseo, a livello renale ed intestinale. A livello osseo il PTH attiva gli osteoblasti che a loro volta stimolano gli osteoclasti tramite la secrezione di attivatori ed il risultato netto, quando si hanno livelli costantemente elevati di PTH che determinano un aumento del rimaneggiamento osseo con attivazione di tutte le cellule ossia osteoblasti, osteociti ed osteoclasti, è l aumento del riassorbimento osseo in quanto prevale l azione degli osteoclasti (114). A livello renale il PTH aumenta il riassorbimento tubulare distale del calcio e quindi riduce l escrezione del calcio, inibisce il riassorbimento del fosforo nel tubulo contorto prossimale e quindi ha una azione fosfaturica, aumenta l attività della 1 alfa idrosilasi renale e quindi la sintesi di 1,25(0H)2D3 e riduce il riassorbimento tubulare di bicarbonati e quindi contribuisce allo sviluppo di una acidosi metabolica. A livello intestinale aumenta l assorbimento del fosforo, per cui gli effetti globali del PTH consistono nel determinare una aumento della calcemia in quanto stimola il riassorbimento osseo, aumenta il riassorbimento tubulare distale del calcio ed aumenta la sintesi dell 1,25(0H)2D3, riduce la fosfatemia in quanto la inibizione del riassorbimento del fosforo nel tubulo contorto prossimale prevale sull aumento del suo riassorbimento a livello intestinale (115). Un ruolo fondamentale nel metabolismo calcio-fosforo lo svolge il tessuto osseo che presenta una parte esterna la c.d. corticale ed una interna (trabecolare) e che risulta essere costituito da idrossiapatite, da matrice che consiste di collageno ed osteocalcina, da cellule che sono gli osteoblasti, gli osteociti e gli osteoclasti e da acqua. Gli osteoblasti sono cellule di origine mesenchimale, sintetizzano la matrice, sono provvisti di fosfatasi alcalina, presentano recettori per il calcitriolo, il PTH, gli estrogeni ed attivano gli osteoclasti e quando cessano di sintetizzare la matrice, vi rimangono intrappolati e si trasformano in osteociti. 15

16 Gli osteoblasti derivano dalle Colony Forming Unit, riassorbono tessuto osseo dopo essere state reclutate da IL1, IL6, IL 11, TNF alfa e prostaglandine, mentre vi sono sostanze come l interferon gamma, il TGF β e l interleukina 4 che riducono il riassorbimento osseo. L osso viene costantemente rimodellato grazie a meccanismi che restringono gli osteoblasti di superficie per cui si scoprono zone di osso che vengono riassorbite dagli osteoclasti che richiamano in loco anche monociti che fanno opera di pulizia ed osteoblasti che riempiono le cavità scavate dagli osteoclasti. L attività del tessuto osseo è regolata da meccanismi locali e sistemici. I primi sono rappresentati dalle Bone morphogenetict Proteins, IGFs (Insulin like growth factor), TGFβ, IL 1, IL 6, TNF, sistema OPG/RANK. I meccanismi sistemici son rappresentati dal PTH, vitamina D, Calcitonia, Insulina, Estrogeni, Androgeni, Glicocrticoidi, ormoni tiroidei, ormone della crescita, FGF (Fibroblast Growth Factor) 23. Le bone morphogenetic proteins sono prodotte nell osso e nel midollo osseo e consentono la formazione di Cbfa1(Core binding Factor) un fattore di trascrizione genica che stimola la formazione di osteoblasti nel midollo osseo e quindi la formazione di osso. IGFs sono prodotte dagli osteoblasti in risposta al PTH, estrogeni ed alla BMPs (Bone morphogenetic Proteins) e stimolano la formazione di matrice ossea. Il TGFβ viene rilasciato durante il riassorbimento osteoclastico e stimola la funzione degli osteoblasti. L interleukina 1, 6, il TNF reclutano gli osteoclasti e vengono prodotte dagli osteoblasti. L OPG (osteoprotegerina) ed il RANK regolano la funzione degli osteoclasti. Il RANK (recettore attivatore del fattore nucleare K- b) è localizzato sulle cellule proosteoclastiche e quando viene attivato dal RANKL (ligando del recettore attivatore del fattore nucleare K-b), i proosteoclasti si trasformano in osteoclasti. Il RANKL è secreto da cellule della linea ossea sotto l influenza di IL1, calcitriolo, PTH e dai precursori degli osteoblasti. L OPG è prodotta dagli osteoblasti, lega il RANKL, e quindi riduce la formazione degli osteoclasti. Il sistema OPG/RANK/RANKL è strettamente 16

17 regolato da PTH, vitamina D, estrogeni e glicorticoidi. Per quanto riguarda i regolatori sistemici, la calcitonina è prodotta dalle cellule C della tiroide in seguito all aumento della calcemia e quindi inibisce gli osteoclasti e riduce l assorbimento di calcio nell intestino e nel rene. La vitamina D aumenta la formazione degli ostoclasti. L insulina stimola la formazione della matrice. Gli androgeni e gli Estrogeni regolano sia la formazione che il riassorbimento osseo. I glicocorticoidi riducono il riassorbimento di calcio intestinale, stimolano il riassorbimento osseo e l escrezione renale di calcio. Gli ormoni tiroidei stimolano il riassorbimento osseo. L ormone della crescita agisce stimolando l IGFs (114). Il Fibroblast Growth Factor 23 ha una azione fosfaturizzante, inibisce l alfa 1 idrossilasi renale e stimola la formazione del paratormone ed è prodotto dagli osteociti che producono anche Sclerostina un inibitore della formazione dell osso in quanto inibisce le bone morphogenetic proteins, la Endopepetidasi fosfato regolante che è una metalloproteinasi che regola l azione dell FGF 23, la Dentin Matrix Protein Protein 1 che induce la mineralizzazione della matrice, la Matrix Extracellular Fosphoglicoprotein che inibisce la mineralizzazione della matrice. Tutti questi elementi suggeriscono che gli osteociti regolano la formazione ossea regolando la fosfaturia. Il FGF 23 ha come organi bersaglio il rene ove si lega al suo recettore Klotho per cui viene ad essere inibito l uptake di fosforo sodio dipendente e la attività della alfa 1 idrossilasi per cui inibire la formazione dell osso significa che questo non riesce più a tamponare il fosforo e richiede maggiore produzione di FGF 23, mentre una accelarata formazione di tessuto osseo richiederà una minore produzione di FGF 23 e quindi ne risulterà ritenzione renale di fosfati. A livello paratiroideo, il legame con il recettore Klotho determina una maggiore formazione di paratormone (116), (Fig 6). Il fattore Klotho (117) viene prodotto da un gene che determina la formazione di due proteine, una legata alle membrane ed una circolante e mutazioni che interessano questo gene determinano la comparsa di 17

18 una sindrome che ricorda quella dei pazienti sottoposti a terapia sostitutiva della funzione renale e numerosi sono i fattori che regolano l espressione del klotho. Riducono l espressione del Klotho a livello renale l età, una dieta ricca di fosfati, insufficienza renale cronica, terapia con estrogeni, lo stress ossidativo, fenomeni di ischemia riperfusione, la nefrectomia, il carcinoma renale, l angiotensina II, mentre a livello cardiaco, polmonare ed epatico è l età a ridurre l espressione del Klotho. Aumentano l espressione del Klotho a livello renale una dieta povera di fosfati, la presenza di ipercalcemia, iperfosforemia, la vitamina D, le statine, mentre a livello del tessuto adiposo sono i PPAR gamma ad incrementare l espressione del Klotho (Fig 7). Le proteine Klotho interagiscono con il FGF 23 e le ritroviamo nel tubulo contorto distale in corrispondenza dei canali per il calcio (Transient Receptor Potential Vanilloid 5) sotto il controllo della vitamina D e nell intestino (Transient Receptor Potential Vanilloid 6 (118). Quando la fosforemia si riduce per una riduzione dell intake alimentare, si riduce la secrezione di paratormone, si riduce la produzione di FGF 23 che prova una riduzione degli scambiatori sodio-fosforo a livello renale (NPT 2a e 2c) e quindi si riduce la fosfaturia, aumenta la produzione di 1 alfa idrossilasi renale che aumenta l attività dello scambiatore sodio-fosforo (NPT2b) a livello intestinale. Quando la fosfatemia aumenta, aumenta la sintesi di Klotho che si lega all FGF 23 e quindi si ha una azione ipofosfatemizzante. A livello osseo il Klotho stimola il riassorbimento osseo ed il rilascio di fosfati andando ad agire sul transient receptor Potential Vanilloid 5 che è un modulatore degli osteoclasti (Fig 8). Una ridotta introduzione di calcio (Fig 9) provoca ipocalcemia, un aumento della secrezione del paratormone che provoca un aumento del riassorbimento renale di calcio, un aumento della produzione di vitamina D e mobilizzazione di calcio dalle ossa in seguito alla comparsa di fenomeni di rimodellamento. La produzione renale di Klotho aumenta in modo da stimolare il Transient Receptor Potential Vanilloid 5 che aumenta il 18

19 riassorbimento di calcio a livello renale ed osseo. Inoltre a livello intestinale stimola il Transient Receptor Potential Vanilloid 6 che aumenta il riassorbimento del calcio (119) (Fig 10). Quando la funzione renale comincia a declinare, si riducono l attività della alfa 1 idrossilasi renale e la eliminazione renale dei fosfati (120) che provocano ipocalcemia a causa della carenza di vitamina D che determina un ridotto assorbimento di calcio a livello intestinale e poi perché la iperfosforemia impedisce il rilascio di calcio da parte del tessuto osseo (121). La ipocalcemia determina un aumento della sintesi e della secrezione del PTH a cui contribuiscono anche la iperfosforemia che riduce la sintesi di calcitriolo (122), (123) il quale non riesce ad esercitare il suo effetto inibitorio sulle cellule paratiroidee a causa della insufficiente stimolazione dei recettori VDR. E da ricordare, inoltre, che la sintesi e la secrezione di paratormone nonché la proliferazione delle cellule paratiroidee vengono prodotte anche direttamente dall iperfosforemia (124), (125), (126), (127). Nei primi stadi dell insufficienza renale, quindi, l aumento del PTH (128) stimola il rene ad incrementare la eliminazione del fosforo ed a riassorbire calcio, stimola la sintesi di calcitriolo che consente di aumentare l assorbimento di calcio a livello intestinale e permette la mobilizzazione del calcio dai depositi ossei. Nonostante tali effetti, però, non si riescono a mantenere i livelli di calcemia, fosforemia e calcitriolo nella norma per cui lo stimolo alla secrezione di PTH continua e compare la resistenza scheletrica all azione del PTH, ossia sono necessari concentrazioni via via più elevate di PTH per mobilizzare calcio e fosforo dal tessuto osseo e nella quale entrano anche in giuoco per il suo determinismo la iperfosfatemia, la presenza di bassi livelli di calcitriolo, la presenze di tossine uremiche, l acidosi tipica della insufficienza renale per incapacità di eliminare valenze acide, una riduzione della sensibilità del recettore per il PTH determinata dai suoi eccessivi livelli, decremento dell espressione di mrna per PTH/PTHrp recettore (129), (130), (131), (132), 19

20 (133), (134), (135), (136), (137). La perdita della funzionalità renale congiuntamente alla resistenza scheletrica alle azioni del PTH, contribuisce a peggiorare la condizione di ipocalcemia in modo tale che diventano necessari livelli estremamenti elevati di PTH per mantenere la calcemia nella norma e quindi dapprima nelle paratiroidi aumenta la percentuale delle cellule secernenti PTH e poi il numero totale di cellule con la conseguente comparsa di una iperplasia diffusa. In tali condizioni, la crescita cellulare è di tipo policlonale e si accompagna ad una down regulation dell espressione dei recettori per il calcio e la vitamina D (138). In condizioni di nefropatia terminale, l iperplasia delle ghiandole paratiroidee evolve ulteriormente ed in queste condizioni la crescita cellulare diventa di tipo monoclonale per cui compare una iperplasia nodulare (139), (140) e si apprezza una significativa riduzione della espressione dei recettori per il calcio (141) ( Fig 11 ), (142), (Fig 12) e la vitamina D (142), (143) e quindi le ghiandole paratiroidi saranno meno sensibili alle variazioni della calcemia (144), (145). In queste condizioni il calcio e la vitamina D non riescono a controllare la secrezione di PTH che viene sintetizzato in grande quantità per cui si verifica il rilascio di ingenti quote di calcio e fosforo dalle riserve accumulate a livello del tessuto osseo nonostane la resistenza scheletrica all azione del PTH con conseguente comparsa di ipercalcemia ed iperfosforemia che (145) causano una ulteriore stimolazione delle ghiandole paratiroidi: si è determinato un circolo vizioso che tende ad amplificare la secrezione del PTH e le elevate concentrazioni sieriche di minerali espongono i pazienti ad osteodistrofia renale, calcificazioni vascolari e dei tessuti molli e quindi ad un aumento del rischio di morbilità e mortalità. L osteodistrofia renale si presenta tipicamente in tre forme: ad elevato turnover osseo (osteite fibroso cistica), a basso turnover (adinamic bone disease ed osteomalacia), forme miste. L ostetite fibrosocistica è dovuta a tutte quelle cause di iperparatiroidismo e quindi a riduzione della massa nefronica, ritenzione di fosfati, riduzione della sintesi di 20

21 calcitriolo, anomala crescita e funzione delle paratiroidi, resistenza scheletrica all azione del paratormone, ipocalcemia; all esame istologico osseo si apprezzano un aumento del riassorbimento e della formazione di osso. Ampie aree della superficie trabecolare sono occupate da cavità contenenti osteoclasti in fase di riassorbimento attivo (lacune di Howship); lungo la superficie trabecolare si trovano anche numerosi osteoblasti in fase di attiva deposizione di matrice ossea (osteoide). L osteoide può non venire mineralizzata alla stessa velocità con la quale viene deposta e quindi ne risulta un aumento del suo volume. Tipica la presenza nell osteoide di fibre collagene disposte irregolarmente od intrecciate (woven) invece che in modo lamellare. La disorganizzazione della struttura del collagene fa sì che l osso diventi meno resistente allo stress fisico e la mineralizzazione di ampie zone di osteoide woven determina la comparsa di osteosclerosi. L ipersecrezione di PTH determina anche la deposizione di connettivo midollare in sede peritrabecolare con riduzione del tressuto ematopoietico (146), (147), (148). L adinamic bone disease è dovuta ad una riduzione del numero degli osteoblasti determinata dalle tossine uremiche e da citochine che intereferiscono con lo sviluppo osseo, viene favorita da fattori quali l età avanzata, il diabete, la terapia sostitutiva della funzione renale, la terapia con vitamina D, somministrazione di sali di calcio con conseguente riduzione della sintesi di paratormone. All esame istologico si apprezza uno spessore osteoide ancora normale. L osteoide è sottile e non presenta osteoblasti attivi, rari sono gli osteoclasti ed inoltre si nota l assenza di fenomeni di rimodellamento (149), (150). L osteomalacia negli anni passati era dovuta alla deposizione di alluminio nel fronte di mineralizzazione, alluminio contenuto nei farmaci utilizzati per chelare il fosforo presente negli alimenti e nel bagno di dialisi. Oggi la causa più frequente è la carenza di vitamina D, l acidosi metabolica, l accumulo di stronzio contenuto nel liquido di dialisi nell osso. All esame istologico si apprezzano un aumento dello spessore e della 21

22 superficie dell osteoide ed un ridotto turn over osseo. I bordi osteoidi sono ampi ed il numero delle lamelle della matrice ossea è minore di cinque. Gli osteoblasti e gli osteoclasi sono rari (151). Le forme miste presentano aspetti caratteristici di entrambe le forme precedenti e quindi vi sarà la presenza contemporanea sia dei segni dell osteite fibrosa (compresa la fibrosi peritrabecolare) che l aumento dell osteoide (come nella osteomalacia). Le trabecole, quindi, presentano una superficie coperta da ampie aree di osteoide con spessore aumentato, vicine ad aree con gli aspetti tipici dell osteite fibrosa (151). Le calcificazioni vascolari sono caratterizzate non solo deposizione passiva di calcio e fosforo sui vasi, ma anche da una una trasformazione attiva delle parete vascolari in strutture osse, processo questo, regolato da geni che regolano l attività degli osteoblasti (152) ed esistono evidenze che indicano come il fosforo vi svolga un ruolo fondamentale. Gli studi di Kuro et al (153) hanno evidenziato come topi con normale funzione renale e nei quali erano presenti mutazioni del gene Klotho, andassero incontro ad un aumento della fosfatemia e quindi ad un incremento del prodotto calcio-fosforo ed alla comparsa di calcificazioni vascolari e ad osteoporosi, mentre quelli effettuati da Jono (154) e Giachelli (155) hanno dimostrato come elevati livelli di fosforo inducessero la calcificazione delle cellule muscolari lisce della tonaca media dell aorta e come fosse predominante nella matrice extracellulare la deposizione di minerali contenenti fosforo (154). Queste evidenze testimoniano come elevati livelli di fosforo determinino direttamente la calcificazione delle cellule muscolari lisce della tonaca media dell aorta in seguito all attivazione del cotrasportatore sodio fosforo Pit-1 e del Core binding Factor-1 (154). Il Cbfa-1 è un fattore di trascrizione che regola la espressione di osteocalcina e quindi l attività degli osteoblasti (156). Un altra proteina entra in gioco nel processo di calcificazione delle cellule muscolari lisce dei vasi e cioè la osteopontina. Wada (157) ha dimostrato come in vitro tale proteina agisca come inibitore della calcificazione, mentre Jono (158) ha 22

23 evidenziato come la fosforilazione della osteopontina sia fondamentale per inibire la calcificazione delle cellule muscoalri lisce dei vasi e quindi tale proteina è al tempo stesso un modulatore della mineralizzazione ossea ed un inibitore dei processi di calcificazione vascolare. Giachelli (159) ha analizzato il ruolo del fosfato e della osteopontina nei processi di calcificazione vascolare dimostrando come il fosfato induca direttamente la calcificazione delle cellule muscolari lisce della tonaca dei vasi, mentre la osteopontina, stimolando il riassorbimento osseo, inibisce la deposizione di fosfato di calcio e questo è stato assodato anche in studi nei quali topi privi di osteopontina vanno incontro a calcificazione vascolare quando esposti ad elevate concentrazione di fosfato (160). Esistono, però, anche delle proteine che sono in grado di inibire il processo di calcificazione vascolare quali la Bone morphogentic protein, la fetuina A e la Matrix GLA glicoproteina. La bone morphogentic Protein-7 è fondamentale per lo sviluppo di rene, occhio e tessuto osseo (161) e tipicamente i suoi livelli si riducono precocemente quando il paziente vede ridotta la sua funzione renale (162). La carenza di Bone morphogenetic protein determina delle conseguenze assai importanti per ciò che riguarda la patogenesi e la terapia della insufficienza renale cronica (163), ma è ancora più interessante per ciò che riguarda la patogenesi ed il trattamento delle calcificazioni vascolari in quanto tale proteina mantiene la differenziazione delle cellule muscolari lisce della tonaca media dei vasi e previene la loro trasformazione in un fenotipo osteoblastico (164) e quindi quando vi è una sua carenza, come nella insufficienza renale cronica, vengono favoriti i processi di calcificazione vascolare specialmente nel contesto delle lesioni aterosclerotiche. Per quanto riguarda la fetuina, i suoi livelli decrescono durante la fase cellulare del processo di infiammazione (165). In vitro la fetuina inibisce la formazione e la precipitazione del fosfato di calcio, ma non ha nessun effetto sulla idrossiapatite una volta che questa si è formata (166), antagonizza l effetto antiproliferativo 23