Syphilis Total Ab 1 piastra piastre

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1 Syphilis Total Ab 1 piastra piastre KIT PER LA RILEVAZIONE QUALITATIVA DI ANTICORPI ANTI TREPONEMA PALLIDUM IN SIERO O PLASMA UMANO CON UNA TECNICA DI IMMUNODOSAGGIO ENZIMATICO /11

2 INDICE 1. USO PREVISTO RIEPILOGO E ILLUSTRAZIONE DEL TEST PRINCIPI DELLA PROCEDURA REAGENTI AVVERTIMENTI E PRECAUZIONI CAMPIONI PROCEDURA LIMITAZIONE DEL TEST CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI [IT] 1

3 1. USO PREVISTO Questi kit sono destinati al da parte di personale opportunamente addestrato e qualificato per la rilevazione qualitativa di anticorpi anti Treponema pallidum in siero e plasma umano. Il prodotto può essere utilizzato per lo screening di donatori di sangue e per agevolare la diagnosi di pazienti con sospetta infezione da sifilide. 2. RIEPILOGO E ILLUSTRAZIONE DEL TEST La sifilide è un'infezione cronica che progredisce attraverso stadi distinti di infezione: primario, secondario, terziario e quaternario. Questi stadi producono sintomi clinici di vario tipo, tipicamente causando delle ulcere iniziali (cancrena) e quindi eruzione sifilitica seguita da lunghi periodi di latenza. L'infezione non trattata può infine causare problemi cardiovascolari e neurosifilide. L'infezione è sostenuta dalla spirocheta Treponema pallidum e si acquisisce generalmente con il rapporto sessuale, ma la malattia può trasmettersi anche con la trasfusione di sangue infetto. Si verificano anche infezioni intrauterine. L'organismo si è dimostrato praticamente impossibile da coltivare su supporti artificiali, e la diagnosi di infezione dipende in genere dalla conferma della presenza di anticorpi nel sangue, che compaiono poco dopo l'infezione iniziale e possono persistere per molti anni. I test della sifilide rientrano in quattro categorie: esame microscopico diretto, test degli anticorpi antitreponema, test non basati sugli anticorpi anti-treponema e test diretti dell'antigene. A causa dei lunghi periodi di latenza e della natura aspecifica dei test non basati sugli anticorpi anti-treponema, sono sempre più usati per lo screening i metodi che rilevano anticorpi anti-treponema specifici nei campioni di sangue. Syphilis Total Ab è uno di questi. 3. PRINCIPI DELLA PROCEDURA Syphilis Total Ab utilizza tre antigeni ricombinanti in un dosaggio di tipo "sandwich". Gli antigeni rileveranno IgG, IgM e IgA specifiche per T. pallidum, consentendo al test di rilevare gli anticorpi in tutti gli stadi dell'infezione. I pozzetti sono rivestiti con una miscela di antigeni ricombinanti 15Kd, 17Kd e 47Kd di T. pallidum. Gli anticorpi specifici presenti nei campioni di siero o plasma si combinano con questi antigeni e con gli stessi antigeni coniugati con perossidasi di rafano quando il coniugato è aggiunto a un pozzetto in cui è stato incubato il campione. Una volta eliminato il materiale non reattivo mediante lavaggio, la presenza dell'enzima legato, indicativa della presenza di anticorpi specifici nel campione, è dimostrata da una variazione cromatica della miscela substrato/cromogeno. L'intensità del colore viene confrontata con quella dei pozzetti di controllo per determinare la presenza o l'assenza di anticorpi specifici. [IT] 2

4 4. REAGENTI R1 R2 R3 R4 R6 R Descrizione Identificazione sull'etichetta Microplate Concentrated Washing Solution (20X) Negative control Positive control Conjugate Substrate buffer Descrizione Micropiastra 12 strip da 8 pozzetti ciascuna, rivestite con antigeni ricombinanti (rag) di T. pallidum Numero ID specifico = 97 Soluzione di lavaggio concentrata (20x) Tampone Tris NaCl ph 7,4 Conservante: ProClin 300 (0,04%) Controllo negativo Tampone Tris contenente BSA (siero di albumina bovina) Conservante: ProClin 300 (0,1%) Controllo positivo (umano) Siero umano contenente anticorpi anti T. pallidum, negativo per HIV1/2, HBs Ag e HCV, diluito in un tampone Tris contenente BSA (siero di albumina bovina) Conservante: ProClin 300 (0,1%) Coniugato T.pallidum rag / perossidasi Conservante: ProClin 300 (0,05%) Tampone substrato Soluzione di acido citrico e acetato di sodio, ph 4,0, contenente H 2 O 2 (0,015%) e dimetilsolfossido (DMSO) 4% Presentazione/ preparazione piastra Pronta per 70 ml Da diluire 2,1 ml Pronta per 1,6 ml Pronta per 8 ml Pronta per 60 ml Da ricostituire Presentazione/ preparazione piastre Pronte per 235 ml Da diluire 2,1 ml Pronta per 1,6 ml Pronta per 30 ml Pronta per 60 ml Da ricostituire R9 R10 Chromogen: TMB solution (11X) Stopping solution Cromogeno: soluzione TMB (rosa) Soluzione contenente 3,3, 5,5 tetrametilbenzidina (TMB) Soluzione bloccante Soluzione di acido solforico (H 2 SO 4 1N) 5 ml Da diluire 28 ml Pronta per 5 ml Da diluire 28 ml Pronta per 4.2. Requisiti di conservazione e trattamento Conservare questo kit a +2-8 C. Ogni articolo del kit conservato a +2-8 C può essere utilizzato fino alla data di scadenza riportata sulla confezione (fatto salvo laddove diversamente indicato). Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti R3, R4, R6, R8, R9 e R10 conservati a +2-8 C possono essere utilizzati fino alla data di scadenza riportata sulla confezione. [IT] 3

5 Identificazione R1 R2 R8+R9 Conservazione Dopo l'apertura del sacchetto sotto-vuoto, le strip di micropozzetti conservate a +2-8 C possono essere utilizzate per 1 mese nella confezione originale accuratamente risigillata. La soluzione di lavaggio diluita può essere conservata a C per 2 settimane. La soluzione di lavaggio concentrata (R2) può essere conservata a C. Dopo la ricostituzione, i reagenti conservati al buio possono essere utilizzati per 6 ore a temperatura ambiente (18-30 C). 5. AVVERTIMENTI E PRECAUZIONI Esclusivamente per uso diagnostico in vitro. Per uso professionale Precauzioni per la salute e la sicurezza: Questo kit di test deve essere maneggiato esclusivamente da personale adeguatamente addestrato e qualificato nelle procedure di laboratorio e cosciente dei potenziali rischi connessi. Indossare abbigliamento protettivo, guanti e protezioni per occhi/viso adeguati e manipolare gli oggetti in maniera appropriata nel rispetto della buona pratica di laboratorio. Il kit contiene componenti ematici umani. Il materiale di origine umana nella preparazione dei reagenti è stato testato ed è risultato non reattivo all'antigene di superficie dell'epatite B (HBs Ag), agli anticorpi dei virus dell'immunodeficienza umana (HIV-1 e HIV-2) e agli anticorpi del virus dell'epatite C (HCV). Nessun metodo di test conosciuto è in grado di garantire con assoluta certezza l'assenza di agenti infettivi. Tutti gli emoderivati umani, i reagenti e i campioni umani, pertanto, devono essere manipolati con la consapevolezza che si tratta di sostanze in grado di trasmettere malattie infettive ed è necessario seguire le precauzioni generali per gli agenti patogeni ematici raccomandate nel rispetto di tutte le normative locali, regionali e nazionali. Versamenti biologici: i versamenti di materiale di origine umana devono essere trattati come sostanze potenzialmente infettive. I versamenti non contenenti sostanze acide devono essere immediatamente decontaminati e asciugati. A questo scopo, disinfettare l'area in cui è avvenuto il versamento, i materiali ed eventuali superfici o apparecchiature contaminate utilizzando un disinfettante chimico appropriato efficace per i materiali a potenziale rischio biologico relativi ai campioni coinvolti (generalmente, una diluizione 1:10 di candeggina per uso domestico, 70-80% di etanolo o isopropanolo, uno iodoforo allo 0,5% quale Wescodyne Plus, ecc.). I versamenti contenenti sostanze acide devono essere adeguatamente assorbiti (asciugati con un panno) o neutralizzati, l'area deve essere lavata con acqua e asciugata; il materiale utilizzato per assorbire il versamento può richiedere lo smaltimento come rifiuto a rischio biologico. L'area deve essere quindi decontaminata con un disinfettante chimico. NOTA: non collocare le soluzioni contenenti candeggina in autoclave. Procedere allo smaltimento di tutti i campioni e i materiali utilizzati per l'esecuzione del test come potenzialmente infetti. I rifiuti di laboratorio, chimici o a rischio biologico devono essere manipolati e smaltiti nel rispetto di tutte le normative locali, regionali e nazionali. Per le raccomandazioni su precauzioni e rischi correlati ad alcuni componenti chimici del presente kit, consultare i simboli riportati sulle etichette e le informazioni fornite alla fine delle istruzioni per. La scheda di sicurezza è disponibile all'indirizzo [IT] 4

6 5.2. Precauzioni relative alla procedura Preparazione L'affidabilità dei risultati dipende dalla corretta implementazione delle seguenti pratiche di laboratorio corrette: Non utilizzare reagenti scaduti. Non mescolare, né unire reagenti appartenenti a numeri di lotto differenti all'interno di un unico ciclo. Prima del attendere 30 minuti che i reagenti si stabilizzino a temperatura ambiente (18-30 C). La denominazione del test e il numero di identificazione specifico del test stesso sono riportati sul telaio di ogni micropiastra. Questo numero di identificazione specifico è indicato anche su ogni strip. Syphilis Total Ab: Numero ID specifico = 97 Verificare il numero di identificazione specifico prima del. Qualora il numero di identificazione risulti mancante o diverso dal numero indicato corrispondente al dosaggio da testare, la strip non dovrà essere utilizzata. NOTA: per la soluzione di lavaggio (R2, identificazione etichetta: colore verde 20X), tampone di substrato di perossidasi (R8, identificazione etichetta: tampone TMB, colore blu), cromogeno (R9, identificazione etichetta: TMB 11X, color porpora) e soluzione bloccante (R10, identificazione etichetta: 1N colore rosso), è possibile utilizzare lotti diversi da quelli contenuti nel kit, fermo restando che venga utilizzato lo stesso lotto all'interno di un determinato ciclo di test. Tali reagenti possono essere utilizzati con alcuni altri prodotti della nostra azienda. Contattare l'assistenza tecnica per informazioni dettagliate. Ricostituire con cura i reagenti evitando eventuali contaminazioni. Utilizzare preferibilmente materiale monouso oppure vetreria perfettamente lavata e asciugata con acqua deionizzata. Non far asciugare la micropiastra nell'intervallo compreso fra la fine dell'operazione di lavaggio e la distribuzione del reagente. La reazione enzimatica è particolarmente sensibile agli ioni metallici. Di conseguenza, evitare che eventuali elementi di metallo entrino a contatto con le varie soluzioni contenenti coniugato o substrato. La soluzione di sviluppo (tampone substrato + cromogeno) deve essere di colore rosa. La variazione del colore rosa entro pochi minuti dalla ricostituzione indica che il reagente non può essere utilizzato e deve essere sostituito. La soluzione di sviluppo può essere preparata in un contenitore di vetro o in un vassoio di plastica monouso pre-lavato con 1N HCl, risciacquato accuratamente con acqua distillata e asciugato. Il reagente deve essere conservato al buio. Non utilizzare mai lo stesso contenitore per distribuire il coniugato e la soluzione di sviluppo Elaborazione Non modificare la procedura di dosaggio. Non eseguire il test in presenza di vapori reattivi (vapori acidi, alcalini e di aldeide) o polvere potenzialmente in grado di alterare l'attività enzimatica del coniugato. Utilizzare una nuova distribuzione per ciascun campione. Il lavaggio del pozzetto è una fase essenziale della procedura: attenersi al numero di cicli di lavaggio raccomandato e assicurarsi che tutti i pozzetti, una volta riempiti, vengano completamente svuotati. Un lavaggio inadeguato può condurre a risultati inesatti. Seguire attentamente le procedure di lavaggio descritte per ottimizzare le prestazioni del test. Con alcuni strumenti, potrebbe essere necessario ottimizzare la procedura di lavaggio (aumento del numero di cicli della fase di lavaggio e/o del volume di tamponi di lavaggio per ogni ciclo) per ottenere un livello accettabile di sfondo OD per il campione negativo. Per gli adattamenti e le procedure speciali contattare l'azienda. [IT] 5

7 6. CAMPIONI Prelevare un campione di sangue secondo le pratiche correnti. Il test dovrà essere eseguito su plasma o siero non diluito (prelevato da EDTA, citrato di sodio, eparina sodica o ACD) I campioni contenenti aggregati devono essere chiarificati tramite centrifugazione prima del test. I campioni devono essere conservati a +2-8 C se il test sarà eseguito entro 7 giorni, oppure a -20 C per un periodo più lungo. Non ripetere più di 5 cicli di congelamento/scongelamento. E' possibile utilizzare campioni sottoposti a trattamento termico a 56 C per 1/2 ora. I campioni contenenti fino a 120 g/l di albumina, 200 mg/l di bilirubina, 33 g/l di trioleina o 2 g/l di emoglobina non compromettono i risultati. Si sconsiglia tuttavia di utilizzare campioni di siero o plasma iperlipemici o iperemolizzati. I campioni devono essere scongelati e miscelati accuratamente prima del test. Per essere spediti, i campioni devono essere confezionati in conformità con le disposizioni vigenti in materia di trasporto di agenti eziologici e trasportati preferibilmente congelati. 7. PROCEDURA 7.1. Materiali necessari ma non forniti Acqua distillata. Ipocloruro di sodio (candeggina per uso domestico) e bicarbonato di sodio. Carta assorbente. Guanti monouso. Occhiali di sicurezza. Provette monouso. Pipette o multipipette automatiche o semi-automatiche, regolabili o preimpostate per misurare e dispensare 50 μl, 1 ml e 10 ml. Cilindri graduati da 100 ml e 1 l. Sistema di lavaggio automatico, semi-automatico o manuale per micropiastre (*). Incubatore per micropiastre dotato di termostato impostato a 37 C ± 1 C (*). Contenitore per rifiuti biologici potenzialmente pericolosi. Lettore di micropiastre dotato di filtri 450, 490 nm e nm (*). (*) Per informazioni dettagliate sull'apparecchiatura raccomandata, consultare il nostro reparto tecnico Preparazione dei reagenti Reagenti pronti al Reagente 1 (R1): Micropiastra Ogni supporto del telaio contenente 12 strip è avvolto in un sacchetto di alluminio laminato sigillato. Tagliare il sacchetto con le forbici o un bisturi 0,5-1 cm sopra la sigillatura. Aprire il sacchetto ed estrarre il telaio. Riporre le strip inutilizzate nel sacchetto. Chiudere con cura il sacchetto e conservarlo a +2-8 C. Reagente 3 (R3): Controllo negativo Reagente 4 (R4): Controllo positivo Reagente 6 (R6): Coniugato Omogeneizzare capovolgendo prima del. Reagente 10 (R10): Soluzione bloccante [IT] 6

8 Reagenti per ricostituire Reagente 2 (R2): Soluzione di lavaggio concentrata (20x) Diluire 1:20 in acqua distillata per ottenere una soluzione di lavaggio pronta al. Preparare 800 ml per una piastra di 12 strip. Reagente 8 (R8) + Reagente 9 (R9): Soluzione di sviluppo dell'enzima Diluire 1:11 il cromogeno (R9) nel tampone di substrato (per es. 1 ml di reagente R ml di reagente R8) poiché 10 ml sono necessari e sufficienti a trattare 12 strip. Omogeneizzare Procedura di dosaggio Attenersi rigorosamente alla procedura. Utilizzare sieri di controllo negativo e positivo per ogni test al fine di confermarne la qualità. Attenersi alle pratiche di laboratorio corrette di seguito riportate: 1) Determinare attentamente il piano di identificazione e distribuzione del campione. 2) Preparare la soluzione di lavaggio R2 diluita. 3) Estrarre il telaio di supporto e il numero di strip necessarie (R1) dalla confezione protettiva. Riporre le strip inutilizzate nella confezione. Chiudere la confezione e riporla a +2-8 C. 4) Distribuire nel pozzetto nel seguente ordine (distribuzione consigliabile sulla piastra): 50 μl di controllo negativo (R3) in A1, B1, C1 50 μl di controllo positivo (R4) in D1, E1 50 μl di campione non diluito in ciascun pozzetto, F1, G1, ecc. 50 μl di coniugato (R6) in ciascun pozzetto A seconda del sistema impiegato, è possibile modificare la posizione dei controlli o l'ordine di distribuzione. Omogeneizzare la miscela di reazione con almeno 3 aspirazioni o con un agitatore per micropiastre per 5 secondi. NOTA: la distribuzione di campioni e controlli può essere controllata visivamente in questa fase della manipolazione: vi è una netta differenza di colorazione tra il pozzetto vuoto e il pozzetto contenente il campione. Distribuire il coniugato entro 5 minuti dalla distribuzione dei campioni. Vi è una netta differenza di colorazione tra un pozzetto vuoto e un pozzetto contenente la soluzione di coniugato rossa (R6) (fare riferimento a 7.7). 5) Se possibile, coprire la piastra con una nuova pellicola adesiva. 6) Incubare la micropiastra per minuti a 37 C ± 1 C. 7) Se necessario, rimuovere la pellicola adesiva. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti liquidi e aggiungere almeno 370 µl di soluzione di lavaggio in ogni pozzetto. Aspirare nuovamente e ripetere il lavaggio almeno 4 volte (5 cicli di lavaggio in totale). Il volume residuo deve essere inferiore a 10 μl (se necessario, asciugare le strip capovolgendole su carta assorbente). Se si dispone di un sistema di lavaggio automatico, seguire lo stesso ciclo operativo. NOTA: procedere alla fase di lavaggio entro 20 minuti. 8) Preparare la soluzione di sviluppo (reagente R8 + R9). 9) Distribuire rapidamente in ciascun pozzetto 50 μl della soluzione di sviluppo (R8 + R9) preparata appena prima del. Far sviluppare la reazione al buio per minuti a temperatura ambiente (18-30 C). Non utilizzare pellicole adesive durante questo periodo di incubazione. NOTA: in questa fase della manipolazione si può controllare visivamente la distribuzione della soluzione di sviluppo, di colore rosa. Vi è una netta differenza di colorazione tra un pozzetto vuoto e un pozzetto contenente la soluzione substrato rosa (fare riferimento a 7.7). [IT] 7

9 10) Aggiungere 50 μl di soluzione bloccante (R10) utilizzando la stessa sequenza e la stessa velocità di distribuzione usata per la soluzione substrato. Omogeneizzare la miscela di reazione. NOTA: in questa fase di manipolazione si può controllare visivamente la distribuzione della soluzione bloccante incolore. Il colore del substrato, rosa (per i campioni negativi) o blu (per quelli positivi), sbiadisce dai pozzetti che diventano incolori (per i campioni negativi) o gialli (per quelli positivi) dopo l'aggiunta della soluzione bloccante. 11) Asciugare accuratamente il fondo di ogni piastra. Attendere almeno 4 minuti dopo l'aggiunta della soluzione bloccante, ed entro 30 minuti dal blocco della reazione leggere la densità ottica a 450/ nm con un lettore per piastre. 12) Verificare la corrispondenza tra lettura spettrofotometrica e visiva e rispetto al piano di identificazione e distribuzione di piastra e campione Controllo qualità Utilizzare il controllo negativo (R3) e il controllo positivo (R4) a ogni esecuzione del test per confermarne i risultati (fare riferimento a 7.5) Criteri di validazione del test Il test è confermato se le condizioni seguenti sono rispettate: 1) Per il controllo negativo R3: O.D. R3 0,080 Se uno dei valori di controllo è superiore a questo valore, ignorare il valore e ripetere il calcolo con i due valori di controllo negativo restanti. 2) Per il controllo positivo R4: O.D. R4 0, Calcolo/Interpretazione dei risultati Il cut-off si determina con il controllo negativo R3: Calcolare il valore dell'assorbanza media misurata per il controllo negativo R3 e calcolare il valore di cut-off (COV) come segue: COV = media O.D. R3 + 0,100 I campioni con O.D. inferiore al COV sono considerati negativi da Syphilis Total Ab. I risultati appena al di sotto del valore di cut-off (COV -10% < O.D. < COV) devono però essere interpretati con cautela. È consigliabile ritestare in duplicato i campioni corrispondenti quando consentito da sistemi e procedure di laboratorio. I campioni con O.D. superiore o uguale al COV sono considerati positivi da Syphilis Total Ab e devono essere ritestati in duplicato prima dell'interpretazione finale. I campioni ritestati superiori al COV in almeno uno dei duplicati sono considerati positivi e devono essere ulteriormente valutati. I campioni inferiori al cut-off in entrambi i duplicati sono considerati negativi. In caso di densità ottica molto bassa dei campioni testati (O.D. negativa) e quando si controlla la presenza di campioni e reagente, i risultati possono essere interpretati come negativi. Si consiglia di confermare i campioni positivi seguendo le attuali raccomandazioni nazionali e gli algoritmi Verifica spettrometrica del pipettaggio di campione e coniugato (facoltativa) Campioni e controlli È possibile verificare la presenza dei campioni e dei controlli nel pozzetto tramite lettura automatica a 450/620 nm. [IT] 8

10 Un pozzetto con l'aggiunta del campione avrà una O.D. compresa tra 0,050 e 1,100. Coniugato Il coniugato è di colore rosso. È possibile verificare la presenza di coniugato nei pozzetti tramite lettura automatica a 450/620 nm. Un pozzetto contenente campione e coniugato avrà una O.D. 1,200. Verifica del pipettaggio della soluzione di sviluppo È possibile verificare la presenza della soluzione di sviluppo rosa nel pozzetto tramite lettura automatica a 492 nm. Un pozzetto con soluzione di sviluppo deve avere una densità ottica > 0,100 (una O.D. inferiore indica una scarsa dispensazione della soluzione di sviluppo). 8. LIMITAZIONE DEL TEST Come per tutti i test sierologici della sifilide, l'interpretazione dei risultati ottenuti con il dosaggio Syphilis Total Ab EIA deve essere utilizzata congiuntamente ai sintomi clinici, all'anamnesi medica e ad altri risultati di laboratorio del paziente al fine di elaborare una diagnosi clinica complessiva. Non è disponibile un singolo test o uno standard di riferimento definitivo per ogni stadio della malattia. La diagnosi di sifilide si basa dunque prevalentemente sui test sierologici e richiede i risultati di metodi troponema-specifici e non. Nessun test diagnostico offre l'assoluta certezza che un campione non contenga bassi livelli di anticorpi anti-t. pallium, come quelli presenti nella primissima fase dell'infezione. Un risultato negativo ottenuto in qualsiasi momento non esclude quindi la possibilità di esposizione all'infezione da sifilide. Qualsiasi tecnica ELISA può produrre reazioni con falsi positivi. Si consiglia di verificare la specificità della reazione di qualsiasi campione risultato positivo ripetibile, secondo i criteri di interpretazione del kit Syphilis Total Ab, applicando un metodo idoneo: dosaggio di emoagglutinazione di Treponema pallidum- Tutti i risultati dei test treponema-specifici tendono a rimanere reattivi in seguito all'infezione da treponema, e non devono quindi essere usati per valutare la risposta alla terapia. A causa della reattività persistente, generalmente per l'intera vita del paziente, i test treponema-specifici non hanno nessun valore al fine di determinare la recidiva o la re-infezione in un paziente che ha avuto un risultato reattivo. In tal caso, si raccomanda di usare altri dosaggi: Syphilis IgM EIA, RPR e TPHA. L'uso della spettrometria per la verifica della deposizione del campione e della soluzione di sviluppo del coniugato non consente di verificare la precisione del volume di campioni e coniugato dispensato. Questo metodo mostra soltanto la presenza del campione e del coniugato. La percentuale di errore con questo metodo è strettamente associata alla precisione del sistema utilizzato (un coefficiente cumulativo di variazione superiore al 10% per distribuzione e lettura ridurrà notevolmente la qualità di questa fase). 9. CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI 9.1. Misurazione di precisione La ripetibilità e la precisione intermedia sono state determinate utilizzando campioni con diverse concentrazioni di anticorpi anti-sifilide. I campioni sono stati testati 30 volte durante la stessa serie di test per determinare la ripetibilità. I campioni sono stati inoltre testati in duplicato per un periodo di 20 giorni in 2 test al giorno. Sono stati calcolati medie dei rapporti, deviazioni standard e coefficienti di variazione (CV). [IT] 9

11 Ripetibilità: Campioni N Media dei rapporti Deviazione standard CV % Basso negativo 30 0,14 0,014 9,5% Alto negativo 30 0,68 0,051 7,5% Basso positivo anticorpi sifilide 30 1,90 0,070 3,7% Positivo anticorpi sifilide 30 3,76 0,130 3,5% I CV ottenuti sui campioni positivi sono inferiori al 10% Precisione intermedia Campioni N Media dei rapporti Intradosaggio Interdosaggio/operatore In giornata Riproducibilità totale DS CV % DS CV % DS CV % DS CV % Basso negativo 80 0,15 0,035 22,5% 0,023 14,7% 0,017 10,9% 0,045 29,0% Alto negativo 80 0,74 0,038 5,1% 0,074 10,0% 0,006 0,8% 0,084 11,2% Basso positivo anticorpi sifilide Positivo anticorpi sifilide 80 2,30 0,112 4,9% 0,312 13,5% 0,099 4,3% 0,346 15,0% 80 4,13 0,180 4,3% 0,543 13,1% 0,195 4,7% 0,604 14,6% I CV ottenuti sui campioni positivi sono inferiori o uguali al 15% Prestazioni cliniche Le prestazioni cliniche del dosaggio Syphilis Total Ab sono state determinate testando i campioni in studi prospettici e retrospettivi: Studio prospettico: campioni da donatori di sangue selezionati casualmente; campioni di pazienti con sospetta sifilide Studio retrospettivo: campioni positivi da pazienti con STD. Gli studi si sono svolti presso 2 centri di donazione di sangue, un centro per STD (malattie a trasmissione sessuale) e la sede Bio-Rad Specificità diagnostica Lo studio è stato svolto su campioni di siero e plasma EDTA prelevati presso 2 banche del sangue da donatori casuali in Francia. È stato inoltre eseguito uno studio di specificità su campioni di pazienti. Tutti i risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti con altri test della sifilide con marchio CE. [IT] 10

12 Tabella 1: Test di specificità (IR = reattivo iniziale; RR = reattivo ripetuto) Popolazio ne Donatori di sangue Struttura #1 + #2 Tipo di campione Numero totale di campioni Reattivo iniziale (IR) Reattivo ripetuto (RR) Specificità RR (%) Siero SST * 3125/3125 Plasma EDTA K * 2066/2066 Totale * Pazienti #3 Siero % 5191/ ,72% 350/351 95% IC (%) 99,93% 100% 98,42 100% *I campioni reattivi ripetuti risultati positivi con altri dosaggi EIA per la sifilide con marchio CE sono stati esclusi dal calcolo della specificità diagnostica Sensibilità diagnostica Studio retrospettivo: Lo studio è stato eseguito su 350 campioni congelati, di cui 2 sono stati dichiarati negativi e 348 si sono confermati positivi con i dosaggi della sifilide con marchio CE. Di questi 348 campioni positivi, 7 provenivano da pazienti nella fase iniziale dell'infezione. Tutti i 348 campioni sono risultati positivi con il dosaggio Bio-Rad Syphilis Total Ab. Studio prospettico: 460 campioni freschi in totale sono stati valutati con il dosaggio Bio-Rad Syphilis Total Ab e confrontati con test della sifilide con marchio CE. 348 sono risultati negativi con il test Bio-Rad e con i test di riferimento (due campioni sono risultati falsi positivi con il test EIA di riferimento) 109 sono risultati positivi con entrambi i test. 3 campioni hanno mostrato risultati discrepanti (dopo la ripetizione del test con il dosaggio Bio-Rad): 1 campione positivo con il dosaggio Bio-Rad e alto negativo con i test di riferimento. Questo campione con bassi livelli di sifilide si trovava in corrispondenza del valore di cut-off con entrambi i test EIA: 1 campione positivo con i test di riferimento e negativo con il dosaggio Bio-Rad (da 1 paziente senza segni) 1 campione positivo con i test di riferimento, negativo con IR e positivo nella ripetizione del test con il dosaggio Bio-Rad. Studi retrospettivi e prospettici: La sensibilità diagnostica globale è pari al 99,56% (457/459) con un intervallo di confidenza al 95% di [98,44% - 99,95%]. Sensibilità clinica E' stata inoltre studiata la sensibilità clinica su 3 gruppi commerciali e 1 gruppo di sieroconversione. Il dosaggio Bio-Rad Syphilis Total Ab è stato confrontato con un dosaggio della sifilide con marchio CE. La rilevazione di ciascun campione dei gruppi è risultata equivalente con il dosaggio Bio-Rad e il dosaggio della sifilide di riferimento Sensibilità analitica La sensibilità analitica è stata valutata rispetto a 2 standard NIBSC e calcolata al valore di cut-off mediante una regressione: 1. Il limite di rilevazione di IgG / IgM è stato valutato su 3 lotti del dosaggio Syphilis Total Ab ed è stato stimato pari a 0,53 miu/ml con IC 95% [0,10 miu/ml 1,30 miu/ml] utilizzando IgM/IgG standard OMS (codice NIBSC 05/132). 2. Il limite di rilevazione di IgG è stato valutato su 1 lotto del dosaggio Syphilis Total Ab ed è stato stimato pari a 0,11 miu/ml con IC 95% [0,02 miu/ml 0,27 miu/ml] utilizzando IgG standard OMS (codice NIBSC 05/122). [IT] 11

13 9.4. Specificità analitica / studio di reattività crociata Sono stati testati con il dosaggio Syphilis Total Ab 125 campioni in totale potenzialmente interferenti contenenti anticorpi contro patogeni che possono causare malattie infettive (Lyme, toxoplasmosi, EBV, leptospirosi, LES (lupus), anticorpi anti-epatite A, anticorpi anti-epatite B, anticorpi anti-epatite C, HTLV I/II e HIV), campioni da un gruppo di pazienti ad alto rischio (donne in gravidanza e donne multipare) o campioni di pazienti con disturbi immunitari (fattori reumatoidi). Dei 125 campioni testati, 1 campione è risultato positivo ripetibile con il dosaggio Syphilis Total Ab, e ne è stata confermata la positività effettiva con altri dosaggi EIA CE per la sifilide e test confirmatori. La specificità osservata in questa popolazione target è pari al 100% (124/124), con intervallo di confidenza al 95% di [97,1% - 100,0%] Effetto gancio È stata studiata l'esistenza di un possibile effetto gancio testando 6 campioni positivi alla sifilide con titoli alti a varie diluizioni. L'equivalenza dei risultati osservati tra i campioni diluiti e non diluiti mostra l'assenza dell'effetto gancio sui campioni testati. 10. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI. 1. Levinson SS. The Nature of Heterophilic Antibodies and Their Role in Immunoassay Interference. J. Clin. Immunoassay 15: , Norris S.J. Plypeptides of Treponema pallidum: Progress toward understanding their structural, functional and immunological role. Microbiological Reviews, Setpt Vol Larsen SA, Steiner BM, and Rudolph AH. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. Clin Microbiol Rev Jan; 8(1): Zrein M, Maure I, Boursier F, Soufflet L. Recombinant antigen-based enzyme immunoassay for screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine. J Clin Microbol Mar; 33(3): Singh AE and Romanowski. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiological, and some biologic features. Clin Microbiol Rev Apr; 12(2): Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem Lab Med : International Journal of STD & AIDS 2009; 20: Screening donated Blood for Transfusion-Transmissible infections. World Health Organization M. J. Loeffelholz, and M. J. Binnicker, It Is Time to Use Treponema-Specific Antibody Screening Tests for Diagnosis of Syphilis, J Clin Microbiol, 50 (2012), 2-6. [IT] 12

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