XII Congresso Nazionale S.I.Di.L.V.

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1 SOCIETÀ ITALIANA DI DIAGNOSTICA DI LABORATORIO VETERINARIA XII Congresso Nazionale S.I.Di.L.V. Genova Magazzini del Cotone Ottobre 2010 VOLUME DEGLI ATTI 1

2 SCHEMA DI ACCREDITAMENTO FLESSIBILE APPLICATO ALLE ANALISI BIOMOLECOLARI: ESPERIENZA DEL LABORATORIO OGM Verginelli D., Quarchioni C., Bonini P., Fusco C., Peddis S., Misto M., Marchesi U., Gatto F., Paternò A., Ciabatti I., Amaddeo D. Istituto Zooprofi lattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana, Laboratorio Nazionale di Riferimento OGM, Roma Key Words: OGM, Accreditamento, Validazione SUMMARY Quality assurance is necessary for providing reliable and accurate results in food and feed analysis. Laboratory accreditation according to ISO/IEC is mandatory for the GMO-testing laboratory. Accreditation may be based on either a fi xed-scope or a fl exible-scope. Since an increasing number of new GMOs are entering the market and new detection and quantifi cation methods are progressively required, the fl exible scope of accreditation allows to react promptly to the rapidly evolving analytical needs. Experiences in its implementation are herewith described. INTRODUZIONE L analisi degli OGM nell alimentazione umana ed animale, al fi ne di fornire risultati accurati ed affi dabili, deve attuare un sistema qualità secondo la norma ISO/IEC Nell Unione Europea i laboratori del controllo uffi ciale di alimenti e mangimi devono essere accreditati (Reg. CE 882/2004). Il laboratorio che deve applicare la norma deve adottare un sistema detto schema di accreditamento. Nella grande maggioranza dei casi l accreditamento viene effettuato secondo uno schema rigido, dove il laboratorio è accreditato per una serie di prodotti o materiali testati, per i metodi usati e per le analisi effettuate, e non è permessa nessuna modifi cazione o integrazione nella lista dei metodi accreditati senza che il laboratorio venga sottoposto ad una nuova verifi ca da parte dell ente di accreditamento nazionale. Questo schema è adatto ai laboratori che effettuano analisi di routine e che utilizzano metodi standard. Negli ultimi anni si è reso necessario un approccio di tipo fl essibile defi nito anche accreditamento per tipo di prova, dove si defi nisce un g ppo di prove caratterizzate dall utilizzo di metodi simili applicate ad uno specifi co settore: in tal caso, l introduzione di nuovi metodi o la modifi ca di metodi esistenti in accreditamento non comporta per ii laboratorio una nuova verifi ca ispettiva, purché il laboratorio dimostri un elevata competenza tecnico-scientifi ca (1-5). Questo sistema è adatto a laboratori con una forte componente di ricerca e sviluppo di metodi analitici, come ad esempio i laboratori OGM, dove la progressiva introduzione di eventi GM autorizzati sul mercato richiede che nuovi metodi di screening, rilevazione e quantifi cazione vengano rapidamente validati ed accreditati. Nel presente lavoro vengono descritte le procedure adottate per la validazione di metodi PCR real time per la determinazione analitica degli OGM e per la trasformazione del proprio schema di accreditamento da rigido a fl essibile. MATERIALI E METODI -Matrici utilizzate Sono stati esaminati i materiali di riferimento certifi cati IRMM o AOCS di eventi GM delle seguenti specie vegetali: soia (3 eventi), mais (12 eventi), cotone (4 eventi), colza (4 eventi), barbabietola da zucchero (1 evento) per un totale di 24 eventi. -Estrazione del DNA L estrazione del DNA è stata effettuata con la metodica CTAB precipitante secondo la ISO 21571:2005(E). -Primer utilizzati nelle prove I primer utizzati per la PCR real time nelle prove di screening (terminatore NOS, gene nptii, gene pat, gene cp4-epsps, costrutto ctp-cp4epsps) sono stati ricavati dalla letteratura, ad eccezione dei primer per il promotore 35S che sono stati sviluppati in house. I primers utizzati per la PCR real time nelle prove di tipizzazione e quantifi cazione dei singoli eventi GM sono indicati sui protocolli e report di validazione pubblicati dal laboratorio europeo di riferimento (EURL) sul sito statusofdoss.htm -Verifica dell estrazione e controllo di qualità del DNA estratto La qualità del DNA estratto è stata valutata mediante lettura spettrofotometrica, calcolando il rapporto tra le assorbanze a 260 nm e 280 nm, e tramite una inhibition run per il gene endogeno della specie vegetale del campione (6) per verifi care l eventuale presenza di inibitori della reazione di amplifi cazione. VALIDAZIONE DEI METODI: I parametri da verifi care sono i seguenti: Parametro Prove qualitative Limite di rivelazione (LOD) Limite di quantificazione (LOQ) Precisione Esattezza Sensibilità Specificità Linearità Efficienza di amplificazione Robustezza Prove quantitative -Determinazione del Limite di rilevabilità (LOD) - Viene effettuata una PCR real time su diluizioni seriali di DNA bersaglio (analita) per ottenere 6 livelli di concentrazione. La PCR viene eseguita su 20 replicati per ogni livello di diluizione. Il calcolo del LOD si ottiene determinando il livello minimo di concentrazione del DNA bersaglio per cui almeno il 95% dei replicati risulta positivo (19 su 20 nel caso di 20 replicati per livello di diluizione). -Determinazione del Limite di quantificazione (LOQ)- Vengono utilizzati i valori di Ct ottenuti dalle piastre allestite per la determinazione del LOD. Vengono selezionati i livelli di concentrazione per i quali si sono ottenuti dei valori di Ct utili nel 100% dei replicati. Si ricava il Ct medio per ciascun livello utile di concentrazione e si calcola la retta di calibrazione Ct contro log (n. copie genomiche). Dalla retta di calibrazione viene calcolato, per ciascun replicato, il numero di copie di DNA geneticamente modifi cato corrispondente al valore del Ct. Dal numero di copie di DNA geneticamente modifi cato per ciascun replicato 392

3 viene calcolato il valor medio per livello di concentrazione ed il corrispondente scarto tipo; quindi si calcola lo scarto tipo relativo di ripetibilità (RSDr). IL LOQ viene determinato come il più basso numero di copie di DNA geneticamente modifi cato al quale lo scarto tipo relativo di ripetibilità (RSDr) è risultato 25%. -Determinazione della Sensibilità e Specificità- Si allestisce una piastra di PCR su DNA estratti da materiali di riferimento contenenti (veri positivi) o non contenenti (veri negativi) il bersaglio analitico. Verifi cando la corrispondenza tra il numero di positivi al test ed il numero di positivi attesi si determina la sensibilità, mentre verifi cando la corrispondenza tra il numero di negativi al test ed il numero di negativi attesi si determina la specifi cità. -Determinazione della Robustezza- La robustezza viene determinata verifi cando la concordanza, tramite t test, dei risultati ottenuti variando il volume di reazione, lo strumento e l operatore. -Determinazione della Precisione- La Precisione viene valutata in condizioni di ripetibilità intermedia su due livelli di concentrazione diversi (0,1 e 1 % GM). Ogni materiale di riferimento viene estratto in cinque replicati in almeno due sessioni di lavoro differenti da operatori diversi; ciascun estratto viene esaminato in PCR real time. La ripetibilità intermedia si valuta calcolando la media e lo scarto tipo dei valori percentuali ottenuti per lo stesso livello di concentrazione nelle due sessioni di lavoro; quindi si determina lo scarto tipo relativo RSDr. Criterio di accettabilità: l RSDr dovrebbe essere 35% sui due livelli di concentrazione saggiati. -Determinazione dell Esattezza- Vengono utilizzati i valori di Ct ottenuti dalle piastre allestite per la determinazione della precisione. Si calcola la media e lo scarto tipo dei valori percentuali (0,1 e 1% GM) ottenuti da tutti i replicati di estrazione per lo stesso livello di concentrazione. E così possibile calcolare lo scostamento (bias) dal valore certifi cato e lo scostamento relativo percentuale. Criterio di accettabilità: scostamento relativo 25%. -Determinazione della Linearità - La linearità delle reazioni dei sistemi transgenico ed endogeno si può valutare calcolando il valore medio degli indici R 2 delle rette di calibrazione ottenuti da almeno tre prove indipendenti. Criterio di accettabilità: R2 0,98 -Determinazione della Efficienza di amplificazione- Nei metodi PCR real time quantitativi tale parametro è misurabile per ciascun sistema di amplifi cazione sfruttando la seguente relazione funzionale: ove pendenza (slope) è la media dei valori di pendenza delle rette di calibrazione ottenuti da almeno quattro prove indipendenti. Criterio di accettabilità: -3,1 pendenza -3,6 (110,2% effi cienza 89,6%). Risultati e DISCUSSIONE La progressiva immissione sul mercato di eventi GM autorizzati richiede che vengano continuamente sviluppati, validati, accreditati ed adottati nuovi metodi analitici. Già ad oggi il nostro laboratorio impiega 7 metodi per il rilevamento di specie vegetali, 6 metodi di screening, 24 metodi per la determinazione qualitativa evento-specifi ca e 24 metodi per la determinazione quantitativa di OGM autorizzati, nonché 3 metodi per la determinazione di eventi non autorizzati. Tali numeri sono destinati ad aumentare, in considerazione che sono in corso le procedure di autorizzazione di nuovi OGM. In tale contesto, lo schema di accreditamento rigido rappresenta un ostacolo considerevole alla necessità del laboratorio OGM di adeguare rapidamente la propria offerta analitica all evoluzione del quadro autorizzativo. Viceversa, uno schema fl essibile consente al laboratorio, in tempi molto più rapidi, di estendere l accreditamento a nuove prove che siano state opportunamente validate. In tal caso, il laboratorio deve essere in grado di dimostrare, all ente nazionale di accreditamento, la propria competenza tecnico-scientifi ca, in particolare per quanto concerne la validazione dei metodi. Ciò non è di poca rilevanza, specialmente se si considera che a tutt oggi, le linee guida in tale ambito, riconosciute a livello internazionale, sono limitate e talvolta non concordanti sulle procedure da seguire. Per quanto riguarda la validazione dei metodi di quantifi cazione per gli OGM, questa viene regolarmente effettuata, mediante studi collaborativi, dal Laboratorio Europeo di Riferimento (EURL) così come previsto dal Reg. CE 1829/2003. I laboratori del controllo uffi ciale OGM devono comunque verifi care che i metodi validati dall EURL siano correttamente applicati nel proprio laboratorio. La validazione dei metodi specifi ci per i geni endogeni delle diverse specie vegetali, dei metodi di screening e delle prove qualitative evento-specifi che è invece stata, ad oggi, a carico dei singoli laboratori uffi ciali. In tale complessa attività, questi ultimi devono affrontare una serie di diffi coltà, specialmente nel passaggio da uno schema di accreditamento rigido ad uno fl essibile: defi nire e, ove possibile, armonizzare le procedure di dettaglio per la validazione dei metodi; validare e armonizzare i sistemi di rilevamento dei geni endogeni (laddove in letteratura e nei protocolli validati dall EURL più target endogeni vengono proposti per una stessa specie vegetale); armonizzare i sistemi di quantifi cazione mediante PCR real time (tra Ct e quantifi cazione assoluta); armonizzare altri parametri quali la quantità di DNA esaminato, i volumi di reazione ed i reagenti utilizzati. Attualmente il nostro laboratorio è impegnato nella trasformazione di uno schema di accreditamento rigido in uno fl essibile, così come schematizzato nella seguente tabella: Tipo di prova PCR specie-specifi ca 5 PCR di screening 6 TIPIZZAZIONE mais GM 12 TIPIZZAZIONE soia GM 3 TIPIZZAZIONE colza GM 4 TIPIZZAZIONE cotone GM 4 TIPIZZAZIONE barbabietola da zucchero GM 1 PCR QUANTITATIVA mais GM 12 PCR QUANTITATIVA soia GM 3 PCR QUANTITATIVA colza GM 4 PCR QUANTITATIVA cotone GM 4 PCR QUANTITATIVA barbabietola da zucchero GM 1 N di target 393

4 Ciò consentirà di espandere rapidamente la nostra offerta analitica in accreditamento, sia in termini di nuovi eventi GM da ricercare, sia in termini di nuove matrici da esaminare. L Ente Europeo di Accreditamento (EA) incoraggia i laboratori all utilizzo dello schema fl essibile di accreditamento (7). Riferimenti bibliografici 1. Leclercq A (2002) Accred Qual Assur 7: Steffen B. (2002) Accred Qual Assur 7: Cankar et al., (2006) BMC Biotechnol 6: Zel et al., (2006) Accred Qual Assur 10: Zel et al., (2008) Food Anal. Methods 1:61-72 Defi nition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO testing European Network of GMO Laboratories. ec.europa.eu/doc/min_perf_requirements_ Analytical_methods.pdf EA-2/15 EA Requirements for the Accreditation of Flexible Scope 394

5 SCHEMA DI ACCREDITAMENTO FLESSIBILE APPLICATO ALLE ANALISI BIOMOLECOLARI: ESPERIENZA DEL LABORATORIO OGM Verginelli D., Quarchioni C., Bonini P., Fusco C., Peddis S., Misto M., Marchesi U., Gatto F., Paternò A., Ciabatti I., Amaddeo D. Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana, Laboratorio Nazionale di Riferimento OGM, Roma INTRODUZIONE Rigido Per specifici prodotti o materiali, per specifici metodi di prova Non sono permesse modifiche o integrazioni nella lista dei metodi accreditati senza una verifica dell ente di accreditamento Adatto a laboratori che effettuano solo analisi di routine con prove altamente standardizzate OBIETTIVO DEL LAVORO Descrizione delle procedure adottate per la validazione di metodi PCR real time per la determinazione analitica degli OGM e per la trasformazione del proprio schema di accreditamento da rigido a flessibile. VALIDAZIONE DEI METODI: I parametri da verificare sono descritti in tabella: SCHEMA DI ACCREDITAMENTO Flessibile o per tipo di prova Per gruppi di prove caratterizzate dall impiego di metodi simili ed applicate ad uno specifico settore Sono permesse modifiche o integrazioni in qualsiasi momento Il laboratorio deve dimostrare un elevata competenza tecnico-scientifica Adatto a laboratori con una forte componente di ricerca e sviluppo di nuovi metodi analitici Parametro Prove qualitative Prove quantitative Criteri di accettabilità Limite di rivelazione (LOD) a a < 1/20 valore di legge Limite di quantificazione (LOQ) a < 1/10 valore di legge con un RSDr 25% Precisione a RSDr circa 35% su due livelli di concentrazione saggiati Esattezza a BIAS 25% Sensibilità a a 100% risultato atteso Specificità a a 100% risultato atteso Linearità a R 2 0,98 Efficienza di amplificazione a -3,1 pendenza -3,6 (110,2% efficienza 89,6%) Robustezza a a 30% del valore di riferimento RISULTATI E DISCUSSIONE Lo schema di accreditamento rigido rappresenta un ostacolo considerevole alla necessità del laboratorio OGM di adeguare rapidamente la propria offerta analitica all evoluzione del quadro autorizzativo. Viceversa, uno schema flessibile consente al laboratorio, in tempi molto più rapidi, di estendere l accreditamento a nuove prove che siano state opportunamente validate. In tal caso, il laboratorio deve essere in grado di dimostrare, all ente nazionale di accreditamento, la propria competenza tecnico-scientifica, in particolare per quanto concerne la validazione dei metodi. Ciò non è di poca rilevanza, specialmente se si considera che a tutt oggi, le linee guida in tale ambito, riconosciute a livello internazionale, sono limitate e talvolta non concordanti sulle procedure da seguire. Per quanto riguarda la validazione dei metodi di quantificazione per gli OGM, questa viene regolarmente effettuata, mediante studi collaborativi, dal Laboratorio Europeo di Riferimento (EURL) così come previsto dal Reg. CE 1829/2003. I laboratori del controllo ufficiale OGM devono comunque verificare che i metodi validati dall EURL siano correttamente applicati nel proprio laboratorio. La validazione dei metodi specifici per i geni endogeni delle diverse specie vegetali, dei metodi di screening e delle prove qualitative evento-specifiche è invece stata, ad oggi, a carico dei singoli laboratori ufficiali. In tale complessa attività, questi ultimi devono affrontare una serie di difficoltà, specialmente nel passaggio da uno schema di accreditamento rigido ad uno flessibile: definire e, ove possibile, armonizzare le procedure di dettaglio per la validazione dei metodi; validare e armonizzare i sistemi di rilevamento dei geni endogeni (laddove in letteratura e nei protocolli validati dall EURL più target endogeni vengono proposti per una stessa specie vegetale); armonizzare i sistemi di quantificazione mediante PCR real time (tra Ct e quantificazione assoluta); armonizzare altri parametri quali la quantità di DNA esaminato, i volumi di reazione ed i reagenti utilizzati. Attualmente il nostro laboratorio è impegnato nella trasformazione di uno schema di accreditamento rigido in uno flessibile, così come schematizzato nella seguente tabella: Tipo di prova N di target PCR specie-specifica 5 PCR di screening 6 TIPIZZAZIONE mais GM 12 TIPIZZAZIONE soia GM 3 TIPIZZAZIONE colza GM 4 TIPIZZAZIONE cotone GM 4 TIPIZZAZIONE barbabietola da zucchero GM 1 PCR QUANTITATIVA mais GM 12 PCR QUANTITATIVA soia GM 3 PCR QUANTITATIVA colza GM 4 PCR QUANTITATIVA cotone GM 4 PCR QUANTITATIVA barbabietola da zucchero GM 1 XII Congresso Nazionale SIDILV Genova, ottobre 2010 Ciò consentirà di espandere rapidamente la nostra offerta analitica in accreditamento, sia in termini di nuovi eventi GM da ricercare, sia in termini di nuove matrici da esaminare. L Ente Europeo di Accreditamento (EA) incoraggia i laboratori all utilizzo dello schema flessibile di accreditamento (7). Riferimenti bibliografici 1. Leclercq A (2002) Accred Qual Assur 7: Steffen B. (2002) Accred Qual Assur 7: Cankar et al., (2006) BMC Biotechnol 6:37 4. Zel et al., (2006) Accred Qual Assur 10: Zel et al., (2008) Food Anal. Methods 1: Definition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO testing European Network of GMO Laboratories EA-2/15 EA Requirements for the Accreditation of Flexible Scope

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