Facoltà di Scienze M.M. F.F. N.N. Corso di Laurea Triennale in Chimica Industriale CORSO DI LABORATORIO DI TECNOLOGIE ANALITICHE STRUMENTALI

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1 Facoltà di Scienze M.M. F.F. N.N. Corso di Laurea Triennale in Chimica Industriale CORSO DI LABORATORIO DI TECNOLOGIE ANALITICHE STRUMENTALI Maria Antonietta Baldo & Ligia Maria Moretto TECNICHE SPETTROSCOPICHE: Spettrofotometria UV-Vis pag. 3 Assorbimento atomico (AA) 15 TECNICHE CROMATOGRAFICHE: Cromatografia gas-liquido (GC) 25 Cromatografia liquido-liquido (HPLC) 34 TECNICHE ELETTROCHIMICHE: Potenziometria (P) 45 Voltammetria Ciclica (CV) 50 Voltammetria differenziale ad impulsi (DPV) 54 Istruzioni report e relazione 59 APPENDICI: 1. Pulizia della vetreria Reagenti chimici: 62 a- grado di purezza e classificazione b- regole di base per maneggiare reagenti e soluzioni c- analisi di rischio e sicurezza d- classificazione e smaltimento di rifiuti tossico nocivi Anno Accademico 2006/2007 1

2 TECNICHE SPETTROSCOPICHE SPETTROFOTOMETRIA UV-VIS ASSORBIMENTO ATOMICO 2

3 -SPETTROFOTOMETRIA UV-VIS DETERMINAZIONE DELL'AZOTO NITROSO ( N-NO 2 ) NELLE ACQUE Metodo spettrofotometrico con il reattivo di Griess SCOPO Lo scopo dell esperienza è la determinazione quantitativa dell azoto nitroso contenuto in un campione d acqua mediante spettrofotometria di assorbimento UV-Vis. Il metodo spettrofotometrico impiegato si basa sull uso del reattivo di Griess e sulla quantificazione mediante retta di taratura. 1 Tale analisi è utile per evidenziare il grado di inquinamento da nitriti in un acqua. I nitriti rappresentano uno stadio intermedio nel ciclo dell azoto. In genere vengono prodotti durante l ossidazione dell ammoniaca proveniente da processi di degradazione di sostanze proteiche; più raramente possono derivare dalla riduzione di nitrati. Inoltre i nitriti possono essere presenti in prossimità di scarichi di industrie in cui sono utilizzati come agenti anti-corrosione. La legislazione attuale prevede per questi composti una concentrazione inferiore a 1 mg/l, oltre la quale l azoto non e più considerato alimento essenziale per la vita biologica, ma inquinante. PRINCIPI L'acido nitroso viene fatto reagire con solfanilammide e il diazocomposto che si forma viene a sua volta fatto reagire con N-(1-naftil)-etilendiammina. L'azocomposto che si ottiene è rosso e manifesta un massimo di assorbimento a 540 nm. NH N + 2 N + 2H + + NO H 2 O SO 2 NH 2 SO 2 NH 2 N + N N N SO 2 NH H + SO 2 NH 2 NHCH 2 CH 2 NH 2 NHCH 2 CH 2 NH APAT, Metodi Analitici per le Acque, Manuali e Linee Guida, 29/2003 3

4 Il metodo descritto può essere applicato ad acque dolci o salate, oltre che ad acque di scarico, previa diluizione. Le analisi quantitative possono essere eseguite con concentrazioni comprese nell intervallo 0,001-0,2 mg/l: questa limitazione e dettata dalla legge di Lambert-Beer che, com è noto, e valida solo per soluzioni diluite in cui valga la proporzionalità diretta tra assorbanza e concentrazione. Il metodo e piuttosto robusto, non essendo influenzato ne da salinità, ne da moderate variazioni di temperatura; tuttavia esistono alcune sostanze che possono interferire con l analisi, tra cui: sostanze azotate che competono con i nitriti nella reazione con il reattivo di Griess (urea, ammine organiche, tricloruro d azoto); rame (II) (per C>0.5 mg/l) e ione ioduro (per C>0.1 mg/l) che potrebbero deteriorare i composti costituenti il reattivo cromogeno o il sale di diazonio finale; forti ossidanti o riducenti ioni di metalli di transizione poco solubili che potrebbero dare torbidità; eccessiva alcalinità dell acqua (>370 mg/l, come HCO - 3, che impedisca il raggiungimento del ph 2.; in questo caso si deve neutralizzare prima della prova. APPARECCHIATURA spettrofotometro doppio raggio Perkin Elmer, interfacciato con software Lambda 20. Computer e stampante cuvette da 1 cm matracci tarati da 10, 25 e 50 ml; pipette graduate e tarate da 1-10 ml, micropipette tarate METODO UTILIZZATO CON LO SPETTROFOTOMETRO : Metodo SCAN ORDINATE MODE ABS WAV.MAX 700 nm WAV. MIN 400 nm SPEED 120 nm/min SMOOTH 2 nm LAMP VIS BACK CORR YES CYCLES 1 ORD. MAX ABS ORD.MIN ABS THRESHOLD ABS REAGENTI 4

5 Tutte le soluzioni devono (!) essere preparate con acqua Milli-Q. soluzione standard concentrata di N-NO 2 (50 mg/l) Pesare accuratamente g di NaNO 2 anidro seccato a 110 C per 1 ora in stufa. Sciogliere e portare a volume in matraccio tarato da 50 ml con acqua milli-q. Calcolare la concentrazione in base alla seguente relazione: N-NO 2 (mg/l) = mg pesati / V(L) soluzione standard diluita di N-NO 2 (0.5 mg/l) Al momento dell'uso, diluire 1:100 la soluzione precedente, in matraccio da 100 ml, con acqua milli-q. Calcolare la concentrazione esatta. reattivo cromogeno (eseguire le operazioni indossando guanti protettivi) Aggiungere 5 ml di H 3 P0 4 concentrato a 30 ml di acqua Milli-Q ( misurato con un cilindro graduato. Agitare e sciogliere 0.5 g di solfanilammide, aggiungere g di N-(1- naftil)etilendiammina. Portare a volume in matraccio tarato da 50 ml con acqua Milli-Q. PROCEDIMENTO Bianco reagenti Versare in un matraccio da 50 ml, ml di acqua Milli-Q e 2.5 ml di reattivo cromogeno. Portare a volume con acqua Milli-Q. La soluzione non deve essere colorata di rosa (un eventuale colorazione rosa indica infatti la presenza di nitriti nel bianco). Azzerare il valore di assorbanza (back current) eseguendo una scansione, contro acqua milliq, da 700 a 400 nm. Retta di taratura Preparare una serie di soluzioni standard in matracci tarati da 50 ml, prelevando volumi di soluzione standard diluita di N-NO 2 (0.5 mg/l) compresi fra 1 e 20 ml. Aggiungere 2.5 ml di reattivo cromogeno, e portare a volume con acqua milli-q. Calcolare la concentrazione di ciascuna soluzione in mg/l ml prel N-NO 2 (mg/l) = C st dil 50 Dopo 15 minuti, registrare uno spettro tra 700 e 400 nm, utilizzando il campione più concentrato preparato per la retta di taratura, per verificare la posizione del massimo di assorbimento (circa 540 nm). In corrispondenza di tale lunghezza d onda, misurare l'assorbanza delle soluzioni standard. Eseguire almeno 3 misure di assorbanza ripetute per ogni singolo standard. Costruire la retta di taratura ponendo in ascissa la concentrazione degli standard e in ordinata la media delle assorbanze lette. Eseguire la regressione lineare e calcolare la banda di regressione. 5

6 NB: le soluzioni sia di bianco reagenti, che per la retta di taratura, possono essere anche preparate in matracci da 25 ml, tenendo ovviamente conto delle diluizioni opportune. Campione Trasferire quantitativamente il campione d acqua incognito in un matraccio tarato da 50 ml, lavando il recipiente originario 3-4 volte con 5 10 ml di acqua milli-q. Aggiungere 2.5 ml di reattivo cromogeno, e portare esattamente a volume con acqua milli-q. Agitare e leggere l'assorbanza (A,) nelle stesse condizioni previste per gli standards. Ripetere la misura almeno 5 volte. Calcolare il valore medio e la deviazione standard. ELABORAZIONE DEI DATI Impiegare il valore medio dell'assorbanza del campione per ricavare la sua concentrazione (C) mediante la retta di taratura. Riportare i limiti di fiducia del valore calcolato, con un livello di confidenza non inferiore al 95%. 6

7 -SPETTROFOTOMETRIA UV-VIS DETERMINAZIONE DELL'AZOTO NITROSO ( N-NO 2 ) NELLE ACQUE GRUPPO: Data Nome: Obiettivo dell esperimento: Risultati: 1. Registrazione dello spettro di assorbimento di una soluzione standard di N-NO 2 + reattivo di Griess Soluzione standard N-NO 2 : mg L -1 ; -Presentare lo spettro di assorbimento registrato per l azocomposto formato (Allegato #1). Lunghezza d onda di massimo assorbimento: λ max = Discussione: 2. Costruzione della retta di taratura -Calcolare i valori di concentrazione della serie di soluzioni standard di nitrito preparate per la retta di taratura. -Riportare in tabella i dati sperimentali di assorbanza delle soluzioni standard di nitrito alla λ max misurata per l azocomposto, la media e la deviazione standard delle letture. Soluzione Assorbanza, λ max = A media Dev. Stand. N-NO 2 (mg/l) Presentare il grafico ottenuto per la retta di taratura ABS/ C N-NO2 (mg/l) (allegato#2) 7

8 Equazione della retta: coefficiente di correlazione Discussione: 3. Determinazione quantitativa dell N-NO 2 nel campione d acqua incognito -Riportare in tabella i dati sperimentali di assorbanza ottenuti nelle misure ripetute (almeno 5) nel campione alla λ max scelta, la media e la deviazione standard delle letture Campione n N misure Assorbanza, λ max = Assorbanza media: Dev. Stand. - Determinare la concentrazione di N-NO 2 nel campione incognito impiegando il valore medio dell'assorbanza ottenuto, e utilizzando la retta di taratura presentata nel punto 2. - Riportare i limiti di fiducia del valore calcolato, con un livello di confidenza non inferiore al 95%. Concentrazione N-NO 2 : mg L -1 DISCUSSIONE E CONCLUSIONE: 8

9 -SPETTROFOTOMETRIA UV-VIS DETERMINAZIONE CONTEMPORANEA DI CROMO E MANGANESE IN UNA SOLUZIONE ACQUOSA Metodo dell'additività delle assorbanze SCOPO Determinare la concentrazione di due specie chimiche, presenti in una stessa soluzione, che manifestano un assorbimento nella regione UV/visibile, ma che non interagiscono fra loro e non presentano spettri di assorbimento eccessivamente sovrapposti. In queste condizioni, è possibile applicare il metodo dell additività delle assorbanze. PRINCIPI Lo spettro di assorbimento di una miscela corrisponde alla somma degli spettri dei singoli componenti solo nel caso in cui essi non interagiscano fra loro. Nel caso di una soluzione - contenente gli ioni MnO 4 e Cr 2 O 2-7, che non presentano spettri eccessivamente sovrapposti, basta fissare due λ corrispondenti ai massimi caratteristici di ciascuno ione e impostare il seguente sistema: A 440 = ε 440 b C + ε' 440 b C' A 525 = ε 525 b C + ε' 525 b C' dove A 440 e A 525 sono i valori di assorbanza della soluzione a 440 nm (massimo di assorbimento del bicromato) e 525 nm (massimo di assorbimento del permanganato), ε 440 e ε 525 i coefficienti di assorbivita molare del permanganato a 440 e 525 nm e ε' 440 e ε' 525 i coefficienti di assorbività molare del bicromato a 440 e 525 nm, b lo spessore della cuvetta e C e C', rispettivamente la concentrazione di MnO - 4 e Cr 2 O 2-7. Metodologia - Inizialmente, si registrano gli spettri di assorbimento di soluzioni di permangato e bicromato in modo da individuare sperimentalmente i massimi di assorbimento di tali sostanze. - Si determinano i coefficienti di assorbività molare del permanganato e del bicromato usando soluzioni standard. - Successivamente, sulla base dei valori di assorbanza registrati sulla miscela in esame, si determinano le concentrazioni di cromo e manganese nel campione incognito. APPARECCHIATURA spettrofotometro doppio raggio Perkin Elmer, interfacciato con software Lambda 20. cuvette da 1 cm e matracci tarati da ml. pipette tarate da 1-50 ml; micropipette da µl e µl METODO UTILIZZATO CON LO SPETTROFOTOMETRO : Metodo SCAN 9

10 ORDINATE MODE ABS WAV.MAX 700 nm WAV. MIN 400 nm SPEED 120 nm/min SMOOTH 2 nm LAMP VIS BACK CORR YES CYCLES 1 ORD. MAX ABS ORD.MIN ABS THRESHOLD ABS REAGENTI soluzione standard concentrata di K 2 Cr 2 O 7 PM: (1000 mg/l in Cr, PA: 52.00) Preparare, in matraccio tarato, 100 ml di soluzione concentrata di K 2 Cr 2 O 7 (contenente 1000 mg/l in Cr), sciogliendo g di K 2 Cr 2 O 7, essiccato in stufa a 150 C per 2 ore, in 0.1 L H 2 SO 4 2 N. soluzione standard concentrata di KMnO 4, PM: (100 mg/l come Mn, PA: 54.94) Preparare, in matraccio tarato, 100 ml di soluzione concentrata di KMnO 4 (contenente 100 mg/l in Mn), sciogliendo g di KMnO 4 in 0.1 L H 2 SO 4 2 N. H 2 SO 4 2 N Diluire 55.2 ml di H 2 SO 4 al 96% a 1.0 L con acqua distillata. (sotto cappa: fare molta attenzione!! È una reazione fortemente esotermica!! usare i guanti e attenzione agli occhi!) N:B: per evitare schizzi, si trasferisce cautamente l acido concentrato nel matraccio contenente già una quantità opportuna di acqua (almeno metà matraccio). Si lascia raffreddare e poi si porta a volume. Per misurare il volume di H 2 SO 4 conc., utilizzare un cilindro da 100 ml PROCEDIMENTO a- Bianco reagenti Il bianco reagenti è costituito da H 2 SO 4 2 N. Azzerare il valore di assorbanza del bianco (back current) facendo una scansione da 400 a 700 nm contro acqua distillata. b- Registrazione degli spettri di assorbimento delle soluzioni di KMnO 4 e K 2 Cr 2 O 7 Registrare lo spettro di assorbimento nell intervallo di lunghezza d onda compreso tra nm sulle soluzioni standard delle due sostanze considerate, alle seguenti concentrazioni: KMnO 4 :20 mg/l (come Mn); K 2 Cr 2 O 7 : 200 mg/l (come Cr) - eseguire le diluizioni opportune in matracci da 10 oppure 25 ml, partendo dalle soluzioni concentrate preparate in precedenza, e portando a volume con H 2 SO 4 2 N. Individuare i massimi di assorbimento e verificare il grado di sovrapposizione degli spettri. 10

11 Registrare infine lo spettro di una soluzione contenente sia KMnO 4 che K 2 Cr 2 O 7, e confrontare con gli spettri ottenuti nelle sostanze considerate singolarmente. c- Determinazione dei coefficienti di assorbività molare ε Preparare una serie di soluzioni standard di bicromato con concentrazioni comprese tra 20 e 500 mg/l (come Cr), in matracci tarati da 25 ml (o 50 ml). Tali soluzioni vanno preparate mediante diluizioni opportune della soluzione standard concentrata di K 2 Cr 2 O 7 (1000 mg/l in Cr) preparata in precedenza, e portando a volume con H 2 SO 4 2 N. Misurare l'assorbanza di ogni soluzione contro un bianco costituito da H 2 SO 4 2 N, ai due valori di λ corrispondenti ai massimi di assorbimento registrati sperimentalmente per il bicromato e il permangato (circa 440 nm e 525 nm). La misura di assorbanza per ogni soluzione va ripetuta almeno 3 volte. Calcolare ε' 440 per tutte le soluzioni standard di bicromato preparate, tenendo presente che, poiché b = 1 cm: ε = A/C In teoria, tutte le soluzioni standard dovrebbero fornire lo stesso valore di ε. In pratica si otterranno valori leggermente diversi. Calcolare la media dei valori, scartando gli eventuali dati aberranti (o outliers, effettuare eventuale test Q). Procedere nello stesso modo per determinare ε' 525. Per determinare i coefficienti di assorbività del permanganato a 440 e 525 nm si procede nello stesso modo, preparando una serie di soluzioni di permanganato con concentrazioni comprese tra 2 e 50 mg/l (come Mn). Tali soluzioni vanno preparate per diluizione della soluzione standard concentrata di KMnO 4 (100 mg/l come Mn) in matracci da 25 o 50 ml, e portando a volume con H 2 SO 4 2 N. Riportare i dati sperimentali così ottenuti in tabelle del tipo (vedi anche scheda finale): Tabella: Soluzione C (mg/l) A 440 A 525 ε 440 ε 525 K 2 Cr 2 O 7 KMnO 4 d- Determinazione delle concentrazioni di Cr e Mn nella miscela incognita Trasferire quantitativamente il campione incognito in un matraccio tarato di 50 ml, lavando il recipiente originario 3-4 volte con 5 10 ml di H 2 SO 4 2N. Portare esattamente a volume con H 2 SO 4. Agitare con cura e leggere l'assorbanza a 440 e 525 nm della miscela incognita (che 11

12 deve essere acida per H 2 SO 4 ) incognita nelle stesse condizioni previste per gli standards Ripetere più volte (almeno 5) la lettura dell assorbanza, utilizzando ogni volta soluzione fresca prelevata dal matraccio. Calcolare il valore medio delle letture di assorbanza e la relativa deviazione standard. ELABORAZIONE DEI DATI Le concentrazioni di Cr e Mn nel campione si ricavano sviluppando il seguente sistema: C ' = A 440 ε ε 440 ' 440 C C = A ε ε ε ' 440 ' 440 A ε 440 ' 525 ε ε ' Per ricavare le concentrazioni C e C di Cr e Mn, impiegare i valori medi delle letture di assorbanza del campione e dei coefficienti di assorbività molare alle due diverse lunghezze d onda. Esprimere il risultato in mg L -1 di Cr e Mn. NB: Se i valori dei coefficienti di assorbività sono stati calcolati esprimendo le concentrazioni di - MnO 4 e Cr 2 O 2-7 rispettivamente come mg/l di Mn e mg/l di Cr, anche il risultato che si ottiene è espresso in mg/l di Cr e Mn. Nella scheda del report, riportare i dati ottenuti e l intervallo di confidenza sui valori di concentrazione calcolati, con un livello di confidenza non inferiore al 95%. 12

13 Spettrofotometria uv-vis DETERMINAZIONE CONTEMPORANEA DI CROMO E MANGANESE IN UNA SOLUZIONE ACQUOSA GRUPPO: Data Nome: Obiettivo dell esperimento: Risultati: 1. Registrazione degli spettri di assorbimento delle soluzioni di KMnO 4 e K 2 Cr 2 O 7 - Presentare gli spettri di assorbimento delle soluzioni di KMnO 4, C=, K 2 Cr 2 O 7, C=, e KMnO 4 + K 2 Cr 2 O 7 (Allegati #1, #2 e #3 ). Determinazione massimi di assorbimento: Soluzione mg L -1 in Mn λ max = Soluzione mg L -1 in Cr λ max = Discussione: (forma e grado di sovrapposizione degli spettri di assorbimento registrati) 2. Determinazione dei coefficienti di assorbività molare ε -Riportare in tabelle i dati sperimentali ottenuti: Soluzione A Cr, 440 A Cr,525 ε 440 ε 525 Cr (mg/l)

14 Soluzione A Mn, 440 A Mn,525 ε 440 ε 525 Mn (mg/l) Calcolare i valori medi, e le deviazioni standard relative, di ε 440, ε 525, ε 440, ε 525 Discussione: 3. Determinazione delle concentrazioni di Cr e Mn nella miscela incognita -Riportare in tabella i dati sperimentali di assorbanza ottenuti nelle misure ripetute nel campione alle due lunghezze d onda, il valore medio delle letture di assorbanza e le relative deviazioni standard. N misure Assorbanza, λ max = Assorbanza, λ max = Assorbanza media: Dev. Stand. -Calcolare, impiegando il sistema di due equazioni riportato nella dispensa, le concentrazioni di Cr e Mn, espresse in mg/l, le deviazioni standard e i limiti di fiducia dei valori di concentrazione calcolati (con un livello di confidenza non inferiore al 95%). Concentrazione Cr: ± mg L -1 Concentrazione Mn: ± mg L -1 Discussione e conclusioni: 14

15 AAS SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO ATOMICO Ottimizzazione e messa a punto dello spettrofotometro per assorbimento atomico in fiamma, FAAS Lo spettrofotometro per AA è costituito da parti mobili e intercambiabili; è perciò necessario, prima di procedere alle analisi, che tutte le componenti mobili vengano perfettamente posizionate e allineate. Questa procedura sarà eseguita usando la lampada di Cu. PROCEDURA 1. A fiamma spenta si devono effettuare le seguenti operazioni: 1.1. Selezione della lunghezza d'onda di lavoro e della fenditura. In base alla metodica, considerando l elemento ad analizzare, si impostano i valori di λ e della fenditura. Per il caso della lampada di Cu si usa: lunghezza d onda = nm; fenditura = 0.7; altezza: high Allineamento ottico della lampada. Dopo aver collocato la lampada nel suo alloggiamento e averla accesa, si imposta la corrente suggerita per quel tipo di lampada, e successivamente la si orienta lungo tre direzioni fra loro perpendicolari in modo che il raggio colpisca il rivelatore con la massima intensità. Usare le due manopole di allineamento della lampada. (Strumento Perkin Elmer- parameters entry: inserire la corrente di operazione della lampada (vedere le indicazioni scritte sulla scatola della lampada; per Cu è 15 ma); integration time: 0.3 s; energy: allineare fino al valore (CTS) massimo, sia girando la lampada che ruotando le due manopole nere superiori, che regolano l aggiustamento fine; quando la lettura CTS va fuori scala, si cambia scala con il tasto gain ) Posizionamento orizzontale e trasversale della testata. Si sposta la testata con le apposite manopole (o comandi) in modo da ottenere la massima assorbanza ( inserire la lettura in continuo). Questo va fatto aiutandosi con un cartoncino bianco posto davanti alla lampada sopra la testata del bruciatore. Una volta allineata la testata, azzerare la lettura Posizionamento verticale della testata. Impostando con il tasto opportuno la misura dell'assorbanza in modo cont, si azzera la misura con il tasto A/Z e si alza la testata fino a intercettare il raggio (cioè fino a quando si osserva un aumento dell'assorbanza; è sufficiente una lettura di assorbanza di 0.003), la si riporta ad una lettura zero e poi la si abbassa di un quarto di giro della manopola. 2. Accensione e spegnimento della fiamma 2.1. Accensione: aprire le valvole del gas (PRESSIONE: acetilene: 0.9 bar e aria: 4.7 bar); passare la manopola dell'ossidante alla posizione AIR; aggiustare il flusso di ossidante (4) e poi quella del comburente (2); premere il pulsante rosso IGNITE. Se entro 15 secondi dell'apertura del gas non si accende la fiamma, la luce rossa si accende e si blocca 15

16 l'erogazione dei gas; in tale caso, ritornare la manopola dell'ossidante alla posizione OFF e poi ripetere l'operazione. ATTENZIONE: Prima di accendere la fiamma, controllare tutti i dispositivi di sicurezza, come indicato nel manuale dello strumento Spegnimento: chiudere la valvola del combustibile; chiudere la valvola dell'ossidante; portare la manopola dell'ossidante alla posizione OFF. Alla fine della giornata di lavoro, chiudere le bombole di gas, ricordando di sfiatare la linea. 3. A fiamma accesa, si procede alle seguenti regolazioni: 3.1. Azzeramento: Aspirare il bianco (in questo caso acqua milliq), aspettare che si stabilizzi il segnale e azzerare. Successivamente, usando una soluzione standard (di solito si usa una soluzione di Cu con una concentrazione di 5 mg/l) che dia una assorbanza di , eseguire: 3.2. Regolazione della velocità di iniezione. si regola l'iniettore in modo che da esso fuoriescano bollicine di aria, poi si aumenta la velocità del flusso fino a ottenere la massima assorbanza Regolazione del flusso dei gas. Il costruttore fornisce le condizioni ottimali per ogni elemento. L'obiettivo è quello di ottenere la massima assorbanza variando il rapporto combustibile/comburente; prima di ogni variazione dei flussi, si deve azzerare lo strumento Regolazione del sistema di abbattimento delle gocce grossolane. Se si usano sistemi impact bead bisogna ottimizzarne la posizione all'uscita del nebulizzatore. Nello strumento Perkin Elmer in uso in laboratorio questa operazione non è necessaria dato che viene impiegato un flow spoiler. N.B.: Il posizionamento orizzontale e trasversale della testata ( vedi punto 1.3 in assenza di fiamma) può essere anche eseguito in alternativa a fiamma accesa con la soluzione di riferimento (Cu 5 ppm). 4. Pulizia del sistema di iniezione. Dopo ogni sessione analitica, pulire con acqua distillata oppure con HNO 3 all'1%, seguito da abbondante acqua distillata. Tutte queste operazioni devono essere eseguite sia che si usi lo strumento per la prima volta, sia dopo le necessarie operazioni di manutenzione e pulizia. In particolare: - non si deve toccare la testata dopo che è stata posizionata per le misure, fino a quando non viene rimossa; - quando si cambia una lampada, bisogna posizionarla in modo corretto; - il nebulizzatore e l'allineamento della riga di risonanza devono essere calibrati dopo ogni misura. I manuali d'uso degli strumenti riportano indicazioni dettagliate per effettuare queste operazioni. 16

17 5. Controllo dell efficienza delle lampade Una volta eseguite tutte le manovre di ottimizzazione si può valutare orientativamente l'efficienza della lampada. A questo scopo, le tabelle fornite nei manuali d'uso (cookbook) riportano i valori di assorbanza a determinate concentrazioni, che di solito corrispondono alla concentrazione massima dell'intervallo di linearità. Se si usa una lampada a elemento singolo, i valori sperimentali devono corrispondere a quelli tabulati. Valori più alti di assorbanza indicano un'efficienza superiore alla media e valori più bassi un calo dovuto a invecchiamento (ma anche a errori nella procedura di ottimizzazione). Gli strumenti più sofisticati hanno anche un dispositivo di controllo dell'intensità di emissione della lampada. In ogni caso, è consigliabile annotare il valore di assorbanza misurato per ogni lampada nuova come riferimento per i successivi controlli. 17

18 Misure di spettrofotometria di assorbimento (AA) e di emissione (EA) atomica 1. AA: effetto della lunghezza d onda 1.1. Dopo avere ottimizzato lo spettrofotometro per assorbimento atomico in fiamma (usando la lampada di rame a lunghezza d onda nm) eseguire la misura di assorbanza di una soluzione di rame di concentrazione 2 ppm Ripetere la procedura di ottimizzazione della lampada per la lunghezza d onda di nm, e eseguire la misura di assorbanza della stessa soluzione di rame 2 ppm Confrontare i risultati ottenuti in 1.1 e AA vs EA : misure in assorbimento e in emissione 2.1. ottimizzare lo spettrofotometro in assorbimento con la lampada di Na (λ = nm e slit= 0.2 nm) e misurare l assorbanza di una soluzione di sodio 0.2 ppm Dopo avere allineato lo strumento nel modo assorbimento (tasto AA), spegnere la lampada e la fiamma e passare al modo Emissione (tasto Em). Ottimizzare lo strumento con la seguente procedura: a) Impostare i parametri sperimentali; integration time: 0.3 s; replicates= 5 b) Selezionare la lunghezza d onda (λ = nm) e lo slit (0.2 nm). c) Massimizzare l energia della fiamma: Aspirare la soluzione standard più concentrata (1 ppm) e premere [Energy] (E [gain], se necessario) per portare il segnale (CTS) a circa metà scala; Se il valore di energia rimane 0 (zero) o ad un valore molto basso, ruotare lentamente la manopola del controllo della lunghezza d onda (fino a 0.5 nm in entrambi i sensi) in modo da ottenere il massimo di energia e CTS; Premere [gain] ogni volta che si desidera riportare la lettura entro la scala; Premere [cont] (significa: modo di lettura continuo) e verificare il valore della lettura (assorbanza); Aspirare il bianco e azzerare la lettura (tasto [A/Z]; Aspirare nuovamente lo standard più concentrato e controllare l allineamento del bruciatore in modo da ottenere il segnale massimo; 2.3. Eseguire la misura della soluzione di sodio 0.2 ppm in emissione Confrontare i risultati ottenuti in 2.1 (assorbimento) e 2.3 (emissione). 18

19 DETERMINAZIONE DEL PIOMBO MEDIANTE SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO ATOMICO IN FIAMMA Obiettivi: Identificare la lunghezza d onda più adatta alla misura del piombo mediante AA, in base alla sensibilità strumentale e all intervallo di linearità della retta di taratura. Determinare il contenuto di piombo in un campione. 1. Introduzione Il piombo è un metallo utilizzato da secoli nei più svariati campi dell attività umana. E' molto resistente alla corrosione, ma al contatto con l'aria si ossida e annerisce. Sono tuttora funzionanti tubature di piombo che portano le insegne dell'impero romano e che venivano usate come scarichi dei bagni. Il piombo ha molteplici utilizzi, che recentemente si cerca di limitare a causa della consapevolezza della sua tossicità e del danno indotto dalla sua dispersione non controllata nell'ambiente. Viene impiegato negli accumulatori, nelle munizioni, nelle tubature, in vernici come il minio, come schermo contro le radiazioni e in leghe con lo stagno per saldature. Nella benzina, sotto forma di piombo tetraetile (PbEt4), ha funzione antidetonante; l'utilizzo di tale additivo è attualmente in declino per ragioni ambientali. Inoltre il piombo può essere prodotto durante l'estrazione e la lavorazione industriale di altri metalli, come argento, oro, bismuto, ecc e quindi diffondere come inquinante nell'atmosfera. Il piombo figura al secondo posto nella lista delle sostanze pericolose indicate dall' ATSDR (Agency for Toxic Substances and Disease Registry) nel Gli effetti nocivi sulla salute di questo metallo sono noti da molto tempo, specie nelle loro manifestazioni acute (colica saturnina). Tuttavia recentemente, come è accaduto per numerosi altri agenti inquinanti, la dose considerata critica è stata notevolmente abbassata. Fino a circa trent'anni fa, l'avvelenamento cronico da piombo era definito dalla presenza di una dose superiore a 80µg/dl nel sangue, mentre attualmente viene considerata alta una dose di Pb di 30 µg/dl e potenzialmente nocive quantità uguali o superiori a 10µg/dl (0.1ppm), specie nella fase infantile dello sviluppo. Assorbito essenzialmente attraverso la respirazione e la nutrizione (da latte, vino, miele, ecc.), il piombo non viene metabolizzato, ma per larga parte escreto, mentre il resto (circa 20%) si distribuisce nei tessuti e in particolare nel sangue, ove circola quasi esclusivamente negli eritrociti e nei tessuti minerali (ossa e denti) e in quelli molli (reni, midollo osseo, fegato e cervello) nei quali si accumula. Il D.L. 277/91 stabilisce valori limite ambientali, riferiti al contenuto di piombo nell aria (espressi come media ponderata su un periodo di riferimento di otto ore) e valori limite biologici, riferiti al contenuto di piombo nel sangue e nelle urine. Tali valori limite sono: ambientale = 150 µg/m³; biologico = 70 µg/dl (il limite di 70 viene ridotto a 40 per le lavoratrici in età fertile). 19

20 Vengono inoltre fissati dei "valori di attenzione", più bassi dei precedenti, superati i quali il datore di lavoro dovrà attuare una serie di provvedimenti. Valori di attenzione: ambientale = 40 µg/m³ e biologico = 35 µg/dl. La spettrofotometria di assorbimento atomico in fiamma non consente sensibilità elevate per la determinazione del piombo. Per questo motivo, le tecniche elettive per la determinazione del piombo in tracce sono AA con fornetto di grafite, Voltammetria di ridissoluzione a impulsi differenziale (DP-ASV) e Spettroscopia a plasma accoppiato induttivamente (ICP). Tuttavia, nei casi di campioni a più alte concentrazioni, la determinazione del piombo in AAS in fiamma dà risultati accettabili. In questa esperienza si valuteranno le prestazione della tecnica AAS in fiamma per l analisi del piombo lavorando a due diverse lunghezze d onda e a due intervalli di concentrazione dell analita che differiscono di un ordine di grandezza. 2. Parte sperimentale 2.1. Apparecchiatura Spettrofotometro FAAS con lampada a catodo cavo per Pb matracci tarati pipette- micropipette Reagenti Soluzione standard di Pb (1000 mg/l) per assorbimento atomico; campione incognito Procedura: Retta di taratura: Preparare 2 L de soluzione di HNO 3 diluita 1.10 dall acido concentrato. Preparazione della soluzione standard di Pb diluito (100 ppm): versare 25 ml della soluzione standard (1000 ppm) in un matraccio da 250 ml, aggiungere 25 ml di HNO 3 concentrato e portare a volume con acqua distillata. Preparazione delle due serie A e B di soluzioni standard: In matracci da 100 ml, versare i seguenti volumi di soluzioni standard diluita (100 ppm) di Pb: - Serie A: 1, 2, 3, 4, 5, e portare a volume con la soluzione di HNO 3 diluito 1:10. - Serie B: 10, 20, 30, 40, 50 ml, e portare a volume con la soluzione di HNO 3 diluito 1:10. Si ottengono cosi soluzioni negli intervalli di concentrazione rispettivamente da 1 a 5 ppm di Pb, e da 10 a 50 ppm di Pb, con le quali si costruiranno le rette di taratura. Bianco: preparare un matraccio da 250 ml con la soluzione di HNO 3 diluito 1:10 da utilizzare per le misure del bianco. Ottimizzare lo strumento usando le seguenti condizioni: λ : nm e nm; Fenditura: 0.7 nm; Fiamma blu, ossidante; Tempo di lettura: 3s; 10 ripetizioni 20

21 Per ciascuna lunghezza d onda: a) leggere l'assorbanza del bianco. Ripetere la misura per 3 volte al fine di calcolare da deviazione standard del bianco e il limite di rivelabilità; b) Misurare l assorbanza di ogni soluzione standard delle due serie; c) Misurare l assorbanza del campione tal quale e diluito 1: Elaborazione dei dati Costruire le due rette di taratura comprendendo i due intervalli di concentrazione considerati, per ogni lunghezza d onda, ponendo in ascissa la concentrazione degli standard e in ordinata l'assorbanza. Identificare l intervallo di linearità. Eseguire la regressione lineare e calcolare i limiti di rivelabilità per ciascuna lunghezza d onda, presentando bande di regressione con un livello di confidenza non inferiore al 95%. Impiegare il valore di assorbanza del campione per determinare la concentrazione C (in mg L -1 ) di Piombo nella soluzione analizzata, mediante la retta di taratura. Per questo scegliere 21

22 DETERMINAZIONE DEL PIOMBO MEDIANTE SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO ATOMICO IN FIAMMA Corso: GRUPPO: Nome: Data 1. Per la lunghezza d onda λ = nm, costruire la retta di taratura comprendendo le due serie di concentrazioni e presentare il grafico ABS vs [Pb] (allegato #1). Intervallo di linearità: Equazione della retta di taratura: DL = QL = 2. Per la lunghezza d onda λ = nm, costruire la retta di taratura comprendendo le due serie di concentrazioni e presentare il grafico ABS vs [Pb] (allegato #2). Intervallo di linearità: Equazione della retta di taratura: DL = QL = 3. Discutere le differenze ottenute nelle analisi impiegando ciascuna di queste lunghezze d onda. 4. Determinare la concentrazione di Pb nella soluzione analizzata (in mg/l) utilizzando la retta di taratura alla lunghezza d onda considerata più adatta a questa misura. Giustificare questa scelta. Discutere e commentare il risultato. 22

23 TECNICHE CROMATOGRAFICHE CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO (GLC) CROMATOGRAFIA LIQUIDO-LIQUIDO (HPLC) 23

24 GAS-CROMATOGRAFIA DETERMINAZIONE DI IDROCARBURI ALIFATICI IN ACQUE DI SCARICO Metodo dello standard interno Gli idrocarburi alifatici, insieme a solventi clorurati, aromatici, PCB, IPA, fenoli, rappresentano una delle classi di microinquinanti organici di sistemi acquatici, suoli e sottosuoli maggiormente diffuse e sottoposte, secondo la normativa CEE vigente, a severo controllo analitico e procedure di smaltimento. Le fonti di idrocarburi sono in minima parte di tipo naturale (decomposizione di materia organica es: plancton, batteri e alghe nei bacini lacustri- attività geotermica e combustioni spontanee) e in prevalenza di tipo antropogenico. In particolare la presenza di idrocarburi nelle acque e suoli è dovuta principalmente alla contaminazione da prodotti petroliferi, processi di combustione, processi industriali. Scarichi abusivi, incidenti in impianti di produzione o in linee di adduzione, versamenti accidentali rappresentano le cause più comuni di inquinamento del suolo, sottosuolo e delle acque da parte di questi prodotti. Secondo le attuali direttive CEE sui rifiuti urbani e rifiuti pericolosi, prodotti contenenti miscugli idrocarburi-acqua sono in ogni caso da considerarsi rifiuti pericolosi, e quindi devono essere sottoposti a particolari trattamenti e /o stoccati in discariche strettamente riservate. L identificazione e la determinazione analitica di tali inquinanti organici sono pertanto di fondamentale importanza nella protezione dei suoli e delle acque superficiali e sotterranee dallo scarico di siti inquinati, e nel controllo di qualità e del rispetto dei limiti di legge previsti a seconda del diverso utilizzo del bacino stesso. Nel caso ad es. di acque sotterranee destinate al consumo come acqua potabile, per gli idrocarburi alifatici la legislazione prevede un contenuto massimo di ogni singola sostanza non superiore a mg/l. SCOPO DELL ESPERIENZA - Identificare e determinare il contenuto di alcuni idrocarburi alifatici lineari leggeri (n-alcani C 12) in un campione d acqua, mediante gascromatografia con detector a ionizzazione di fiamma, utilizzando il metodo della retta di taratura con standard interno. Gli idrocarburi alifatici da analizzare sono i seguenti: Peso Densità Punto di Molecolare (g/ml) ebollizione ( C) - ottano nonano dodecano Standard interno: undecano

25 N.B.: metodo dello standard interno: è il metodo di quantificazione più usato nell analisi gascromatografica, in quanto consente di ottenere risultati più accurati ed affidabili, soprattutto se applicato al metodo della retta di taratura. In pratica, non si fa riferimento al picco dell analita, ma al rapporto dell area di questo e l area di un componente ( lo standard interno), aggiunto in quantità nota alla miscela da analizzare. In questo modo si prepara la retta di taratura ovviando a problemi tecnici quali la riproducibilità del sistema di iniezione ed eventuali derive della sensibilità del rivelatore. La sostanza scelta come standard interno deve obbedire ad una serie di requisiti: non essere presente nel campione da analizzare; Essere stabile termicamente; Fornire un picco cromatografico ben risolto (non sovrapposto) da quello degli altri componenti Avere un tempo di ritenzione simile a quello dei componenti da determinare; Essere strutturalmente simile a questi ( e quindi avere un fattore di risposta simile) Essere sufficientemente pura e non reagire con i componenti del campione. APPARECCHIATURA Gas cromatografo : Fisons, model GC 8000 series, software di acquisizione dati Varian Detector a ionizzazione di fiamma (FID) Iniettore split Colonna capillare: colonna HP-5, fenil metil silicone 5%, 30m x 0.25 mm ID, spessore del film 0.25µm (strumento Fisons); Microsiringhe Hamilton da 10 e 100 µl; micropipette Brand a volume variabile con puntale in vetro, 5-25 µl; µl. Matracci da 5 e 10 ml; Vials da 2, 4 ml Imbuto separatore da 250 ml con rubinetto di teflon Anello portaimbuto separatore Cilindro da 50 ml Pallone da 250 ml con tappo vetro smeriglio Imbuto vetro con batuffolo di cotone Cucchiaio, bacchetta di vetro, pipette pasteaur Rotavapor Cronometro REAGENTI 25

26 Idrocarburi alifatici lineari (n-alcani C 8, C 9, C 11, C 12 ) Solvente: n-esano Na 2 SO 4 anidro Campione di acqua di scarico contenente idrocarburi Miscela detergente CONTRAD 2000 per eliminare residui di sostanze organiche (sostituisce la miscela cromica) PROCEDIMENTO CONDIZIONI E MODALITÀ OPERATIVE Flussi : colonna carrier gas (N 2 ) :1-1.2 ml/min ( pressione front column: 100 Kpa) Vent N 2 : ml/min Make up N 2 : ml/min Bruciatore H 2 : ml/min Aria ml/min ATTENZIONE: non modificare i valori dei flussi già impostati! Iniettore : Split ratio: compreso tra 1:50 e 1:75. Temperatura iniettore : 280 C. Volume iniezione: µl Colonna capillare: si imposta una programmata di temperatura ottimizzata per l eluizione dei composti considerati in questa esperienza. - T iniziale colonna: 70 C tempo iniziale: 1 min - Si innalza T colonna fino a 250, a 10 C/min - T finale colonna :250 C tempo finale: 1 min DETECTOR FID: TEMPERATURA 290 Tempo di eluizione di un cromatogramma completo in queste condizioni:12 min ca CONTROLLO DELLA LINEA DI BASE All inizio dell esperienza, per controllare la linea di base dello strumento, iniettare 1 µl di n-esano (solvente) nel gascromatografo precedentemente equilibrato alle condizioni operative di misura, impostate in precedenza. PREPARAZIONE DI SOLUZIONI MADRE DI IDROCARBURI Preparare, in matracci da 5 ml le seguenti soluzioni concentrate: g di ottano diluiti a 5 ml con n-esano ( C ottano = 10 g/l) g di nonano g di undecano g di dodecano 26

27 NB: diluire gli idrocarburi direttamente nel matraccio, prelevando con una microsiringa da 100 µl, o con la micropipetta con puntale in vetro, il volume appropriato di idrocarburo puro (tener conto della densità del liquido puro). ANALISI DEI SINGOLI IDROCARBURI Preparare, per diluizione dalle soluzioni madre, 4 soluzioni di lavoro contenenti ciascuna un singolo idrocarburo, in concentrazione ppm (mg/ L), utilizzando come solvente n-esano. Ogni soluzione va preparata effettuando le diluizioni opportune (con microsiringa) dalla rispettiva soluzione madre in un matraccio da 5 o 10 ml. - registrare un cromatogramma per ogni singolo idrocarburo, iniettando 1 µl di soluzione. - per ogni cromatogramma, determinare i tempi di ritenzione dei singoli componenti, ricavando così l ordine di eluizione degli idrocarburi considerati nelle condizioni operative impiegate. RETTE DI CALIBRAZIONE Per costruire le rette di calibrazione dei tre idrocarburi, preparare 4-5 soluzioni standard di lavoro, ciascuna contenente concentrazioni di C 8, C 9 e C12 nell intervallo compreso tra 10 e 100 mg/l (es: standard n 1: 10 mg/l di C8 +10 mg/l di C mg/l di C12). Standard interno: Ad ogni soluzione standard di lavoro, aggiungere undecano nella seguente concentrazione : 20 mg/l Ogni soluzione va preparata in un matraccio da 10 ml effettuando le diluizioni opportune (con microsiringa) dalle soluzioni madre precedenti, contenenti i singoli idrocarburi, con n-esano come solvente. - Registrare un cromatogramma per ogni soluzione standard di lavoro, iniettando µl di soluzione. - Per ogni cromatogramma, attribuire i picchi ottenuti ai singoli componenti della soluzione, sulla base dei tempi di ritenzione ottenuti in precedenza. - Per ogni cromatogramma, calcolare il rapporto tra l area del picco di ognuno dei 3 idrocarburi e quella relativa allo standard interno, cioè i rapporti A C8 /A C11, A C9 / A C11, A C12 / A C11. - Riportare in grafico, per ogni valore di concentrazione dei 3 analiti (normalizzato rispetto alla concentrazione di undecano), i rispettivi valori delle aree trovate al punto precedente. -eseguire la regressione lineare, e riportare la relativa banda di regressione con un livello di confidenza non inferiore al 95%. PREPARAZIONE ED ANALISI DEL CAMPIONE Vengono forniti 100 ml di un campione di acqua di scarico. La metodica da seguire per preparare il campione per l analisi gascromatografica degli idrocarburi alifatici leggeri prevede una estrazione liquido-liquido con n-esano, la concentrazione dell estratto al rotavapor e infine la ripresa dell estratto con n-esano. 27

28 Seguire la seguente procedura: 1. Sciacquare tutta la vetreria (imbuto separatore, cilindro, pallone, imbuto di vetro) con un po di solvente - n-esano - prima dell uso. La vetreria deve essere stata precedentemente lavata in miscela detergente. 2. Preparare il filtro disidratante di Na 2 SO 4, ponendo sopra il pallone da 250 ml un imbuto con un batuffolo di cotone (precedentemente pre-estratto con aliquote di solvente per purificarlo) e due spatolate di solfato di sodio precedentemente attivato (una notte in stufa a 250 C, e raffreddato in essiccatore). 3. Trasferire quantitativamente il campione d acqua nell imbuto separatore (attenzione all ancoretta dentro alla beuta!). 4. Con un cilindro graduato porre ml di n-esano nella beuta che conteneva il campione ed agitare vigorosamente. Trasferire tutto nel relativo imbuto. 5. Estrarre agitando regolarmente per 3 minuti sfiatando di tanto in tanto. Usare un timer per controllare la durata dell estrazione. 6. Lasciare riposare fino a completa separazione delle fasi (usare eventualmente una bacchetta di vetro per rompere eventuali emulsioni che si possono formare), travasare la fase acquosa (fase inferiore) di nuovo nella beuta del campione, e trasferire la fase organica nel relativo pallone, facendola fluire lentamente attraverso il filtro di solfato di sodio. Attenzione: evitare assolutamente che tracce d acqua passino nel pallone contenente l estratto! 7. Trasferire di nuovo il campione d acqua nell imbuto separatore, e ripetere l estrazione altre due volte con due successive aliquote di ml della stesso solvente (n-esano) raccogliendo le fasi organiche disidratate su sodio solfato anidro sempre nello stesso pallone da 250 ml (ricordarsi di ripulire bene la beuta con la miscela di estrazione). 8. Alla fine lavare il filtro di solfato di sodio con circa 20 ml di n-esano, che vengono raccolti insieme alle altre fasi organiche. 9. Concentrare il campione a piccolo volume (circa 3 ml) mediante evaporatore rotante, con bagnomaria termostatato a temperatura 40 C. Attenzione: evitare assolutamente che l estratto vada a secco o che bolla violentemente! 10. Trasferire quantitativamente l estratto concentrato con pipetta pasteur in un matraccio da 5 ml. Lavare il pallone con il minimo volume necessario (massimo 2 pipettate) di n-esano, trasferire nel matraccio del campione. 11. Aggiungere lo standard interno: undecano, in concentrazione 20 mg/l, e portare a volume con n-esano. - Iniettare µl di campione e registrare il cromatogramma - ripetere il cromatogramma almeno 3 volte. 28

29 - alla fine dell esperienza lavare la vetreria con soluzione detergente. ELABORAZIONE DEI DATI - calcolare i rapporti tra le aree A C8 /A C11, A C9 / A C11, A C12 / A C11 e interpolare dal grafico precedente i valori incogniti di concentrazione degli idrocarburi considerati. - Calcolare il contenuto totale medio di idrocarburi: C tot idrocarburi = somma delle concentrazioni calcolate per i singoli idrocarburi, in mg/l - Calcolare la deviazione standard relativa % (RSD%) ottenuta per le 3 misure ripetute. 29

30 GAS-CROMATOGRAFIA DETERMINAZIONE DI IDROCARBURI ALIFATICI IN ACQUE DI SCARICO GRUPPO: Data Nome: Obiettivo dell esperienza: CONDIZIONI OPERATIVE (flussi, programmata di temperatura, etc): Risultati: 1. Analisi dei singoli idrocarburi Soluzioni idrocarburi singoli impiegate : Concentrazione: - Dai cromatogrammi registrati per i singoli idrocarburi, ricavare i tempi di ritenzione e l ordine di eluizione dei singoli componenti nelle condizioni sperimentali impiegate. Tempi di ritenzione: Ordine di eluizione: -Discutere brevemente le motivazioni teorico-sperimentali per l ordine di eluizione degli idrocarburi oggetto di studio. 30

31 2. Costruzione retta di taratura - Presentare i cromatogrammi registrati per la serie di soluzioni standard (Allegato #1) -Riportare in una tabella: - i valori di concentrazione della serie di soluzioni standard di lavoro contenenti gli idrocarburi singoli e lo standard interno, preparate per le rette di calibrazione. - i dati sperimentali dei rapporti delle aree di picco A C8 /A C11, A C9 / A C11, A C12 / A C11 ottenute per le diverse soluzioni standard. - Costruire le rette di calibrazione A analita /A C11 vs C analita (mg/l) per ogni analita, e presentare i grafici ottenuti mediante le regressioni lineari (allegato#2), riportando le relative bande di regressione con un livello di confidenza non inferiore al 95%, le rispettive equazioni delle rette e i coefficienti di correlazione calcolati. Equazioni della rette: Ottano: coefficiente di correlazione Nonano: coefficiente di correlazione Dodecano: coefficiente di correlazione Discussione: 3. Analisi del campione - Riportare i cromatogrammi (Allegato #2) e i dati sperimentali dei rapporti delle aree di picco A C8 /A C11, A C9 / A C11, A C12 / A C11 ottenuti dalle misure ripetute (almeno 3) degli idrocarburi nel campione incognito A C8 /A C11 : ; media: A C9 /A C11 : ; media: A C9 /A C11 : ; media: 31

32 - Determinare la concentrazione dei singoli idrocarburi nel campione incognito, in mg/l, impiegando il valore medio delle aree di picco ottenute e utilizzando la retta di taratura con standard interno ottenuta al punto 2. Concentrazione ottano : ± mg L -1 Concentrazione nonano : ± mg L -1 Concentrazione dodecano: ± mg L -1 - Calcolare il contenuto totale medio di idrocarburi: C tot idrocarburi (= somma delle concentrazioni calcolate per i singoli idrocarburi), in mg/l, e le rispettive deviazioni standard relative % (RSD%). C tot idrocarburi: mg L -1 ; RSD%: Discussione e conclusione: 32

33 HPLC CONTROLLO DELLE PRESTAZIONI" DI UNA COLONNA CROMATOGRAFICA SCOPO E PRINCIPI Tutte le colonne per HPLC sono corredate di un certificato di qualità che riporta i risultati di un test di verifica delle loro prestazioni. In questa esperienza, si procede al controllo della qualità di una colonna LC-18 effettuando la separazione di una miscela di riferimento contenente benzene, toluene e acetofenone. Dai cromatogrammi registrati, verranno determinati i seguenti parametri: α, R, N e H. APPARECCHIATURA Cromatografo HPLC VARIAN PROSTAR model 230 pompa per HPLC per la miscelazione di due eluenti (metanolo e acqua) valvola di iniezione Reodyne con loop di 20 µl rivelatore UV-vis (λ = 254 nm) siringa per iniezioni da 100 µl micropipetta da 1 ml micropipetta da 200 µl, per la preparazione dei campioni matracci tarati da 50 ml MATERIALI E REAGENTI colonna a fase inversa LC-18 ( dimensioni particelle 5 µm) soluzione di acetofenone ( 10.3 g/l) ( soluzione per due gruppi) Diluire 500 µl di acetofenone puro in 50 ml di metanolo. miscela di reagenti per il test Diluire 50 µl della soluzione di acetofenone preparata sopra, 50 µl di benzene e 50 µl di toluene in 25 ml di metanolo. La concentrazione dei reagenti sarà: acetofenone (10,3 mg/l), benzene (880 mg/l), toluene (867 mg/l). OTTIMIZZAZIONE: SCELTA DELLA FASE MOBILE Per stabilire l eluente migliore per la separazione in condizioni isocratiche, si può usare all'inizio un solvente puro relativamente poco polare rispetto all acqua, come ad esempio il metanolo. In questo modo, la competizione fra la fase stazionaria apolare e l'eluente è massima. Poi si aumenta gradualmente la polarità dell'eluente, aggiungendo acqua, in modo da far diminuire la competizione con la fase stazionaria fino a ottenere una separazione ottimale dei tre componenti. 33

34 La composizione ottimale dell'eluente è quella che consente di realizzare il più elevato numero di piatti teorici, compatibilmente con una risoluzione non eccessiva (maggiore di 1,5 ma minore di 2) e con tempi di lavoro e costi contenuti. Si può variare anche la composizione della fase mobile eseguendo una eluizione a gradiente. Condizioni operative Fase mobile: metanolo/acqua ( usare solventi per HPLC e acqua Milli-Q). Flusso: 1,0 ml/min Temperatura: ambiente Pressione: dipende dal flusso imposto e dalle caratteristiche (es: viscosita ) della fase mobile. E regolata automaticamente ( leggere comunque il valore sul display dello strumento). λ del rivelatore UV: 254 nm Impiegare la miscela preparata per il test. Procedimento Verificare che la colonna sia condizionata con il solvente impiegato nella fase iniziale delle misure (Aspettare fino ad avere una linea di base piatta, pressione e composizione della fase mobile stabile). Predisporre l'integratore per la registrazione del cromatogramma. Predisporre la valvola di iniezione, riempendo il sample loop con circa 60 µl di soluzione test. Iniettare la miscela per test e attendere l'uscita dei tre picchi nell'ordine seguente: acetofenone benzene, toluene. (Nella relazione dare una spiegazione all ordine dei reagenti eluiti). Eseguire una serie di eluizioni isocratiche variando la composizione della fase mobile, passando da metanolo puro a miscele metanolo/acqua con rapporti non superiori a 50% in acqua. Eseguire una eluizione a gradiente con forma lineare, partendo da metanolo puro e aumentando il contenuto di acqua fino ad un massimo del 50%, con un rapporto del 5% al min. OTTIMIZZAZIONE: SCELTA DEL FLUSSO Per individuare il flusso ottimale per la separazione in condizioni isocratiche di una soluzione di acetofenone, benzene e toluene si può procedere alla determinazione per via sperimentale della funzione H= f(u). Il flusso ottimale, sotto il profilo dell'efficienza, è quello che consente di realizzare il più basso valore di H (punto di minimo della funzione H vs u). Tuttavia, sotto il profilo operativo si deve tenere conto anche dei tempi di ritenzione e della risoluzione fra i picchi. Condizioni e modalità operative Fase mobile: eluizione isocratica con metanolo/acqua (70:30%) Temperatura: ambiente 34