Nuovi test di diagnostica molecolare

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1 WOMEN IN CHANGE Donne che cambiano Modena, 25/26/ 27 marzo 2010 Nuovi test di diagnostica molecolare Francesca Ravasini, Rossana Bellucci

2 Avery propone il DNA come materiale genetico Holley sequenza il trna di lievito METODO SANGER (terminazione di catena) METODO MAXAM-GILBERT (degradazione chimica) Tappe storiche Kary Mullis Introduce la PCR Miescher osserva per la prima volta il DNA 1953 Watson e Crick determinano la struttura della doppia elica QF-PCR per la diagnosi prenatale di aneuploidie 1993 / Vengono sviluppate le tecniche per la sintesi degli oligonucleotidi e per la degradazione chimica del DNA. Viene introdotta l elettroforesi su gel per la Separazione di frammenti di DNA Il DNA genomico viene clonato nel fago M13 o in vettori plasmidici, nascono i primi programmi informatici di analisi dei dati, vengono sviluppate nuove tecnologie per il sequenziamento AUTOMAZIONE PARZIALE Vengono sviluppate le prime apparecchiature per il sequenziamento che impiegano sistemi per la rilevazione della fluorescenza Automazione completa Sequenziamento completo del genoma umano

3 Diagnostica molecolare: applicazioni può essere utilizzata per due tipi di indagini: Analisi di frammenti Es. STRs Short Tandem Repeats (QF-PCR) Caratterizzazione completa di una regione di DNA per la ricerca di mutazioni (SEQUENZIAMENTO)

4 Quali test oggi.. QF-PCR SEQUENZIAMENTO

5 The PCR method a copying machine for DNA molecules La PCR è una tecnica che prevede l amplificazione di una sequenza di DNA di cui si conoscono gli estremi. La PCR avviene in una serie di cicli composti da tre fasi: - nella prima abbiamo la denaturazione dei frammenti, fase che avviene ad alte temperature - una fase di Annealing, appaiamento, in cui i primer si appaiono ai filamenti - una fase in cui la TAQ polimerasi sfruttando l oh libero fornito dai primer, polimerizza usando come stampo la sequenza (replicazione)

6 Nella porzione terminale del capillare, i frammenti di terminazione sono colpiti dal raggio laser che eccita le molecole fluorescenti ad essi legate Le emissioni fluorescenti sono separate in base alla lunghezza d onda dalla camera CCD (Charge Coupled Device) Il segnale risultante produce un pattern di bande che correla con una sequenza di DNA, detto Elettroferogramma

7 Due modalità di marcatura fluorescente Marcatura dei ddntps Marcatura dei primers

8 Analisi della sequenza nucleotidica di brevi tratti di DNA per: tipizzazione di microrganismi patogeni e virus (Es: identificazione di ceppi di HPV ) identificare mutazioni in geni responsabili di malattie genetiche identificazione di polimorfismi PROCEDURA ANALITICA Estrazione DNA Amplificazione: PCR con primers specifici Gel di Agarosio Cycle Sequencing (PCR con primers specifici e ddntps marcati). Elettroforesi capillare (Sequenziatore Automatico) ed elaborazione dei dati con un programma dedicato

9 DNA stampo a singola elica Il sequenziamento a terminazione di catena si basa sulla sintesi di nuovi filamenti di DNA, complementari ad uno stampo a singolo filamento Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) GGCTAAC 3 -GGCTAAC + [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTTP(dNTP)+Polimerasi Ibridazione con Il primer ddatp, dntp ddctp, dntp ddgtp, dntp ddttp, dntp -CCG dda -CCGATT ddg -CCGAT ddt -CCGA ddt -CCG dda -CC ddg -C ddc -ddc -ddc -C ddc -CC ddg -CCGATT ddg A C G T G T T A G C C Sequenza: 5 -CCGATTG -CCGA ddt -CCGAT ddt Direzione di lettura

10 Sequenziamento automatico con marcatori fluorescenti Unica reazione ed unica corsa Ad ogni nucleotide è associata una diversa colorazione: ddatp ddttp ddgtp ddctp Questo sistema aumenta la produttività ed elimina la variabilità di corsa Coniugando a ciascun ddntp un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio e caricare il tutto in un solo pozzetto in un gel di poliacrilamide

11 Sequenziatori Capillari l intervento dell operatore è minimo il sistema carica automaticamente il capillare con il polimero di corsa esegue la separazione elettroforetica i frammenti marcati di DNA vengono rilevati man mano che attraversano il capillare

12 Dal cycle sequencing all elettroforetogramma... Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore Le informazioni vengono trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all intensità di emissione.

13 Tipizzazione HPV

14 BLAST contro la banca dati

15 Mutazioni in geni responsabili di malattie genetiche (Es. CX26 o GJB2)

16 Banca dati di riferimento La sordità può essere isolata e sporadica o far parte di un quadro clinico più complesso, associata ad altre varie patologie. Le forme genetiche più comuni sono bilaterali, di tipo percettivo. Tutte le frequenze possono essere colpite ed alcune forme ereditarie presentano danni per i toni alti, medi e bassi. L'esordio può avvenire alla nascita o in epoca successiva, l'evoluzione è variabile, progressiva o stazionaria. La sordità profonda alla nascita causa il mancato sviluppo della parola. La maggior parte delle sordità congenite è di natura ereditaria con trasmissione recessiva del carattere o sporadica. In entrambi i casi è stata accertata la responsabilità di un gene, che regola la sintesi di una serie di proteine necessarie per l'integrità dell'organo dell'udito: le connexine.

17 QF-PCR Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) è una tecnica semplice e rapida che consente la diagnosi molecolare delle aneuploidie più comuni (trisomia 21, 13, 18 e aneuploidie dei cromosomi sessuali). Le aneuploidie rappresentano oltre il 90% delle anomalie cromosomiche con difetti congeniti Questo tipo di approccio non richiede colture cellulari: la diagnosi può essere completata in 2-3 giorni PROCEDURA ANALITICA Estrazione DNA Amplificazione: 2 multiplex con almeno 15 STR (tetra e pentanucleotidi repeats) marcati in 5 Elettroforesi capillare (Sequenziatore Automatico) ed elaborazione dei dati con un programma dedicato

18 QF-PCR Il metodo si basa sull'amplificazione di brevi sequenze del DNA che contengono blocchi ripetuti di 2-6 basi (marcatori STRs). Queste sequenze sono specifiche per il cromosoma che si intende analizzare. Eterozigote 1:1 Omozigote Non informativo AATG Trisomico Triallelico 1:1:1 Materno Paterno Trisomico Diallelico 2:1 o (1:2) Eterozigote o diallelico = Due alleli di lunghezza differente Omozigote o monoallelico = Due alleli della stessa lunghezza Trisomico = triallelico o diallelico (2:1-1:1:1)

19 Trisomia del cromosoma 18 1 : 1 : 1 1 : 2 I marcatori diallelici si considerano trisomici quando il rapporto fra le aree dei due picchi è <0.7 o >1.4

20 Triploidia 1:1:1 1 : 2

21 Criticità del metodo Interpretazione della monosomia X e diagnosi della Sindrome di Turner Contaminazione con DNA materno

22 Criticità del metodo Assenza del segnale dell Y AM XY Cr. X Cr. 7 Cr. 13 Cr. X Cr. X Cr. X Cr. 13 Cr. X Sindrome di Turner? Turner 2:1 1:1 XX Cr. 7 Cr. X Cr. 7 Cr. X Contaminazione con DNA materno

23 Accuratezza della QF-PCR per trisomie 13, 18, 21 e aneuploidie dei cromosomi sessuali Verma et al / / / 21: /33 Pertl et al / 247 / / 21: 4 15/15 13: 2 1/1 18: 3 4/5 Levett et al / / / 21: 6 57/57 13: 6 8/8 18: 6 17/17 X:5-Y:2 20/20 Voglino et al : 110/110 13: 15/15 18: 40/40 XY: 25/25 Curcio et al / / 21: 4 26/26 13: 3 2/2 18: 3 8/8 XY: 5 6/6 Cirigliano et al / 21: 6 344/344 13: 4 61/61 18: 5 162/162 XY: 8 224/224 Ogilvie et al / / 21: /333 13: /54 18: /130 XY: 10 36/36 Choueri et al / / / 21: 8 20/20 13: 5 1/1 18: 5 3/3 Modificato da: Lisa G.Shaffer and The-Hung Bui, A.J.M.G. 145C:87-98 (2007)

24 Linee guida

25 External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular genetic techniques: 3 years experience. Prenat Diagn May;27(5): National Genetics Reference Laboratory (Manchester),UK, EQA (external quality assessment) Monitorare la qualità del test eseguito Migliorare la qualità del test eseguito UKNEQAS: Schema pilota di EQA per la diagnosi rapida di aneuploidie, inizialmente per i laboratori del Regno Unito e successivamente esteso a tutta Europa 5 campioni inviati ai partecipanti per anno, costituiti da DNA estratto da amniociti non coltivati e da villo coriale I partecipanti devono genotipizzare i campioni con i metodi utilizzati di routine e inviare i risultati con i form di risposta utilizzaticon l iterpretazione completa del risultato Tutti i report di risposta sono anonimi EQA valuta sia gli errori di genotipizzazione che la qualità d interpretazione del dato clinico Nel 2004 è stata valutata l accuratezza della genotipizzazione, nel 2005 e 2006 la valutazione dei risultati è stata fatta in base alla linee guida :

26 CONCLUSIONI 21 Idrossilasi - Sindrome Adreno Genitale (gene CYP21) - Ricerca delle principali mutazioni del gene della 21 Idrossilasi (CYP 21B) mediante sequenziamento automatico. aciduria metilmalonica e omocistinuria, tipo cbic (MMACHC) - ACIDURIA MEVALONICA - HYPER-IgD SYNDROME (MVK) - Acondroplasia (gene FGFR3) - Ricerca delle principali mutazioni del gene dell'acondroplasia (FGFR3) mediante sequenziamento automatico Actin myopathy (ACTA1) - adenosine deaminase, deficienza di (ADA) - Adrenoleucodistrofia (ALD)- gene ABCD1 - Analisi di mutazione del gene ABCD1 mediante sequenziamento automatico AGAMMAGLOBULINEMIA, AUTOSOMAL RECESSIVE (IGHM) - Alagille, sindrome di (JAG1) - Albinismo oculocutaneo tipo 1 (TYR) - Alfa-1-Antitripsina (gene PI) - Analisi di mutazione del gene dell'alfa-1-antitripsina mediante sequenziamento automatico Alzheimer - Test predittivo pro-infiammatorio - Alzheimer ad esordio precoce - gene PSEN1 - Analisi di mutazione dei geni PSEN1(Alzheimer ad esordio precoce) e determinazione del genotipo APOE (Alzheimer sporadico) mediante sequenziamento automatico. Alzheimer ad esordio precoce - gene PSEN2 - Analisi di mutazione dei geni PSEN 2 (Alzheimer ad esordio precoce) e determinazione del genotipo APOE (Alzheimer sporadico) mediante sequenziamento automatico. Alzheimer tipo 1 ad insorgenza precoce (APP) - Amyloidosis (TTR) Anemia Falciforme o Drepanocitosi - Analisi di mutazione del gene Beta globina per la ricerca della mutazione Cod 6 A/T associata ad anemia falciforme anemia FANCONI gruppo C - Aneuploidie Molecolari X-Y - Analisi delle alterazioni cromosomiche numeriche relative ai cromosomi X-Y, mediante QF-PCR (Quantitative-Fluorescent-Polymerase Chain Reaction Aneuploidie Molecolari - 21-X-Y - Analisi delle alterazioni cromosomiche numeriche relative ai cromosomi 21--X-Y, mediante QF-PCR (Quantitative-Fluorescent-Polymerase Chain Reaction ANIRIDIA (PAX6) - Apolipoproteina E (ApoE): Genotipizzazione alleli E2, E3, E4 - Determinazione del genotipo APOE (Alzheimer sporadico) mediante sequenziamento automatico. AROMATASI - deficit (p450) - Atassia di Friedreich (FRDA) - Valutazione dell'espansione patologica di triplette nucleotidiche associata alla atassia di Friedreich. Atassia Spinocerebellari (SCA) tipo 1 (ATXN1) - Atassia Spinocerebellari (SCA) tipo 2 (ATXN2) - Atassia Spinocerebellari (SCA) tipo 3 (ATXN3) - Atassia Spinocerebellari (SCA) tipo 6 (CACNA1A) - Atassia Spinocerebellari (SCA) tipo 7 (ATXN7) - ATROFIA MUSCOLARE SPINALE E BULBARE - SBMA o Kennedy disease (AR) - Valutazione dell'espansione patologica di triplette nucleotidiche del Recettore Androgenico (AR) mediante Amplificazione genica fluorescente (F-PCR) ATROFIA MUSCOLARE SPINALE TIPO I,II,III (SMA) - Valutazione semiquantitativa della delezione degli esoni 7 ed 8 del gene SMN 1 medianteamplificazione genica (PCR) e sequenziamento automatico SNaPShot Bartter, sindrome di, tipo 1 (KCNJ1) - Beckwith-Wiedemann, sindrome di (CDKN1C) - blepharophimosis - ptosis - epicanthus inversus sindrome (BEPS): FOXL2 gene - BLOOM SINDROME (BLM) - Bruton tyrosine kinase (gene BTK) - CANAVAN, malattia di (ASPA) Ceroid-lipofuscinosis, neuronal, tipo 6 (CLN6) - CEROIDO LIPOFUSCINOSI NEURONALE (PPT1) - CHARCOT-MARIE-TOOTH type 1A (PMP22) - analisi di linkage - Charcot-Marie-Tooth X-Linked - Congenital disorder of glycosylation, type 1A (PMM2) - Crigler-Najjar syndrome (UGT1A1) - Diamond Blackfan Anemia ( gene RPS19) - Analisi di mutazione mediante sequenziamento automatico del gene RPS19, associato all'anemia congenita ipoplastica, tipo Diamond-Blackfan DISAUTONOMIA FAMILIARE (FD) - Disomia Uniparentale - Studio di marcatori genetici STR mediante PCR Fluorescente e genotipizzazione in sequenziatore automatico per la valutazione di disomia uniparentale. Sindromi di Prader-Willi, Angelman, Beckwith-Wiedeman, Russell-Silver Displasia Diastrofica SLC26A2) - Analisi di mutazione del gene SLC26A2 mediante amplificazione genica (PCR) e sequenziamento automatico Distonia primaria - gene DYT1 (dystonia muscolorum deformans) - Distrofia dei Cingoli - 1C (LGMD - 1C) - CPKemia elevata - Gene CAV3 - Analisi di mutazione del gene CAV3 mediante amplificazione genica (PCR) e sequenziamento automatico Distrofia dei Cingoli - 2C (LGMD - 2C) - Gene SGCG - Analisi di mutazione del gene SGCG mediante amplificazione genica (PCR) e sequenziamento automatico Distrofia Facioscapulomerale (FSHD) Distrofia Miotonica (Malattia di Steinert) - (DMPK) - Analisi della regione 19 q13.3 per la ricerca dell'espansione patologica delle triplette CTG nella porzione 3' del gene MT-PK (Protein-chinasi-miotonina). Distrofia Miotonica 2 (DM2) - (ZNF9) - Distrofia Muscolare di Becker (DMB) - Valutazione delle principali delezioni del gene della distrofina mediante PCR fluorescente e corsa elettroforetica in sequenziatore automatico Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD) - Valutazione delle principali delezioni del gene della distrofina mediante PCR fluorescente e corsa elettroforetica in sequenziatore automatico Distrofia Muscolare di Duchenne Becker (DMD/DMB) - analisi di linkage - Valutazione delle principali delezioni del gene della distrofina mediante PCR fluorescente e corsa elettroforetica in sequenziatore automatico Duane-radial ray sindrome (SALL4) - Ectodermal displasia 1 (EDA) - ECTRODATTILIA DISPLASIA ECTODERMICA (tp63) - Emocromatosi ereditaria tipo 4 (gene Ferroportina ) 2 mutazioni - Ricerca delle mutazioni del gene Ferroportina associate all'emocromatosi,mediante sequenziamento automatico Emocromatosi ereditaria classica (gene HFE ) 12 mutazioni - Ricerca delle principali mutazioni (12) del gene HFE associate all'emocromatosi mediante sequenziamento automatico Emocromatosi ereditaria classica (gene HFE) 3 mutazioni - Ricerca delle principali mutazioni (3 )del gene HFE associate alla emocromatosi mediante Sequenziamento automatico. Emocromatosi ereditaria screening 18 mutazioni - Ricerca delle principali mutazioni (18) dei geni HFE,TFR2,Ferroportina, associate all'emocromatosi,mediante sequenziamento automatico. Emocromatosi ereditaria tipo 3 (gene TFR2) 4 mutazioni - Ricerca delle mutazioni del gene TFR2 associate all'emocromatosi,mediante sequenziamento automatico Emofilia A (gene FVIII) - Analisi di mutazione del gene del Fattore VIII della coagulazione mediante sequenziamento automatico diretto. Emofilia B (gene FIX) - Analisi di mutazione del gene del Fattore IX della coagulazione mediante sequenziamento automatico diretto. Epidermolisi Bollosa Simplex - Dowling-Meara - geni KRT5 e KRT14 - Ricerca delle principali mutazioni del gene della EB mediante Sequenziamento automatico. EPIDERMOLISI BULLOSA Simplex - Mottled-Hyperpigmentation - KRT5 gene - EPIDERMOLISI BULLOSA Simplex - Weber-Cockayne - gene KRT5 - Esoostosi multipla tipo 1 (EXT1) - Esostosi multipla tipo 1 (EXT1) - Esostosi multipla tipo 2 (EXT2) - Faciogenital displasia (FGD1) Emocromatosi ereditaria classica (gene HFE) 3 mutazioni - Ricerca delle principali mutazioni (3 )del gene HFE associate alla emocromatosi mediante Sequenziamento automatico. Emocromatosi ereditaria screening 18 mutazioni - Ricerca delle principali mutazioni (18) dei geni HFE,TFR2,Ferroportina, associate all'emocromatosi,mediante sequenziamento automatico. Emocromatosi ereditaria tipo 3 (gene TFR2) 4 mutazioni - Ricerca delle mutazioni del gene TFR2 associate all'emocromatosi,mediante sequenziamento automatico Emofilia A (gene FVIII) - Analisi di mutazione del gene del Fattore VIII della coagulazione mediante sequenziamento automatico diretto. Emofilia B (gene FIX) - Analisi di mutazione del gene del Fattore IX della coagulazione mediante sequenziamento automatico diretto. Epidermolisi Bollosa Simplex - Dowling-Meara - geni KRT5 e KRT14 - Ricerca delle principali mutazioni del gene della EB mediante Sequenziamento automatico. EPIDERMOLISI BULLOSA Simplex - Mottled-Hyperpigmentation - KRT5 gene - EPIDERMOLISI BULLOSA Simplex - Weber-Cockayne - gene KRT5 -

27 Esoostosi multipla tipo 1 (EXT1) - Esostosi multipla tipo 1 (EXT1) - Esostosi multipla tipo 2 (EXT2) - Faciogenital displasia (FGD1) - Fattore VII - deficit (F7) - Febbre Mediterranea Familiare (FMF) - Principali mutazioni gene MEFV - Febbre Mediterranea Familiare (FMF) - Screening interno gene MEFV - Fenilchetonuria (gene PAH) - Analisi di mutazione del gene Phenylalanine Hydroxilase (PAH) mediante sequenziamento automatico diretto. Fibrosi Cistica - analisi 200 mutazioni (CFTR) - Ricerca delle principali mutazioni della Fibrosi Cistica (200) condotta mediante l'impiego contemporaneo di due metodiche: analisi di sequenza automatizzata e Oligonucleotide Ligation Assay (OLA) Fibrosi Cistica - analisi 33 mutazioni + Polimorfismo 5T (CFTR) - Ricerca delle principali mutazioni della Fibrosi Cistica (33 + Polimorfismo 5T) condotta mediante l'impiego contemporaneo di due metodiche: analisi di sequenza automatizzata e Oligonucleotide Ligation Assay (OLA) Fibrosi Cistica - analisi 70 mutazioni (CFTR) - Ricerca delle principali mutazioni della Fibrosi Cistica (100) condotta mediante l'impiego contemporaneo di due metodiche: analisi di sequenza automatizzata e Oligonucleotide Ligation Assay (OLA) Fibrosi Cistica - intero gene (CFTR) - Analisi di mutazione del gene CFTR condotta mediante analisi di sequenza automatizzata. GALACTOSIDASE-BETA -1 DEFICIENCY (GLB1) - galattosemia, tipo I (GALT) - Gangliosidosi (GLB1) - Gaucher sindrome - principali mutazioni - Ricerca delle principali mutazioni del gene GBA per la glucocerebrosidasi mediante sequenziamento automatico GAUCHER, malattia di - (GBA) - Intero gene - GILBERT SINDROME (UGT1A1) Glutarico Aciduria tipo I (gene GCDH) - Analisi di mutazione del gene GCDH mediante amplificazione genica (PCR) e sequenziamento automatico Glycogen storage disease type 1a (GSD1a) - Glycogen storage disease type I, von Gierke disease (G6PC) - GRANULOMATOUS DISEASE, CHRONIC, X-LINKED (CYBB) - Gucosio 6-fosfato deidrogenasi (gene G6PD) (favismo) - Analisi di mutazione del gene G6PD mediante amplificazione genica (PCR) e sequenziamento automatico HOLT-ORAM (gene TBX5) - Huntington - Corea di Huntington (HD) - Valutazione dell'espansione patologica della tripletta nucleotidica associata alla malattia di Huntington. Mediante PCR fluorescente. Ictiosi lamellare (TGM1) - Immunodysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy (FOXP3) - Insensibilità agli androgeni - sindrome da - (AR) - interleuchina 3, recettore alfa (IL3RA) - Iper-IgD sindrome (MVK) - Ipocondroplasia (gene FGFR3) - Ricerca delle principali mutazioni del gene dell'ipocondroplasia (FGFR3) mediante sequenziamento automatico. Ipofosfatasia tipo 1 (ALPL) - IPOMAGNESEMIA, PRIMARIA (CLDN16) - IPOPLASIA ADRENALE CONGENITA - AHC (DAX1) - Keratitis (PAX6) - KRABBE Disease (gene GALC) - Leri-Weill dyschondrosteosis (SHOX) - Lesch-Nyhan (gene HPRT1) - Leucodistrofia metacromatica (ARSA) - linfoistiocitosi emofagocitica (PFR1) - linfoproliferativa, sindrome - X-linked - (SH2D1A) - LOWE - SINDROME OCULOCEREBRORENALE (OCRL1) - MANO-PIEDE-UTERO SINDROME (HOXA13) - Maple syrup urine disease (MSUD) - Medium Chain Acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) deficit - Analisi di mutazione del gene ACADM mediante amplificazione genica (PCR) e sequenziamento automatico Melas Syndrome - Analisi di mutazione del gene MTTL1 mediante sequenziamento automatico per la ricerca della mutazione 3243A-G dell' mtdna Mucolipidosi tipo IV (MLIV) - Mucopolisaccaridosi Tipo IIIA - SINDROME DI SANFILIPPO (GENE SGSH) - MUCOPOLISACCARIDOSI TIPO IIIB (NAGLU) - MUCOPOLISACCARIDOSI TIPO IVB (GLB1) - Mucopolisaccaridosi Tipo VI (Arilsulfatasi B - ARSB) - Mucopolisaccaridosi, type I (IDUA) - NEFROTICA SINDROME - STEROIDO RESISTENTE (NPHS2) - Nemaline myopathy (CFL2) - Neutropenia severe congenital tipo 1 (ELA2) - Niemann-Pick - malattia di - tipo A (SMPD1) - Niemann-Pick - malattia di - tipo B (SMPD1) - Omenn syndrome (RAG1) - Pancreatite Ereditaria (PRSS1-TYR) - PANTOTHENATE KINASE-neurodegenerazione associata a - (PANK2) - PARAPLEGIA SPASTICA tipo 3 - malattia di Strumpell (SPG3A) - Peutz-Jeghers syndrome (STK11) - Propionic acidemia B (PCCB) - Pycnodysostosis (CTSK) - RENE POLICISTICO Autosomico dominante (PKD1) - analisi di linkage - RENE POLICISTICO Autosomico Recessivo (PKHD1) - analisi di linkage - RETINITE PIGMENTOSA (gene RHO) - Analisi di mutazione del gene della Rodopsina (RHO) mediante sequenziamento automatico diretto. RETT - Sindrome di RETT - gene MECP2 - Ricerca delle principali mutazioni del gene MECP2 mediante amplificazione genica (PCR) e sequenziamento automatico sclerosi laterale Amiotrofica (SOD1) - SCLEROSI TUBEROSA ( TSC1) - Shwachman-Bodian-Diamond sindrome (SBDS) - SINPOLIDATTILIA (HOXD13) - Smith-Lemli-Opitz syndrome (DHCR7) - Sordità ereditaria - intera regione codificante gene CX26 - Analisi di mutazione del gene della Connessina 26 (CX26) mediante sequenziamento automatico. Sordità ereditaria - intera regione codificante gene CX30 - Sordità ereditaria - principali mutazioni gene CX26 - Screening delle principali mutazioni del gene della Connessina 26 (CX26) mediante sequenziamento automatico. SRY - Sex Determining region Y - Superossido dismutasi 1 (SOD1) - Talassemia Beta - Intero gene beta globina - Analisi di mutazione del gene della beta-globina mediante sequenziamento automatico. Talassemia Beta - Screening 23 mutazioni italiane - Ricerca diretta delle principali mutazioni italiane (23) del gene della beta-globina mediante sequenziamento automatico. TAY SACHS (HEXA) - Tirosinemia tipo I (FAH) - Van der Woude syndrome (IRF6) - Wiskott-Aldrich Syndrome (gene WAS) - Analisi di mutazione del gene WAS mediante amplificazione genica (PCR) e sequenziamento automatico X fragile o Sindrome di Martin-Bell o Sindrome da ritardo Mentale (FRAXA) - Valutazione dell'espansione patologica di triplette nucleotidiche associate alla sindrome di Martin-Bell. Amplificazione genica fluorescente (F-PCR) X fragile o Sindrome di Martin-Bell o Sindrome da ritardo Mentale (FRAXE) - Valutazione dell'espansione patologica di triplette nucleotidiche associate alla sindrome di Martin-Bell. Amplificazione genica fluorescente (F-PCR)