Spettroscopia UV-visibile (parte 2) Bande di assorbimento. Assorbimento UV-vis da parte di proteine ed acidi nucleici

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1 (parte 2) Bande di assorbimento Assorbimento UV-vis da parte di proteine ed acidi nucleici

2 Bande d assorbimento Absorbance 1.0 legge di Lambert-Beer A(l)=e l cb

3 Bande d assorbimento Perché si misura l assorbanza al picco di assorbimento?

4 Bande d assorbimento Perché si misura l assorbanza al picco di assorbimento?

5 Bande d assorbimento perche si osserva una banda larga?

6 Bande d assorbimento perche si osserva una banda larga?

7 Bande d assorbimento perche si osserva una banda larga?

8 In molte molecole organiche l assorbimento della luce cade nel campo dell ultravioletto (UV nm) e tali sostanze sono quindi incolori (nei liquidi e nelle soluzioni) o bianche (allo stato solido). Molte altre assorbono nel visibile (c.a nm) e danno luogo a colorazioni intense. E il caso delle molecole riportate in Figura come il carotene (colore della carota e delle foglie d autunno), la clorofilla (colore delle foglie verdi), il licopene (colore rosso dei pomodori) e di moltissime altre molecole.

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10 Spettro di assorbimento della clorofilla Sono visibili due transizioni principali a 670 nm (rosso) e 430 nm (blu).

11 Effetto della coniugazione Quando in una molecola sono presenti due o più cromofori in coniugazione diretta tra loro si assiste ad un marcato effetto batocromico quasi sempre accompagnato da un effetto da un effetto ipercromico attribuibile alla maggiore facilità della transizione elettronica.

12 Effetto della coniugazione

13 Effetto della coniugazione

14 Effetto della coniugazione Ciò spiega l esistenza di composti organici colorati, come il metilarancio, la fenolftaleina, la clorofilla, la caffeina o il b-carotene che presentano un massimo di assorbimento nel visibile. Tutti i composti citati presentano doppi legami coniugati ed è proprio l estesa coniugazione che è responsabile dell assorbimento nel visibile.

15 Variazioni spettrali Ciò spiega l esistenza di composti organici colorati, come il metilarancio, la fenolftaleina, la clorofilla, la caffeina o il b-carotene che presentano un massimo di assorbimento nel visibile. Tutti i composti citati presentano doppi legami coniugati ed è proprio l estesa coniugazione che è responsabile dell assorbimento nel visibile.

16 Emoglobina L emoglobina è una proteina: 1. globulare presente nei globuli rossi ed ha la funzione di trasportare l ossigeno nel sangue. 2.tetramerica costituita da quattro catene polipetidiche (subunità). Nella molecola di emoglobina ciascuna subunità lega un gruppo eme Eme: gr. cromoforo

17 Gruppo Eme

18 Gruppo Eme

19 Gruppo Eme

20 Gruppo Eme

21 Perché????

22 Emoglobina Gli orbitali esterni conivolti nei legami dei metalli di transizione sono quelli d Nel compesso ottaedrico del Fe (II) nella emoglobina i 5 orbitali d si scompongono in due set: 2 obitali d x2 -y 2 and dz 2 puntano lungo gli assi verso i leganti gli altri 3 d xy, d xz, d xz puntano tra gli assi x,y,z e non sono influenzati dalla repulsione con i leganti

23 Emoglobina Differenza di energia che corrisponde ad un assorbimento di luce

24 Emoglobina Deossiemoglobina (alto spin) Ossiemoglobina (basso spin)

25 Cromofori importanti in molecole biologiche Usi più frequenti della spettroscopia UV-vis Misura della concentrazione di acidi nucleici mediante A 260 Misura della concentrazione di proteine mediante A 280 Studio di variazioni strutturali

26 Cromofori nelle proteine Il legame peptidico (214 nm, lontano UV) Anello aromatico (280 nm, vicino UV) Ponte disolfuro (250 nm)

27 Spettro Ultravioletto delle proteine La banda della fenilalanina è la meno intensa e si osserva a minori lunghezze d onda. Il suo contributo è completamente oscurato da quello di tirosina e triptofano, quando sono presenti questi residui.

28 Spettro Ultravioletto delle proteine Spettro di assorbimento di quattro proteine: La tripsina ha un alto contenuto in tirosina, l albumina ha un alto contenuto in fenilalanina, il chimotripsinogeno ha un alto contenuto in triptofano la gelatina (collagene) ha un basso contenuto in tutti e tre questi aminoacidi.

29 Spettro Ultravioletto delle proteine Tipicamente per poter quantificare la concentrazione di una proteina viene usata la regione del vicino UV piuttosto che il lontano UV in quanto molti solventi assorbono o diffondono in questa ultima regione spettrale, pertanto interferendo con l assorbimento del cromoforo amidico Gli amino acidi aromatici hanno un coefficiente di estinzione molare ben caratterizzato nell intervallo nm. Pertanto, se si conosce il numero di tirosine o triptofano nella proteina, si può calcolare un coefficiente di estinzione per la proteina ad una determinata lunghezza d onda ed usare questo per misurare la concentrazione della proteina in soluzione e 280 nm (tirosina) = 1280 cm -1 M -1 e 280 nm (triptofano)= 5690 cm -1 M -1

30 Spettro Ultravioletto delle proteine Il reale vantaggio di questo metodo per determinare la concentrazione delle proteina è che il campione non viene distrutto ed il metodo è molto rapido Una accurata misura della concentrazione della proteina prevede l impiego di : una curva di assorbimento standard prodotta con campioni di proteina pura a concentrazione nota un bianco che contenga la stessa concentrazione di tampone e di sale del campione una cuvetta di quarzo, in quanto contrariamente al vetro, non assorbe luce UV

31 L assorbimento del gruppo peptidico a nm è molto sensibile alla struttura secondaria di polipeptidi e proteine. Nella figura è mostrato come lo spettro del polipeptide poli-l-lisina possa modificarsi per: l effetto di un aumento di ph che induce la formazione dell a-elica da una struttura a matassa l effetto di un aumento di temperatura che converte il polipeptide in b-foglietto.

32 L assorbimento del gruppo peptidico a nm è molto sensibile alla struttura secondaria di polipeptidi e proteine. Questo è un esempio di ipocromismo, particolarmente rilevante negli acidi nucleici, assieme al suo opposto di ipercromismo. Il fenomeno può essere usato nello studio dei processi di denaturazione e rinaturazione, sfruttando i diversi coefficienti di assorbimento, per determinare quantitativamente le frazioni di forma nativa e denaturata.

33 Reazioni cromogene usate per le analisi Numerose sostanze non hanno un coefficiente d'estinzione significativo nel visibile, ma possono reagire quantitativamente con un'altra sostanza a formare un prodotto colorato. Questa proprietà viene sfruttata per la determinazione quantitativa di tali sostanze. Le reazioni cromogene si usano per convertire un composto chimico privo di colore in uno che ha un colore per poterlo misurare mediante spettrofotometria.

34 Reazioni cromogene usate per le analisi Una reazione cromogena utile dovrebbe avere le seguenti proprietà: 1. Il colore prodotto deve essere proporzionale alla concentrazione del composto da misurare nel campione in un ambito ragionevolmente ampio. 2. Il colore prodotto deve essere elevato in modo che piccole quantità di composto possano essere determinate (misurate). In altre parole ciò significa che l'assorbimento molare del prodotto deve essere alto. Molti reagenti cromogeni utili hanno assorbimenti molari fra e M -l cm -l.

35 Reazioni cromogene usate per le analisi Una reazione cromogena utile dovrebbe avere le seguenti proprietà: 3. Il prodotto colorato deve essere ragionevolmente stabile, così che non sia necessario un momento preciso di misurazione. Ciò è importante quando si usano strumenti semplici come i colorimetri. Ci sono però strumenti come gli spettrofotometri stopped-flow che sono disegnati per eseguire misurazioni molto rapidamente e possono quindi rivelare in modo attendibile composti che sono instabili, ad esempio prodotti intermedi di una sequenza di reazioni. Questi strumenti possono eseguire osservazioni in tempi dell'ordine di 1-2 ms dopo il mescolamento.

36 Reazioni cromogene usate per le analisi Una reazione cromogena utile dovrebbe avere le seguenti proprietà: 4. Non devono essere presenti altre sostanze nel campione da analizzare che possano interferire con la reazione. In molti casi è necessario eseguire uno o più passaggi di separazione per rimuovere sostanze interferenti prima di poter e- seguire la reazione cromogena. 5. È desiderabile che le condizioni richieste per la reazione cromogena non siano troppo stringenti in modo che piccole variazioni di temperatura o di volume di reagenti o di tempo di reazione non producano un cambiamento significativo di assorbanza.

37 Reazioni cromogene usate per le analisi Una reazione cromogena utile dovrebbe avere le seguenti proprietà: 6. I reagenti necessari per la reazione devono essere stabili in modo che non sia necessario preparare reagenti freschi per ogni analisi. 7. L'assorbanza del bianco deve essere bassa. Se il bianco ha un'alta assorbanza, l'assorbanza ottenuta con una bassa concentrazione di composto da misurare sarà soltanto poco più alta e l'inerente errore strumentale sarà significativo. Questo tipo di errore è un problema in tutti i metodi quantitativi quando si sottrae un numero relativamente grande da un numero appena più grande.

38 Reazioni cromogene usate per le analisi Metodo di legame con coloranti (metodo di Bradford) per la determinazione delle proteine Il metodo di determinazione della concentrazione proteica è il metodo di Bradford. Questo metodo è molto popolare perchè semplice, rapido, economico e sensibile. Il reattivo di Bradford contiene il Coomassie Brillant Blue R-250 come cromogeno. Questo colorante forma forti complessi non covalenti con le proteine tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminici e carbossilici e tramite forze di van der Waals.

39 Reazioni cromogene usate per le analisi Metodo di legame con coloranti (metodo di Bradford) per la determinazione delle proteine Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G- 250 alle proteine provoca uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide Reagente + proteina Solo reagente

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47 Spettro Ultravioletto di Acidi Nucleici Il forte assorbimento nel vicino UV degli acidi nucleici è determinato quasi esclusivamente dalle basi pirimidiniche e puriniche. Infatti gli zuccheri e i gruppi fosfato hanno assorbimenti a < 150 nm. Le basi presentano sistemi delocalizzati in anelli eterociclici, e le transizioni sono di tipo p-p *.

48 Spettro Ultravioletto di Acidi Nucleici Tutti gli spettri delle basi mostrano un forte assorbimento intorno a 260 nm.

49 Spettro Ultravioletto di Acidi Nucleici

50 Ipocromicità/Ipercromicità A (260) DNA doppio filamento 1.00 DNA singolo filamento 1.37 Basi libere 1.67

51 Ipocromicità/Ipercromicità In generale, gli acidi nucleici hanno un assorbimento inferiore alla somma delle assorbanze dei nucleotidi individuali Questo fenomeno è chiamato ipocromicità. Un aumento in assorbimento è detto ipercromicità

52 Ipocromicità/Ipercromicità Questo effetto è molto utile per vedere se gli acidi nucleici sono strutturati A (260) DNA doppio filamento 1.00 DNA singolo filamento 1.37 Basi libere 1.67 (%)ipercromicità A ss (DNA A fuso ss ) A (DNA ss (DNA nativo ) nativo ) *100

53 Ipocromicità/Ipercromicità L effetto ipercromico può essere spiegato in base alla configurazione elicoidale dei polimeri del nucleotide. In una struttura così regolarmente impacchettata i cromofori non possono essere considerati residui isolati, indipendenti gli uni dagli altri. Lo spostamento elettronico che ha luogo quando una base assorbe un quanto di energia è sentito anche dalle basi vicine in conseguenza alla modificazione del campo elettrico. Se l'interazione è forte, diventa impossibile parlare di un assorbimento "localizzato" in un residuo particolare. L effetto ipercromico è causato anche dalla presenza di interazioni intermolecolari.

54 Ipocromicità/Ipercromicità Una regola generale prevede che MODIFICAZIONI CONFIGURAZIONALI CHE NON CAMBIANO LA STRUTTURA ELETTRONICA NON MODIFICANO L ASSORBIMENTO TOTALE

55 Denaturazione del DNA Sotto l azione di vari agenti esterni come valori estremi di ph, aumento della temperatura, aggiunta al mezzo acquoso di particolari reagenti, il DNA in soluzione può andare incontro a significative modificazioni strutturali che ne cambiano l aspetto, la funzionalità e le caratteristiche, passando dalla doppia elica regolare a uno stato disordinato in cui i filamenti complementari si separano e la struttura secondaria viene persa. Questo fenomeno viene comunemente chiamato denaturazione. Durante un processo di denaturazione non si rompe alcun legame covalente, ma si assiste alla sola separazione dei due filamenti della doppia elica: in altre parole, i ponti idrogeno tra le coppie di basi complementari vengono spezzati e diminuiscono le interazioni tra basi adiacenti.

56 Denaturazione del DNA

57 Denaturazione termica del DNA La denaturazione termica degli acidi nucleici avviene in un intervallo di temperatura piuttosto ristretto e provoca cambiamenti significativi delle proprietà fisiche della macromolecola. Questa particolare transizione ordine-disordine può essere facilmente osservata seguendo l aumento dell assorbimento ottico a 260 nm in funzione dell aumento della temperatura. La curva sperimentale dell assorbanza in funzione della temperatura può essere analizzata per ottenere informazioni termodinamiche relative al processo in esame.

58 Denaturazione termica del DNA 0.50 La temperatura corrispondente a metà dell aumento osservato nell A 260 è definita come temperatura di melting, T m o temperatura di fusione del DNA.

59 Denaturazione termica del DNA Molti sono i fattori che influenzano il punto di melting del DNA: Lunghezza della molecola: DNA più lunghi T m più elevate; Contenuto delle basi: maggiore % GC T m pi`u elevate; Sequenza delle basi: non solo il contenuto, ma anche l ordine con cui le basi si presentano nella sequenza polinucleotidica condiziona la stabilità del DNA; Forza ionica: a più elevata forza ionica, è presente un maggior numero di ioni positivi che schermano la carica negativa lungo lo scheletro del DNA. In questo modo, le forze repulsive tra catene diminuiscono e, di contro, aumenta la T m ;

60 Denaturazione termica del DNA Concentrazione del DNA: per molecole di DNA molto lunghe l effetto della concentrazione sulla T m è quasi trascurabile, mentre per molecole più corte (oligonucleotidi) l equilibrio è fortemente condizionato; Valori di ph: valori estremi di ph possono ionizzare le basi azotate e rompere ilegami idrogeno. Al di fuori del range 5 < ph < 9 la T m decresce bruscamente; Solvente: solventi organici tendono ad abbassare la T m

61 Denaturazione del DNA

62 Denaturazione delle proteine Si può studiare la denaturazione di una proteina attraverso il suo spettro UV? Modificazioni nella struttura secondaria di una proteina sono comunemente osservate attraverso il suo spettro UV, in quanto l assorbimento degli aminoacidi aromatici e dei legami peptidici è significativamente influenzato dall ambiente locale. Pertanto, lo spettro UV di una proteina denaturata differisce da quello della stessa proteina nella forma nativa. Tuttavia, le modificazioni spettrali sono generalmente di piccola entità tanto che questo metodo non è quasi mai usato per questo tipo di studio. Al contrario, la denaturazione di una proteina può essere più sensibilmente monitorata attraverso il dicroismo circolare (tale argomento verrà trattato più approfonditamente nelle lezioni successive)