Protocollo diagnostico per Tilletia indica Mitra

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1 Protocollo diagnostico per Tilletia indica Mitra A cura di: Luca Riccioni, Mauro Bragaloni Versione n. 1 del 15 febbraio

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3 Descrizione della malattia Agente causale Tassonomia Tilletia indica Mitra Fungo: Basidiomycota: Ustilaginomycetes:Tilletiales Ceppi individuati Avversità Sinonimi Carie parziale del grano Neovossia indica (Mitra) Mundkur Introduzione Tilletia indica Mitra è agente della Carie parziale del grano La carie parziale (nota come Karnal bunt perché scoperta nel 1931 nella zona di Karnal, Haryàna, nell India del Nord), è una malattia della cariosside del grano, del triticale, e potenzialmente della segale e del farro. T. indica non è presente in Europa ed è considerato patogeno di quarantena per l Unione Europea (Dir. 2000/29/CE) e quindi anche per l Italia dal 1997, con Decreto del Ministero delle Politiche Agricole e Forestali del 19 febbraio 1997 (Gazzetta Ufficiale, Serie Generale, n. 69 del 24 marzo 1997). Da la semente di grano, di triticale e di segale è soggetta a strette misure di controllo se importate da paesi dove il fungo è presente. Dall India la malattia si è diffusa prima nelle zone limitrofe del Pakistan, Afghanistan, Iran, Iraq e Nepal, per poi essere segnalata nel 1969 in Messico, nel 1996 in USA e nel 2001 in Sudafrica. Benché la malattia non comporti una riduzione apprezzabile della produzione in quanto le perdite sono stimate al massimo attorno all 1%, i danni economici maggiori sono dovuti alla riduzione della qualità del grano. Il fungo, infatti, produce trimetilammina, un composto chimico volatile, che conferisce al frumento infetto un odore ed un sapore di pesce marcio. È sufficiente un infezione del 3% delle cariossidi per rendere la granella non più adatta all alimentazione umana e un infezione del 6-9% per renderla inutilizzabile anche per l alimentazione del bestiame.. Sintomatologia Il sintomo sulle cariossidi è rappresentato dal così detto soro, massa nera e compatta di micelio del fungo che a maturità produce spore, dette teliospore, dando un aspetto polverulento al soro stesso. E denominata carie parziale perché generalmente soltanto una porzione della cariosside è attaccata (Foto 1). Se l ospite è molto suscettibile e le condizioni ambientali favorevoli, l intera cariosside sarà trasformata in soro, ma ciò accade raramente. Più comunemente il danno della cariosside è limitato ad un piccolo soro in prossimità dell ilo. 3

4 Foto 1. Cariossidi di grano con sintomi a diversi gradi di intensità di carie parziale. Morfologia Le teliospore (Foto 2) sono globose e/o subglobose, nere o castano scuro, a pareti spesse, del diametro di µm, costituite esternamente da un episporio echinulato, formato da numerose spine (caratteristiche per ciascuna delle diverse specie di Tilletia). Le teliospore costituiscono le strutture di sopravvivenza del fungo, potendo rimanere vitali in uno stato dormiente per diversi anni nel terreno, e rappresentano gli organi di diffusione e dispersione del fungo. Le teliospore vengono disperse nell ambiente soprattutto durante la raccolta del grano e possono diffondersi per centinaia di chilometri sia attraverso il vento sia attraverso i macchinari per la raccolta e il trasporto del grano. Bastano poche cariossidi infette per contaminare il raccolto ed il Foto 2. Teliospora di terreno. Le teliospore dormienti, una volta presenti nel terreno Tilletia indica all interno del seme infetto o libere, possono essere riportate in superficie con le normali lavorazioni agricole e, se si trovano ricoperte da non più di 1-2 mm di terra e in presenza di umidità e di temperature favorevoli, possono germinare e dare avvio al ciclo. Rischi di introduzione del patogeno in Europa Il rischio maggiore di introdurre T. indica è legato soprattutto all importazione di partite di cereali infette e/o contaminate provenienti da Paesi dove il patogeno è già presente. Per questa ragione i Servizi Fitosanitari dei paesi dell Unione Europea hanno messo in atto i possibili mezzi di difesa per evitare questa eventualità (Dir. 2000/29/CE e D.M. del 19/02/1997 di recepimento). Tali mezzi sono basati essenzialmente su attenti controlli, mediante specifiche analisi (Protocollo EPPO PM7/29 (2) (Anonymous, 2007), di tutte le partite commerciali di grano, segale e triticale dirette in Europa e provenienti dai Paesi in cui il patogeno è presente. Queste analisi servono a verificare la presenza di teliospore di T. indica, quindi, proprio l identificazione delle teliospore rappresenta la difficoltà principale. Le teliospore di T. indica sono molto simili nelle dimensioni e nel disegno dell episporio a quelle di altre specie di Tilletia che infettano altre graminacee, come T. horrida del riso e T. walkeri del loglio. Tale difficoltà aumenta se il campione di grano oggetto d analisi presenta un basso livello d infezione e/o contaminazione (presenza di 1-5 teliospore). Ricerche recentissime riguardanti la valutazione del rischio (Pest Risks Analisis, PRA) di un eventuale ingresso della malattia in Europa, a cui hanno partecipano diversi istituti Europei fra cui il Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale di Roma (CRA-PAV), concludono che il fungo ha la capacità di stabilirsi in Europa e di causare enormi danni economici (Sansford et al., 2006). Il rischio di introduzione è, inoltre, confermato da tre intercettazioni su partite di grano messicano infetto da T. indica da parte di alcuni Servizi Fitosanitari Regionali. Il CRA-PAV è stato indicato dal MiPAAF come laboratorio di riferimento per i Servizi Fitosanitari Regionali (Circolare Ministeriale Prot del ) per l identificazione del fungo in partite di importazione. 4

5 Diagnosi Il metodo utilizzato fino a pochi anni fa consisteva nell analisi al microscopio ottico del sedimento ottenuto dal lavaggio di 400 semi e relativa centrifugazione, per ricercare la presenza delle teliospore del fungo. Poiché tale metodo, pur nella sua validità, presentava alcuni limiti, è stato validato, recentemente, un nuovo protocollo diagnostico molto più articolato (Protocollo EPPO PM7/29 (2)) che fornisce precise istruzioni per la diagnosi su basi morfologiche di T. indica, e un successivo diagramma di lavoro per l identificazione molecolare da DNA estratto da micelio ottenuto da spore germinate. Schematicamente i requisiti necessari per una diagnosi positiva sono: a. presenza nel campione analizzato di cariossidi con sintomi di carie parziale. In questo caso, dopo verifica che le spore contenute nel seme cariato abbiano i caratteri morfologici caratteristici di T. indica, si può dare il campione positivo, senza necessariamente raccomandare ulteriori analisi, poiché si ritiene sufficiente il requisito di cariosside con sintomi di carie parziale (T. indica è l unica delle tre specie di Tilletia con cui si può morfologicamente confondere che può causare sintomi su grano). b. presenza di numerose spore (>10). In questo caso si ritiene possibile identificare la specie con la sola DIAGNOSI MORFOLOGICA nel caso in cui TUTTI i caratteri morfologici chiave Tab. 4 del PM7/29 (misure, colore, aspetto dell ornamento dell episporio (strato superficiale) sono conformi ad una specie. Una eventuale analisi molecolare viene raccomandata in caso di dubbi nell identificazione. c. presenza nel campione analizzato di poche spore (< 10). In questo caso si ritiene che non sia possibile discriminare fra le specie Tilletia indica, T. walkeri e T. horrida facendo solo uso dei caratteri morfologici, quindi si raccomanda l uso della diagnosi molecolare da DNA estratto da micelio fungino. Il protocollo EPPO da la possibilità di utilizzare l analisi molecolare su DNA ottenuto da micelio, e fa riferimento a tre tecniche possibili disponibili in letteratura: 1) amplificazione diretta del DNA mitocondriale con l uso di primer specifici (Frederick et al., 2000); 2) amplificazione del DNA ribosomale e successivo taglio con enzimi di restrizione (Pimentel et al., 1998); 3) uso di sonde specifiche in Real Time PCR (Frederick et al., 2000). Le tecniche molecolari, dovendo essere applicate al micelio, richiedono la germinazione, evento non facile per le spore di T. indica che sono di tipo durevole e caratterizzate da un periodo di lunga dormienza. Poiché la germinazione delle spore è una fase critica del protocollo, come sopra spiegato, si è voluto mettere a punto un metodo capace di identificare il fungo da singole spore non germinate. E stato quindi testato e validato il metodo multiplex pubblicato da (Tan e Murray, 2006), e si è messo a punto un secondo metodo non in multiplex con primers specifici, e confrontato con il precedente. 5

6 Normativa fitosanitaria Decreto Ministeriale 31 gennaio 1996 dal titolo Misure di protezione contro l introduzione e la diffusione nel territorio della Repubblica italiana di organismi nocivi ai vegetali o ai prodotti vegetali e successive modifiche (D. M. 19 febbraio 1997) Circolare Ministero per le politiche agricole alimentari e forestali Prot del Bibliografia Agarwal, V.K., Verma, H.S. e Khetarpal, R.K. (1977) Occurrence of partial bunt on triticale, Plant Protection Bulletin 12: Mitra M., (1931) A new bunt on wheat in India, Annals of Applied Biology, 18: Sekhon K. S., Saxena A. K., Randhawa S. K. e Gill K.S., (1980) Effect of Karnal bunt disease on quality characteristics of wheat, Bulletin Grain Technology, 18: Joshi L.M., Singh D.V., Srivastava K.D., e Wilcoxson R.D., (1983) Karnal bunt: A minor disease that is now a threat to wheat, Botanical Review, 49: Nagarajan S., (1991) Epidemiology on Karnal bunt of wheat incited by Neovossia indica and an attempt to develop a disease prediction system. In: Technical Report Wheat-Program CIMMYT, Mexico, March, Anonymous, 2004 EPPO Standards PM 7/29 Diagnostic Protocol for Tilletia indica. Bulletin OEPP/EPPO 34: C. Sansford, R. Baker, J. Brennan, F. Ewert, B. Gioli, A. Inman, P. Kelly, A. Kinsella, V. Leth, H. Magnus, F. Miglietta, G. Murray, G. Peterson, A. Porta-Puglia, J. Porter, T. Rafoss, L. Riccioni, F. Thorne, M. Valvassori (2006). Risks associated with Tilletia indica, the newlylisted EU quarantine pathogen, the cause of Karnal bunt of wheat. EC Fifth Framework Project QLK pp Pimentel G, Carris LM, Levy L & Meyer R (1998) Genetic variability among isolates of Tilletia barclayana, T. indica and allied species. Mycologia 90, Frederick RD, Snyder KE, Tooley PW, Berthier-Schaad Y, Peterson GL, Bonde MR, Schaad NW & Knorr DA (2000) Identification and differentiation of Tilletia indica and T. walkeri using the polymerase chain reaction. Phytopathology 90, Tan Mk, Murray GM, A molecular protocol using quenched FRET probes for the quarantine surveillance of Tilletia indica, the causal agent of Karnal bunt of wheat. Mycol Res Feb;110(Pt 2):

7 Metodologie diagnostiche 7

8 Premessa Il protocollo diagnostico descritto è il prodotto dell attività effettuata nell ambito del Progetto Finalizzato ARON-ARNADIA, finanziato dal Ministero per le Politiche Agricole, Alimentari e Forestali. Il protocollo diagnostico fornisce le linee guida per la diagnosi e l identificazione del fungo Tilletia indica Mitra nei laboratori presenti sul territorio italiano preposti alla diagnosi degli organismi da quarantena. L uso di protocolli diagnostici armonizzati è alla base di un efficiente applicazione delle misure fitosanitarie e consente il confronto di risultati ottenuti da diversi laboratori in diverse circostanze. Le metodologie di laboratorio riportate nel protocollo riprendono il Protocollo EPPO PM7/29 (2) implementato in base all esperienza e alle nuove tecnologie e metodologie pubblicate recentemente, dopo una analisi della loro sensibilità, specificità, accuratezza, sensibilità analitica, ripetibilità e riproducibilità (ISO 16140:2003). Per la definizione di tali parametri le diverse metodologie di diagnosi sono state effettuate con reagenti, strumentazione dettagliatamente riportati. Ciò non comporta l esclusione dell uso di reagenti e strumentazioni alternative e la modifica di alcune procedure per meglio avvicinarsi agli standard di ogni singolo laboratorio, purché ciò venga adeguatamente validato. La definitiva validazione attraverso un ring test (riproducibilità) fra diversi laboratori è stata eseguita in collaborazione con: 1. CRA-PAV - Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale, Via C.G. Bertero 22, Roma (Luca Riccioni Coordinatore del Gruppo, Mauro Bragaloni) 2. Laboratorio di Micologia del Servizio Fitosanitario della Regione Emilia Romagna, via Corticella, 133, Bologna. (Carla Montuschi, Baschieri Tiziana) 3. Laboratorio di Patologia Vegetale, Università degli Studi di Catania, Facoltà di Agraria., Dipartimento di Scienze delle Produzioni Agrarie e Alimentari (DISPA), Sezione Patologia Vegetale, Via S. Sofia, 100, Catania (Vittoria CATARA, Patrizia Bella) 4. Centro di Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura Basile Caramia Via Cisternino 281, Locorotondo (BA) (Nicola TRISCIUZZI, Enza Dongiovanni). Le prove di validazioni sono riportate nell Allegato1. 8

9 FLUSSO DI LAVORO L identificazione di teliospore di T. indica all interno di un campione di grano di importazione viene effettuata secondo il seguente diagramma di lavoro: CAMPIONE DI SEME DI GRANO DI 50g WASHING TEST ESAME VISIVO A SECCO NESSUN SEME CARIATO E/O WASHING TEST NEGATIVO WASHING TEST POSITIVO SEME CARIATO NEGATIVO OSSERVAZIONE E CONTA DELLE SPORE Con almeno 10 spore Meno di 10 spore 1 3 ANALISI MORFOLOGICA 2 SE TUTTE LE CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE COINCIDONO POSITIVO 2A GERMINAZIONE DELLE SPORE IN VITRO DA SPORE NON GERMINATE DIAGNOSI MOLECOLARE - Real Time PCR con sonde speciespecifiche in multiplex. Opp. - Real Time PCR con primer speciespecifici. 2B DIAGNOSI MOLECOLARE ( End Point PCR oppure Dual Labeled Probe Real Time PCR con primers specie-specifici) DIAGNOSI MOLECOLARE ( RFLP via PCR della regione ITS ) 9

10 In questo protocollo si riportano le procedure per l identificazione di T. indica attraverso il riconoscimento morfologico delle teliospore, ed eventuale verifica con metodo molecolare direttamente da spora (non germinata), punto 3 del flusso di lavoro. Per l applicazione delle metodiche molecolari su DNA estratto da micelio del fungo, ottenuto per germinazione delle spore, si rimanda direttamente al protocollo EPPO PM PM7/29 (2). Metodo diagnostico Metodo morfologico ( washing test ) Metodo Molecolare 1: RT-PCR con sonde specie-specifiche in multiplex Metodo Molecolare 2: RT- PCR con primer specie-specifici Componente riconosciuta Teliospora Porzione di DNA ribosomale Porzione di DNA mitocondriale 10

11 METODO di CAMPIONAMENTO 11

12 Campionamento In fase di preparazione 12

13 SAGGIO MORFOLOGICO WASHING TEST 13

14 PROTOCOLLO PER L ESTRAZIONE DI SPORE DI TILLETIA SPP. DA UN CAMPIONE DI SEMI DI GRANO (WASHING TEST) Il protocollo qui esposto è tratto dal protocollo EPPO PM29/7, ed è stato precedentemente validato attraverso un Ring test internazionale nell ambito del progetto EU DIAGPRO Project. Il saggio morfologico si basa sul reperimento delle teliospore mediante un filtraggio selettivo dell acqua di lavaggio di una parte del campione di grano in esame (50 g), e successiva osservazione al microscopio ottico del materiale che si ottiene per l eventuale identificazione attraverso i caratteri morfologici delle spore di Tilletia spp. presenti. Prima del washing test l intero campione in esame deve essere osservato a secco, possibilmente aiutandosi con una lente di ingrandimento, per la ricerca di cariossidi con carie parziale (EPPO PM29/7). In caso di esito negativo si deve seguire il successivo protocollo. Se invece vengono rinvenute cariossidi cariate si deve seguire il capitolo successivo Identificazione morfologica per il riconoscimento delle teliospore presenti per confermare l esito positivo. Materiale occorrente 1. Ipoclorito commerciale 2. Soluzione acquosa allo 0,01% di TWEEN 20, come detergente (10 µl di Tween 20 in 100 ml di acqua distillata sterile) 3. Navicelle (8x8 cm) per pesata 4. Bilancia 5. Una beuta da 250 ml 6. Due beute da 500ml 7. Un cilindro da 100 ml 8. Parafilm M 9. Agitatore 10. Filtro in nylon con pori di 53 µ di diametro, con un diametro esterno di 11 cm 11. Filtro in nylon con pori di 20 µ di diametro, con un diametro esterno di 4 cm 12. Imbuto da 13 cm di diametro 13. Una spruzzetta con acqua distillata e pipette pasteur da 3 ml 14. Pipettatrice da 100 µl e puntali sterili 15. Pipettatrice da 1000 µl e puntali sterili 16. Tubi falcon da 15 ml sterili 17. Centrifuga per falcon da 15 ml 18. Sacchetti per autoclave 19. Un contenitore da 500 ml sterilizzabile in autoclave (es. becker) 20. Vetrini portaoggetto (76x21 mm). Vetrini copri oggetto (18x18 mm) 21. Stereomicroscopio (x ingrandimenti) 22. Microscopio composto 14

15 PROCEDURA 1. Sterilizzare per minuti tutto l equipaggiamento necessario per eseguire il test, immergendo in una soluzione di ipoclorito di sodio all 1,5 % v/v (diluire 3 parti di candeggina commerciale al 6% circa di cloro attivo aggiungendo 7 parti di acqua di rubinetto) e sciacquare il tutto in acqua di rubinetto ed infine in acqua distillata. 1. Pesare 50 g di semi dal campione di 1 2 kg, rappresentativo della spedizione, per avere il campione da analizzare (sotto viene riportata la tabella che indica il numero di repliche da effettuare, a seconda del livello di contaminazione e del livello di confidenza richiesto). Tabella 1 Numero di repliche di sub-campioni da 50 g necessarie per individuare diversi livelli di contaminazione in funzione dei diversi livelli di confidenza, assumendo che le teliospore si distribuiscono in modo uniforme (Protocollo EPPO 29/7). Livello di contaminazione (n. di spore per 50 g) N. di repliche richieste in funzione del livello di confidenza (%) 99% 99.9% 99.99% Mettere il campione in una beuta da 250 ml, aggiungere 100 ml della soluzione contenente Tween 20 allo 0,01% e sigillare la beuta con parafilm. 4 Agitare per un tempo complessivo di 3 minuti la beuta da 250 ml con 350 oscillazioni al minuto o 200 rotazioni al minuto o a mano. 5 Versare il contenuto della beuta (semi e soluzione Tween 20) su un filtro di nylon con pori da 53 µ e 11 cm di diametro posto su di un imbuto sovrastante una beuta da 500 ml. 6 Risciacquare la beuta di 250 ml con acqua distillata mediante una spruzzetta e versare il contenuto sul filtro. 7 Ripetere per due volte il punto 6. 8 Usando una spruzzetta, risciacquare con cura tutta la semente posta sul filtro da 53 µ con acqua distillata fino ad ottenere un volume di circa ml. Rimuovere il filtro da 53 µ e risciacquare l imbuto con 2 aliquote di ml di acqua distillata che raggiungeranno il resto del contenuto della beuta da 500 ml. 9. Versare la sospensione così ottenuta su un filtro da 20 µ di nylon (diametro filtro 4 cm) posto su un imbuto sovrastante una seconda beuta da 500ml. Risciacquare la prima beuta da 500 ml due volte con acqua distillata, e versando anche questo sul filtro da 20 µ. 15

16 10 Inclinare il filtro di e risciacquare delicatamente la membrana e le pareti del filtro con acqua distillata, con una spruzzetta o una pipetta Pasteur. Rimuovere con acqua distillata il deposito sul filtro mediante una pipetta e porlo in un tubo da centrifuga da 15 ml. 11 Ripetere 10 finché il filtro non appare pulito. Se necessario esaminarlo sotto lo stereomicroscopio per verificare la presenza di spore residue. 12 Centrifugare la sospensione a 200g per 3 minuti. 13 Rimuovere il supernatante con la pipettatrice da 1000 µl, senza alterare il pellet (il supernatante dovrà essere successivamente sterilizzato). 14 Risospendere il pellet con 100 µl di acqua sterile. 15 Dispensare 20 µl dei 100 µl ottenuti (con pipette da 100 µl) sui vetrini portaoggetti e chiudere con coprioggetto da 18x18 mm, per permettere l osservazione al microscopio da 100 a 400 ingrandimenti. La preparazione dei vetrini deve avvenire uno alla volta, e l osservazione va fatta velocemente, poichè il vetrino tende a seccarsi (in tal caso è possibile aggiungere acqua per capillarità con la pipettatrice. Le caratteristiche di eventuali spore rilevate vanno osservate ad un ingrandimento di 400. Se nessuna spora viene rinvenuta allora il test è concluso poiché il washing test è da considerarsi negativo. Se invece vengono rinvenute teliospore si deve seguire il capitolo successivo per il riconoscimento morfologico. NB. Alla fine, tutto il materiale utilizzato deve essere trattato con varecchina e risciacquato con acqua, come descritto nel punto 1, per poter essere riutilizzato nuovamente. 16

17 IDENTIFICAZIONE MORFOLOGICA Se vengono rinvenute teliospore applicare lo schema diagnostico riportato qui di seguito registrando i caratteri morfologici (dimensioni, colore, ornamentazione) e, se possibile, effettuando e registrando foto al microscopio al fine di raggiungere l identificazione tassonomica. Table 2 Caratteristiche morfologiche di Tilletia indica, Tilletia walkeri and Tilletia horrida Caratteri Teliospore Tilletia indica 1 Tilletia walkeri 2 Tilletia horrida 3 Dimensione (range) m (61)(26 55( 64)) (23 45) 17 36(20 38( 41)) Dimensione (media) m * (40 44) (34 36) (28) Colore Ornamentazione dell episporio vista con messa a fuoco mediana (Hawksworth et al., 1995) Ornamentazione dell episporio vista con messa a fuco sulla superficie Da arancione pallido a prevalentemente scuro, da bruno rossastro fino a nero opaco. Episporio sollevato a formare punte diritte ed aguzze (occasionalmente ricurve) e, in alcuni casi, troncate ed in genere ricoperte di una guaina ialina con dimensioni variabili da m. Punte dell episporio molto ravvicinate a formare aree molto dense dove permangono isolate lasciando spazi liberi (densamente echinulate) oppure molto strette tra di loro da formare creste sollevate molto fini (finemente cerebriforme). Da debolmente giallo a prevalentemente scuro bruno rossastro (mai opaco). Episporio sollevato a formare punte coniche (occasionalmente ricurve) in molti casi tronche, delle dimensioni di 3 6 m, ricoperte da una guaina che va da trasparente-ialina a giallo-bruna. Episporio arrangiato in punte disposte in maniera lassa e quindi formanti creste con spazi molto larghi, incompletamente cerebriformi (fino a formazioni di tipo coralloide) oppure in aggregati molto spessi. Da debolmente giallo a prevalentemente marrone castano chiaro o scuro (semi-opaco). Episporio sollevato a formare punte diritte ed aguzze oppure ricurve, grandi m, che possono trasformarsi in scaglie tronche quando raggiungono la maturità, ricoperte da una guaina che può variare da ialina a colorata. Episporio a formare punte che appaiono come scaglie con forma poligonale (occasionalmente episporio con punte che formano creste cerebriformi oppure piccoli aggregati). 1 Dati degli Autori (A. J. Inman, K. J. D.Hughes and R. J. Bowyer, Central Science Laboratory, York (GB) OEPP/EPPO, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 34, ) 2 Based on: Castlebury & Carris (1999); Cunfer & Castlebury (1999); Milbrath et al. (1998); Castlebury (1998). 3 Riportata da alcuni autori come T. barclayana: Castlebury & Carris (1999); CMI Description no. 75 (1965); Durán (1987); Durán & Fischer (1961). Altri Autori l hanno indicata come T. horrida: Agarwal et al. (1990); Khanna & Payak (1968); Castlebury (1998). Castlebury & Carris (1999) hanno riportato una dimensioni delle spore più grandi (misura riportata tra parentesi) per teliospore che venivano riscaldate in overnight a 45 C immerse nella soluzione di Shear; Anche in Castlebury (1998) sono state riportate dimensioni delle spore molto più grandi.. * Dati ottenuti dagli Autori Milbrath et al. (1998) ottenuti da teliospore osservate in sospensione acquosa e rinvenute su Lolium (due isolati dall Oregon, USA). Dati degli Autori (A. J. Inman, K. J. D.Hughes and R. J. Bowyer, Central Science Laboratory, York (GB) OEPP/EPPO, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 34, ) ottenuti dall osservazione in acqua di teliospore originate da semi del genere Oryza (California, USA; Arkansas, USA); sebbene non sia riportato in letteratura, alcune teliospore potrebbero avere porzioni dell episporio sollevato a formare creste ma anche, contemporaneamente, formazioni appuntite individualmente separate. Letteratura citata: Agarwal R, Joshi LM & Singh DV (1990) Morphological differences between teliospores of Neovossia indica and N. horrida. Indian Phytopathology 43,

18 Castlebury LA (1998) Morphological characterisation of Tilletia indica and similar fungi. In: Bunts and Smuts of Wheat: an InternationalSymposium (Ed. Malik VS & Mathur DE), pp NAPPO, Ottawa (CA). Castlebury LA & Carris LM (1999) Tilletia walkeri, a new species on Lolium multiflorum and L. perenne. Mycologia 91, CMI (1965) Description of Pathogenic Fungi and Bacteria, no. 75. Tilletia barclayana. CAB International, Wallingford (GB). Cunfer BM & Castlebury LA (1999) Tilletia walkeri on annual ryegrass in wheat fields in the southeastern United States. Plant Disease 83, Durán R (1987) Ustilaginales of Mexico: Taxonomy, Symptomatology, Spore Germination and Basidial Cytology. Washington. State University, Seattle (US). Durán R & Fischer GW (1961) The Genus Tilletia. Washington. State University, Seattle (US). Khanna A & Payak MM (1968) Teliospore morphology of some smut fungi. II. Light microscopy. Mycologia 60, Milbrath GM, Pakdel R & Hilburn D (1998) Karnal bunt spores in ryegrass (Lolium spp.). In: Bunts and Smuts of Wheat: an International Symposium (Ed. Malik, VS & Mathur, DE), pp NAPPO, Ottawa (CA). 18

19 FOTO TELIOSPORE Immagini di spore di T. indica individuate in un campione di grano importato dal Messico. 19

20 Teliospore di T. walkerii 20

21 Teliospore di T.barclayana 21

22 Teliospore di T. indica 22

23 SAGGI MOLECOLARI su singola spora REAL-TIME PCR CON SONDE SPECIE- SPECIFICHE in reazione multiplex REAL TIME PCR CON PRIMER SPECIE- SPECIFICI in reazioni separate 23

24 METODO 1 Target rdna Sonde di Tan et al Cap. 1 METODO 2 Target mtdna Sonda di Frederick et al Cap. 2 ALLESTIMENTO DI STRUTTURE A SANDWICH CON VETRINI COPRIOGGETTI TAGLIATI Cap. 1.1 ALLESTIMENTO PROVETTA DA 0,2 l PER PCR Cap. 1.2 PCR DI ARRICCHIMENTO TARGET - rdna Cap. 1.2 PCR DI ARRICCHIMENTO TARGET mtdna Cap.2.1 DIAGNOSI MOLECOLARE ( Dual labelled Probe Real Time PCR con sonde specie-specifiche) Cap. 1.3 DIAGNOSI MOLECOLARE Dual Labeled Probe Real Time PCR con primers specie-specifici) Cap. 2.2 Diagramma di flusso delle fasi da seguire per ciascun metodo per l identificazione specifica di Tilletia indica e T. walkeri con 2 diverse metodiche di diagnosi molecolare in RealTime PCR (TaqMan), dove i campioni da analizzare sono rappresentati da singole teliosporespore. 24

25 METODO IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE MEDIANTE REAL-TIME PCR CON SONDE SPECIE-SPECIFICHE (Tan et al., 2010 con alcune modifiche) La metodica consiste nel rilascio del DNA di una sola teliospora attraverso lo schiacciamento tra due pezzettini di vetro ( sandwich ), quindi da un arricchimento del DNA mediante una PCR con primer Tilletia specifici, e una multiplex Real-Time PCR per l identificazione della specie. Il metodo originariamente è stato messo a punto per il riconoscimento di 5 specie di Tilletia in una sola analisi, ma nel nostro caso il metodo verrà applicato per il riconoscimento di due specie: la specie target T. indica, e la specie no target T. walkerii, specie che più facilmente può essere confusa con T. indica nel riconoscimento morfologico. Pertanto in un unico tubo di reazione saranno presenti le due sonde Taqman, specie-specifiche, disegnate sul DNA ribosomale, e una coppia di primer non specie-specifiche. 1.1 Preparazione del sandwich 1) Prendere un vetrino coprioggetto da microscopia per preparare i pezzettini di vetro con i quali verranno schiacciate le teliospore a sandwich. Romperlo con una punta e selezionare i frammenti con dimensioni adeguate (1-3 x 1-3 mm). Può essere utile eseguire la scelta allo stereo microscopio utilizzando come sfondo carta millimetrata che farà da riferimento per il vaglio. 2) Preparare le soluzioni riportate nell Allegato al Metodo 1. 3) Prelevare le spore e deporle singolarmente su un frammento di vetrino di 1-3 mm. Questa fase può avvenire in qualsiasi modo si voglia operare, tenendo conto che è una fase molto delicata poichè si può perdere o distruggere la spora con facilità. Qui viene descritto un metodo: si consiglia di far scorrere il coprioggetto del vetrino lateralmente, osservando il tutto sotto uno stereoscopio, fino a liberare la spora dal coprioggetto. Assicurarsi che ci sia sufficente liquido tra vetrino e coprioggetto, altrimenti aggiungere acqua sterile con una pipetta. Prelevare la spora con un talloncino di carta da filtro tenuta con una pinzetta, previamente imbevuta in etanolo 95% e flambata al bunsen, e trasferirla sul frammento di vetrino di 1 3 mm scelto. Una piccola goccia di acqua sterile posta sul frammento può aiutare il trasferimento della spora dalla carta al vetrino (questa è la fase più delicata dove si rischia di perdere il campione pertanto bisogna porre molta attenzione nell esecuzione). Lasciare asciugare il frammento di vetro con la spora, coprire quindi con un altro frammento di vetro di dimensioni paragonabili al primo (fig. 1) e schiacciare facendo 25

26 pressione con l ago, controllando nel contempo la rottura del materiale in piccoli pezzi (fig. 2). A questo punto, facendo attenzione a non far slittare i due vetri sovrapposti, trasferire il sandwich nel fondo di una provetta 0,2 ml da PCR. In alternativa al talloncino si può utilizzate un pezzettino di agar-acqua (tenuto da una ansetta precedentemente sterilizzata) che, una volta catturata la spora, può essere direttamente poggiato nel frammento di vetrino. Fig. 1 - Sandwich già assemblato con la spora al centro (sullo sfondo è visibile della carta millimetrata). Fig.2 - Rottura della spora dopo aver fatto pressione sul vetrino con un ago da dissezione Fig. 3 - Rottura del sandwich prima dell incubazione in termociclatore 26