EFFETTI IMMUNOLOGICI DI ORZO, SEGALE ED AVENA SULLA MUCOSA INTESTINALE DI SOGGETTI AFFETTI DA MALATTIA CELIACA: ATTIVAZIONE SPECIFICA IN VITRO

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DELLA TUSCIA DI VITERBO DIPARTIMENTO DI AGROBIOLOGIA E AGROCHIMICA CORSO DI DOTTORATO DI RICERCA IN BIOTECNOLOGIE VEGETALI - XVIII CICLO TESI SPERIMENTALE: EFFETTI IMMUNOLOGICI DI ORZO, SEGALE ED AVENA SULLA MUCOSA INTESTINALE DI SOGGETTI AFFETTI DA MALATTIA CELIACA: ATTIVAZIONE SPECIFICA IN VITRO Settore scientifico-disciplinare: AGR/07 Coordinatore: Prof. Domenico Lafiandra Dipartimento di Agrobiologia e Agrochimica Università della Tuscia - Viterbo Tutor: Dott. Antonio Picarelli Dipartimento di Scienze Cliniche Università La Sapienza - Roma Dottorando: Dott. Marco Di Tola Anno Accademico

2 1. LA MALATTIA CELIACA: UNA COLLISIONE EVOLUTIVA TRA UOMO E AMBIENTE La Malattia Celiaca (MC) è un intolleranza permanente del piccolo intestino al glutine, un complesso proteico contenuto nella cariosside del frumento. In fase di attiva malattia, il glutine causa lesioni a livello della mucosa dell intestino tenue, con conseguente alterazione della funzione di assorbimento. L espressione tipica di MC è rappresentata, infatti, da atrofia dei villi intestinali associata ad iperplasia delle cripte del Lieberkühn, quadro che recede dopo eliminazione dell agente causale dalla dieta (1). Dal punto di vista storico, se la prima definizione di MC come sindrome da malassorbimento risale al 1888 ad opera di Samuel Gee (2), il ruolo etiologico del glutine nella patogenesi della malattia stessa è stato identificato negli anni 50 dal pediatra olandese Willem Karel Dicke (3). Questo ricercatore osservò che le condizioni dei bambini affetti da celiachia migliorarono nel cosiddetto inverno del digiuno ( ) durante il quale, a causa della guerra, i piccoli pazienti erano stati alimentati con patate, banane ed altri alimenti privi di glutine come i bulbi di tulipano. Terminata la guerra, il ritorno alla normalità alimentare provocò il ripresentarsi dei sintomi. Questa brillante osservazione portò all identificazione del glutine come agente causale della MC. E oggi noto che l anomala sensibilità nei confronti del glutine è conferita da una predisposizione associata sia a geni di tipo HLA che non appartenenti a tale sistema. Nei soggetti geneticamente predisposti, il consumo alimentare di glutine innesca una risposta immunitaria sia di tipo umorale che cellulo-mediata, la quale porta al rimondellamento mucosale responsabile del quadro istologico tipico di malattia (1). 1.1 Dati epidemiologici I continui sviluppi nel campo della ricerca e la disponibilità di test diagnostici a sempre più alta sensibilità e specificità hanno permesso di definire la celiachia come la malattia infiammatoria cronica più frequente del genere umano (4), con un rapporto uomo/donna pari a 1:2 (5). Dal punto di vista storico, i primi studi epidemiologici sulla MC sono stati eseguiti nell Europa degli anni 50 sulla base dell osservazione clinica dei sintomi tipici di malassorbimento (diarrea cronica e perdita di peso). In quegli anni, la prevalenza nei diversi paesi europei oscillava tra 1:4000 e 1:8000 (6). Poiché i bambini risultavano essere i soggetti maggiormente colpiti, la MC venne inizialmente definita come una condizione di competenza prettamente pediatrica. Studi successivi, effettuati in Irlanda, Scozia e Svizzera tra gli anni 70 e 80, dimostrarono un incremento nella prevalenza della MC con picchi compresi tra 1:450 e 1:500 (7-9). Questo aumento di prevalenza fu 2

3 il risultato dell utilizzo dei primi test diagnostici, quali la valutazione dei grassi fecali e la prova di assorbimento intestinale dello xilosio. In ogni caso, anche se in Europa la MC era divenuta una realtà, nel resto del mondo veniva considerata ancora una condizione rara. Negli U.S.A., infatti, i primi studi epidemiologici sono stati eseguiti tra il 1993 e il 1994, stimando una prevalenza di circa 1 caso ogni 5000 persone (10,11). Solo negli ultimi anni, con l introduzione di nuovi marcatori sierologici altamente sensibili e specifici quali gli anticorpi anti-gliadina (AGA), anti-endomisio (EMA) ed anti-transglutaminasi tessutale (anti-ttg), in associazione alla tipizzazione dei geni HLA, è stato possibile registrare un drastico aumento nelle diagnosi di MC, soprattutto a carico dei soggetti adulti. Inoltre, grazie a questi strumenti, si è potuto dimostrare come la celiachia sia distribuita in modo piuttosto omogeneo (teoria del villaggio globale), ferme restando le differenze nelle abitudini alimentari e nella frequenza della predisposizione genetica esistenti tra le diverse popolazioni del mondo (4). La prevalenza stimata oggi in Italia è di 1:106 (12) mentre, in Europa, è compresa tra 1:85 (Ungheria) e 1:500 (Croazia e Germania), con un valore medio di circa 1:220 (4,12,13). Nella tabella 1.1, sono riportati i valori di prevalenza calcolati negli ultimi dieci anni di studio sulla MC. Tabella Prevalenza della MC in Europa Paese Prevalenza Campione Metodo Croazia 1:500?? Danimarca 1: Screening Estonia 1: Screening + biopsia Finlandia 1: Screening + biopsia Germania 1: Screening + biopsia Gran Bretagna 1: Screening Irlanda 1: Screening + biopsia Italia 1: Screening + biopsia Norvegia 1: Screening + biopsia Olanda 1: Screening + biopsia Portogallo 1: Screening + biopsia Repubblica Ceca 1: Screening Spagna 1: Screening + biopsia Svezia 1: Screening + biopsia Svizzera 1: Screening + biopsia Ungheria 1: Screening + biopsia Prevalenza media 1:220 3

4 Come è avvenuto per l Europa, anche in altre regioni del mondo si è assistito ad un notevole aumento nel numero delle diagnosi. E il caso degli U.S.A., in cui la prevalenza della MC è stata recentemente stimata nella misura di 1:133 (14). Non sempre, però, la situazione è così indicativa. Anche se le indagini epidemiologiche e le segnalazioni cliniche esistenti oggi in letteratura testimoniano l esistenza della MC in quasi tutte le regioni del globo (4,15,16), spesso si tratta di studi occasionali, approssimativi e, qualche volta, perfino contradditori (Tabella 1.2). La celiachia è dunque un problema sanitario che non conosce confini, ma le cui dimensioni su scala mondiale sono ancora tutte da stabilire. Tabella Prevalenza della MC nel resto del mondo Continente Paese Prevalenza Campione Metodo Africa Algeria (Saharawi) 1: Screening + biopsia Burkina Faso (Mossi) 0: Screening America Argentina 1: Screening + biopsia Brasile 1: Screening + biopsia U.S.A. 1: Screening + biopsia Asia Anatolia centrale 1: Screening + biopsia Iran 1: Screening + biopsia Israele 1: Screening + biopsia Turchia 1: Screening + biopsia Australia Australia occidentale 1: Screening + biopsia Si ritiene infine che l aumento di prevalenza della MC sia dovuto, oltre che allo sviluppo di test diagnostici altamente sensibili e specifici, anche a nuove abitudini alimentari quali la diminuzione dell allattamento al seno, la quantità di glutine e il tempo di introduzione dello stesso durante il divezzamento e, infine, la quantità e la qualità del glutine ingerito in età adulta (17). Questi cambiamenti alimentari, in associazione all elevata frequenza della predisposizione genetica alla malattia, potrebbero spiegare il caso endemico documentato tra i Saharawi, una popolazione nordafricana in cui la prevalenza della MC è stata stimata nella misura di 1:18 (18,19). Quello dei Saharawi resta comunque un caso isolato e, per il momento, unico al mondo. Le conoscenze acquisite dopo decenni di studi epidemiologici sulla MC sono sintetizzate nel modello ad iceberg proposto da Richard Logan nel 1992 (20), in cui viene considerata l esistenza delle forme subcliniche e latenti le quali, essendo ancora oggi di difficile identificazione, necessitano di un protocollo di diagnosi attento e sempre al passo con i tempi (Figura 1.1). 4

5 Figura Modello ad iceberg della MC La dimensione totale dell iceberg rappresentata i soggetti geneticamente predisposti alla MC (a sinistra sono riportati gli aplotipi HLA interessati). I casi con evidenza clinica di MC rappresentano la porzione emersa dell iceberg. Nella porzione sommersa sono rappresentati i casi che, a causa di una sintomatologia sfumata o assente (MC silente) o di una morfologia mucosale normale (MC latente), sfuggono alla diagnosi. Più in basso sono rappresentati i soggetti che, pur avendo una predisposizione alla MC, sono sani. A destra è riportata la morfologia mucosale nelle diverse condizioni. 1.2 Fattori genetici Poiché la MC colpisce individui geneticamente predisposti ed è caratterizzata da processi immunomediati diretti contro il glutine, può essere definita come una patologia di tipo multifattoriale (21), in cui l intestino (sede della risposta immunitaria e, allo stesso tempo, organo bersaglio) agisce da interfaccia tra i fattori genetici e quelli ambientali (Figura 1.2). Inizialmente, il coinvolgimento genetico nella MC è stato suggerito dall alta prevalenza della stessa (10%) tra i fratelli dei pazienti celiaci e dalla quasi assoluta concordanza (70-100%) tra i gemelli monozigoti (22,23). Il parametro usato per valutare questo aspetto è il λ s (rischio di MC nei fratelli di celiaci/rischio di MC nella popolazione generale), il cui valore varia tra 20 e 60 a seconda degli studi considerati (24-26). Tali valori, se paragonati con i corrispettivi misurati in altre patologie multifattoriali come l artrite reumatoide, il diabete di tipo 1 e la sclerosi multipla, risultano essere molto alti. Qualche decennio fa, si riteneva inoltre che i geni implicati nella MC fossero del solo tipo HLA. In contrapposizione a questa tesi, il λ shla (rischio di MC nei fratelli di celiaci con HLA predisponente/rischio di MC nella popolazione generale con HLA predisponente) è decisamente inferiore al λ s, con valori compresi tra 2,3 e 5,5 (24-26). Il contributo alla MC dei geni HLA rispetto a quello dei geni non-hla dipende dal tipo di interazione tra i loci interessati. Assumendo un 5

6 modello moltiplicativo, il quale prevede un effetto sinergistico tra i geni, i valori di λ s e λ shla indicano che il contributo dei geni non-hla (λ s /λ shla ) è maggiore rispetto a quello dei geni HLA. Questo aspetto suggerisce che, oltre a quella dell HLA, altre regioni geniche devono essere coinvolte nella predisposizione alla MC. Ciò nonostante, dal momento che la scelta del modello moltiplicativo è arbitraria e che la condivisione dei fattori ambientali all interno delle famiglie (principalmente l alimentazione) può sottostimare il valore del λ shla e, di conseguenza, sovrastimare il contributo dei geni non-hla, quello di cui sopra resta un calcolo puramente teorico. In ogni caso, studi recenti hanno evidenziato il coinvolgimento di regioni geniche non-hla nella predisposizione alla MC (21). Figura Esempio di patologia multifattoriale La celiachia rientra nel campo delle malattie infiammatorie croniche, caratterizzate da un etiologia multifattoriale che coinvolge sia fattori ambientali che genetici, inclusi i geni HLA. In genere, la complessa interfaccia tra i fattori genetici e quelli ambientali rende arduo il compito di identificare i meccanismi molecolari della malattia stessa. E per questo motivo che le conoscenze patogenetiche sulle malattie infiammatorie croniche sono piuttosto limitate anche se, come vedremo meglio in seguito, la MC offre un buon modello di studio per la comprensione di tali meccanismi biomolecolari. Legenda: F.G. = fattori genetici; F.A. = fattori ambientali; S.I. = sistema immunitario; APC = cellula presentante l antigene; MHC = complesso maggiore di istocompatibilità; An ambientale = antigene ambientale; TCR = recettore dei linfociti T Il sistema HLA Il Complesso Maggiore di Istocompatibilità (Major Histocompatibility Complex, MHC) è un insieme di geni che codificano per diverse glicoproteine di membrana, le cui funzioni principali rientrano nel riconoscimento cellulare, nella discriminazione tra self e non self e, grazie alla capacità di presentare gli antigeni ai linfociti T, nello sviluppo delle risposte immunitarie in molte specie animali. Il Recettore dei Linfociti T (T Cell Receptor, TCR) è infatti in grado di riconoscere un antigene solo se associato a una molecola MHC. L MHC umano (Human Leukocyte Antigen, HLA) è anch esso un insieme di geni distribuiti in un ampio tratto di DNA (circa 4000 paia di 6

7 kilobasi) localizzato sul braccio corto del cromosoma 6. I geni dell HLA sono organizzati in regioni che codificano per quattro diverse classi di molecole: I, I-like, II e III (Figura 1.3). Figura Schema del sistema HLA sul cromosoma 6p Legenda e spiegazioni: C = centromero; Classe II = regione comprendente i geni di classe II; DP, DQ e DR = geni delle molecole di classe II; LMP (Low Molecular Mass Polypeptide o Large Multifunctional Proteinase, LMP2/LMP7) = geni dei componenti della grande proteasi multifunzionale (proteasoma); DM (DMA/DMB) = geni della molecola necessaria a legare il peptide antigenico alle molecole di classe II; TAP (Transporter Associated with Antigen Presentation, TAP1/TAP2) = geni del trasportatore associato con il peptide antigenico; Classe III = regione comprendente i geni di classe III; 21-OH (un locus genico e 1 locus pseudogenico) = geni della 21-idrossilasi; C4B, C4A e C2 = geni degli omonimi elementi del sistema complementare; Bf = gene del fattore B della properdina; TNF (Tumor Necrosis Factor) = gene dell omonima citochina; LT (Linfotossina) = gene dell omonima citochina; HSP (Heat Shock Protein) = geni delle omonime proteine di 70 kd; Classe I = regione comprendente i geni di classe I e I-like; B, C e A = geni delle molecole di classe I; Classe I-like = geni delle molecole di classe I-like; T = telomero; Kb = kilobasi. I geni di classe I codificano per glicoproteine espresse su quasi tutte le cellule nucleate e costituite da una catena α di 44 kd e da un altra di 12 kd, detta β2-microglobulina, codificata da una regione genica distinta situata sul cromosoma 15. La loro funzione è quella di presentare peptidi antigenici endogeni, della lunghezza di 8-10 aminoacidi, ai linfociti T Cluster Determinant (CD)8+ (linfociti T citotossici o CTL). I geni di classe I-like, così chiamati perché localizzati tra quelli di classe I, codificano per proteine isolate e caratterizzate solo di recente, anch esse implicate nei processi immunologici. I geni di classe II codificano per glicoproteine espresse sulle Cellule Presentanti l Antigene (APC) e costituite da una catena α di kd e da una β di kd. La loro funzione è quella di presentare peptidi antigenici esogeni, della lunghezza di aminoacidi, ai linfociti T CD4+ (linfociti T helper o Th). Specifiche varianti alleliche di due di questi geni codificano per proteine in grado di presentare frammenti di glutine ai linfociti Th, influenzando la risposta immunitaria verso questi stessi antigeni e conferendo, così, parte della predisposizione genetica alla MC. La regione di classe II comprende, inoltre, alcuni geni che codificano per proteine accessorie (LMP, DM e TAP), le quali partecipano attivamente al processo di presentazione antigenica. 7

8 I geni di classe III codificano per gli elementi del sistema complementare C2, C4 e Bf. Infine, tra questa regione genica e quella codificante per le proteine di classe I, sono localizzati i geni di alcune citochine come il Tumor Necrosis Factor (TNF) e la Linfotossina (LT), nonché i geni che codificano per la famiglia delle Heat Shock Protein di 70 kd (HSP70) (21,27,28) I geni HLA associati alla MC Più del 90% dei pazienti celiaci presentano gli alleli HLA-DQA1*0501 e -DQB1*0201 (regione genica 6p21.3), i quali codificano, rispettivamente, per le catene α e β della molecola di classe II DQ2, mentre gli stessi alleli sono associati alla popolazione generale nel 20-30% dei casi (23). L antigene DQ2 è, quindi, strettamente legato alla MC, mentre le precedenti associazioni trovate con gli antigeni DR3, DR5 e DR7, o con i relativi fenotipi HLA DR3/DR3 e DR5/DR7 sono, in realtà, da attribuire allo stretto disequilibrium tra questi e il DQ2 (29). I pazienti celiaci negativi per il DQ2 sono generalmente positivi per il DQ8 (codificato dagli alleli HLA-DQA1*0301 e - DQB1*0302), associato all antigene DR4 (30). Il sequenziamento dei geni HLA-DQ ha rivelato che l aplotipo DR3-DQ2 porta gli alleli DRB1*0301-DQA1*0501-DQB1*0201, l aplotipo DR5-DQ7 porta gli alleli DRB1*11/12- DQA1*0505-DQB1*0301, l aplotipo DR7-DQ2 porta gli alleli DRB1*07-DQA1*0201- DQB1*0202 e l aplotipo DR4-DQ8 porta gli alleli DRB1*04-DQA1*0301-DQB1*0302. Pertanto, gli alleli DQA1 degli aplotipi DR3-DQ2 e DR5-DQ7 e gli alleli DQB1 degli aplotipi DR3-DQ2 e DR7-DQ2 sono quasi identici. In altre parole, gli individui eterozigoti per DR5-DQ7/DR7-DQ2 portano in trans alleli quasi uguali a quelli portati in cis dagli individui omozigoti per DR3- DQ2/DR3-DQ2 e, quindi, sono in grado di esprimere una molecola DQ pressoché identica. Le catene DQ α codificate dagli alleli DQA1*0501 e DQA1*0505 differiscono per un residuo nel peptide leader, mentre le catene DQ β codificate dagli alleli DQB1*0201 e DQB1*0202 differiscono per un residuo nel dominio membrana-prossimale. Poiché è molto improbabile che queste differenze minime possano riflettersi in una conseguenza funzionale, i celiaci che si distinguono per le combinazioni DR-DQ sopra menzionate esprimono, sulla superficie delle proprie APC, molecole in grado di svolgere la stessa funzione, le quali in un caso vengono codificate da alleli genici arrangiati in cis e, nell altro, in trans (Figura 1.4). Quest evidenza conferma ulteriormente la correlazione tra la MC e l eterodimero HLA-DQ2 (21). Recentemente, sono state suggerite delle correlazioni tra la MC e alcune regioni geniche HLA fisicamente distinte sia dal DQ che dal DR. Lo studio dei polimorfismi genetici di alcune citochine ha rilevato, infatti, un associazione tra la MC e un aplotipo, localizzato tra i geni di classe III, codificante per un fenotipo altamente secretorio del TNF-α (31). Altre associazioni sono state evidenziate tra la MC, un allele del gene MIC-A (Major Histocompatibility Complex Class I-like 8

9 gene A) e un altro del gene MIC-B, rispettivamente MIC-A5.1 e MIC-B0106, entrambi localizzati tra i geni di classe I. In particolare, si è visto che questi due alleli correlano con le forme atipiche di malattia, nelle quali la sintomatologia è sfumata o del tutto assente (32). In ogni caso, si è dimostrato che sia la variante del gene del TNF-α sopra indicata che gli alleli MIC-A5.1 e MIC- B0106 sono in forte linkage disequilibrium con l aplotipo DR3-DQ2 (32,33), indicando che la suscettibilità alla MC è conferita in primo luogo dall antigene HLA-DQ2 o, in alternativa, dal -DQ8 (33). Figura Eterodimero HLA-DQ2 associato alla MC I pazienti celiaci omozigoti per DR3-DQ2/DR3-DQ2 o eterozigoti per DR5-DQ7/DR7-DQ2 sono in grado di esprimere la stessa molecola funzionale DQ. Gli alleli codificanti l eterodimero HLA-DQ2 si trovano in cis (sullo stesso cromosoma) negli omozigoti DR3-DQ2/DR3-DQ2 e in trans (su cromosomi opposti) negli eterozigoti DR5- DQ7/DR7-DQ I geni non-hla associati alla MC Utilizzando analisi di screening genomico nell ambito di famiglie con più di un figlio celiaco, numerosi ricercatori hanno suggerito che alcune regioni geniche non HLA-relate possono conferire parte della suscettibilità alla MC (21). Una delle prime regioni geniche è stata evidenziata sul braccio corto del cromosoma 6 (regione 6p23), in posizione telomerica rispetto ai loci HLA (34). Altre regioni geniche che sembrano avere un legame con la MC sono state individuate sui cromosomi 7 (regione 7q31.3), 11 (regione 11p11), 15 (regione 15q26) e 22 (regione 22cen), anche se i risultati ottenuti nei relativi studi sono incompleti e, in alcuni casi, contrastanti fra loro (34-36). E stato inoltre descritto un certo grado di associazione tra la MC e due regioni distinte che mappano sui cromosomi 5q e 11q, entrambi codificanti alcuni fattori responsabili della presentazione clinica di malattia (36). In realtà, la regione individuata sul braccio lungo del cromosoma 5 (regione 5q31-33) contiene un focolaio di geni già noti per essere candidati a varie suscettibilità, come il cluster delle citochine a profilo Th2 implicato nel morbo di Crohn, il gene dell Interleuchina (IL)-12b implicato nel diabete di tipo I e 9

10 nella sclerosi multipla, il gene del Tim implicato nell asma e altri ancora, come il gene del recettore dei lipopolisaccaridi (CD14), il gene del Tmp1, il gene dell Interferon Regulatory Factor (IRF)-1, etc. Fatta eccezione del gene dell IL-12b (polimorfismo Taq1), dell IRF-1 (polimorfismo Hinf1) e di quattro polimorfismi che caratterizzano più del 90% delle variazioni nel cluster delle citochine a profilo Th2, il cui coinvolgimento nella celiachia è stato già escluso in vari studi sperimentali, è ragionevole pensare che uno o più geni localizzati in questa regione cromosomica possano conferire parte della suscettibilità alla MC (21,32). Un altro gene indagato nell ambito della MC è quello che codifica per il Cytotoxic T Lymphocyteassociated Antigen (CTLA)-4 (37,38), una molecola di superficie dei linfociti T in grado di legare il complesso antigenico B7/BB-1 espresso sulle APC e di sviluppare, come conseguenza, un segnale negativo che indirizza le stesse cellule T verso uno stato di anergia, contribuendo al mantenimento della tolleranza nei confronti degli antigeni self (27). Si tratta di un gene che mappa sul cromosoma 2q (regione 2q33), in cui la sostituzione di un nucleotide nel primo esone (dimorfismo CTLA transizione dall allele A all allele G) comporta il cambiamento di un aminoacido (da treonina ad alanina) nella molecola codificata. E stato documentato che l allele G associa con diabete di tipo I, la malattia di Graves, l artrite reumatoide e la sclerosi multipla, mentre l allele A associa con la MC (38). Se da un lato l associazione tra l allele A e la MC non trova consistenza in tutte le popolazioni (39), dall altro si è notato che questo legame si rende più evidente nei pazienti celiaci negativi per le molecole HLA-DQ ad alto rischio (40). E oggi noto che, oltre al gene del CTLA-4, altri interessanti candidati mappano nella regione 2q33: il gene del CD28, dell Inducible Costimulator (ICOS) e del Programmed Death (PD)-1, tutte molecole regolanti l attivazione dei linfociti T (32). Altre regioni geniche che sono state recentemente correlate alla MC mappano sui cromosomi 6 (regioni 6q21-22 e 6q25.3), 9 (regione 9p21-13) e 19 (regione 19p13.1). Una variante genica del Fas, una proteina che gioca un importante ruolo nei meccanismi apoptotici, è stata inoltre associata al grado di atrofia dei villi intestinali. In questo senso, si ipotizza che il polimorfismo Fas-670A incrementi l apoptosi Fas-indotta a carico delle cellule dell epitelio intestinale, aggravando così il danno mucosale tipico di MC. Un associazione degna di nota è infine quella trovata tra la MC e il gene della Propil Endopeptidasi (PREP), una serin-proteasi in grado di idrolizzare i peptidi ricchi di prolina (come, ad esempio, quelli derivati dal glutine) al fine di dividerli in frammenti più piccoli. Si ipotizza che, in presenza di MC, questo gene codifichi per un enzima incapace di dividere i peptidi derivati dal glutine in frammenti abbastanza piccoli da non essere riconosciuti dal sistema immunitario come eventuali antigeni. Per quanto intriganti, queste ultime associazioni tra la MC e i geni non HLA-relati necessitano di ulteriori evidenze sperimentali (32). 10

11 In generale, è possibile assumere che i geni non-hla associati alla MC codifichino per prodotti in grado di influenzare la risposta immunitaria verso il glutine, come è stato già dimostrato per i geni HLA. Ciò nonostante, regioni cromosomiche che raggiungano un livello di significatività verso la MC simile a quello mostrato dai geni HLA, non sono state ancora individuate. Probabilmente, quest evidenza indica che ognuno dei geni non-hla sopra menzionato presenta, di per sé, un effetto modesto. Le interazioni gene-gene e le molteplici caratteristiche di malattia possono, in definitiva, giustificare questi dati (21) Le regioni geniche associate alla MC: classificazione internazionale Le regioni geniche associate alla MC, sia di tipo HLA che non HLA-relate, sono oggi denominate e classificate come segue: CELIAC 1: regione 6p21.3 (HLA-DQ2 o, in alternativa, -DQ8) CELIAC 2: regione 5q31-33 CELIAC 3: regione 2q33 Nel caso delle regioni CELIAC 2 e 3, i singoli geni che predispongono alla MC non sono stati ancora individuati con assoluta certezza (32). 1.3 Fattori ambientali L unico fattore ambientale a tutt oggi riconosciuto per la MC è rappresentato dall ingestione di cereali contenenti le frazioni proteiche tossiche e/o immunogeniche, le quali costituiscono gli antigeni scatenanti la malattia (41). A oltre cinquant anni dalla scoperta del ruolo etiologico del glutine nella MC (3), soltanto il frumento (grano tenero), e ultimamente l avena, sono stati analizzati estensivamente con i metodi scientifici più avanzati (41-43). Per quanto concerne gli altri cereali, a causa della stretta relazione tassonomica con il frumento, l orzo e la segale sono ritenuti tossici mentre, per la ragione opposta, l ingestione da parte dei pazienti celiaci di altre specie cerealicole come il riso e il mais è considerata sicura (44) I cereali e altre specie da cui si ricavano farine: tassonomia, cenni storici e maggiori impieghi alimentari Dal punto di vista botanico, le piante vengono suddivise in Crittogame se prive di semi e fiori (ad esempio, alghe e funghi) e in Fanerogame se fornite di queste strutture. Le Fanerogame vengono a loro volta suddivise in Gimnosperme se presentano semi nudi e foglie aghiformi (ad esempio, pino, abete, ginepro, etc) e in Angiosperme se caratterizzate da semi racchiusi in un frutto e foglie non aghiformi. Le Angiosperme vengono ulteriormente suddivise in Monocotiledoni, i cui semi sono provvisti di un cotiledone e le cui foglie sono per lo più a venatura parallela, tra cui possono essere 11

12 annoverate le Glumiflore, caratterizzate a loro volta da fusto cavo e dall assenza di calice e corolla. Tra le Glumiflore sono rappresentate le Graminacee (Poacee), a loro volta suddivise in Festucoidacee (Avenacee avena; Cloridacee teff; Ordacee o Triticacee frumento, orzo, segale, farro, kamut e triticale; Orizacee riso) e in Panicoidacee (Andropogonacee sorgo; Panicacee miglio; Tripsacee mais e lacrima Jobi). Sono qui di seguito riportate e analizzate alcune specie cerealicole da cui è possibile ricavare farine di vitale importanza per l alimentazione umana. Avena (Avena sativa) conosciuta fin dal neolitico, cominciò ad imporsi nell età del bronzo, anche se a quel tempo la sua coltivazione era decisamente sporadica. Successivamente, con il passaggio dall età del bronzo a quella del ferro, l avena si impose come cereale importante. Attualmente viene utilizzata per l alimentazione del bestiame (biada) ma, per il suo alto contenuto in fibre, trova ampio spazio anche nell alimentazione umana. Nei paesi anglosassoni viene utilizzata per lo più in fiocchi mentre la sua farina, miscelata a quella del frumento, fornisce un buon pane. Grano o frumento (Triticum vulgare) originario dell Asia Minore, comparve nell età del bronzo, momento in cui se ne coltivava una forma primitiva, il frumento nano (T. aestivum compactum). Nei periodi successivi, il frumento evolse rapidamente ed acquistò un ruolo di massima importanza tra le coltivazioni cerealicole. Attualmente è il cereale che detiene il primo posto nell agricoltura mondiale ed è, in assoluto, il più consumato in Italia. Se ne coltivano circa varietà raggruppate in grani teneri (T. aestivum), dalle cui farine si ricava il pane, e duri (T. turgidum), dalle cui farine si ricava la pasta. Orzo (Hordeum vulgare) conosciuto fin dal neolitico, assunse un ruolo di massima importanza nell età del bronzo. La sua coltivazione cominciò a diminuire a partire dall età del ferro, momento in cui dovette cedere il passo alle nuove specie. Attualmente viene coltivato nelle zone montuose per il foraggio e la biada, ma entra anche in altri impieghi alimentari come la preparazione del pane, malto, birra, whisky, etc. Con il malto, misto ad altre farine, si ottengono prodotti dietetici e alimenti per l infanzia mentre l orzo puro, unito alle mandorle, dà l orzata. Questo cereale viene comunemente impiegato anche come surrogato del caffè. Segale (Secale cereale) conosciuta fin dal neolitico, la sua coltivazione cominciò ad intensificarsi verso la fine dell età del ferro. In quel periodo rientrava fra le graminacee secondarie, ma a seguito di un peggioramento del clima si dimostrò particolarmente resistente, fino a diventare il principale raccolto in diverse aree geografiche. Soprattutto nel Nord Europa, la farina di segale viene oggi impiegata per la preparazione del pane, cracker e ciambelle, specialmente se miscelata a quella del frumento. Questo cereale è inoltre utilizzato nella preparazione di zuppe. In Italia, viene coltivato per lo più in zone di montagna. 12

13 Farro (Triticum beoticum) conosciuto fin dal neolitico e ancora oggi spontaneo in molte regioni orientali (Anatolia, Iraq, Iran e Libano), è un progenitore del grano odierno. Già nel 4300 ac, si seminava infatti sia il farro piccolo (T. monococcum) che quello grande (T. dicoccum), facendo di queste le specie cerealicole più importanti del periodo, con una leggera preferenza della prima rispetto alla seconda. L età del bronzo segnò un inversione di questa tendenza, con una preferenza nella coltivazione del farro grande ai danni di quello piccolo. Successivamente, la resa del farro diminuì a favore di altri cereali. Ricco di proteine, vitamine e sali minerali, ancora oggi il farro trova numerosi impieghi alimentari. Riso (Oryza sativa) originario dell Asia Orientale, viene generalmente coltivato nelle pianure irrigue. Durante le cerimonie pubbliche cinesi (2700 ac) questo cereale era già incluso fra le specie coltivate più importanti del momento (frumento, orzo, miglio e soia). Dopo il passaggio in Grecia a seguito della spedizione di Alessandro il Grande, il riso approdò in Italia nel 1468 mentre, le colture del novarese e del vercellese, presero il via all inizio del XVI secolo. A tutt oggi, il riso alimenta più della metà della popolazione mondiale. Può essere consumato lessato, in forma di farina o entrare nella preparazione della birra, sakè, distillazioni, etc. Sorgo (Sorghum vulgare) particolarmente diffuso nei paesi poveri (Africa e Asia), dove la Durrha comprende appunto speciali varietà di Sorghum, riveste un importanza paragonabile a quella del frumento nel resto del mondo. Ricco di ferro, questo cereale viene impiegato anche nella preparazione del pane, della birra e di altre bevande alcoliche. Miglio (Panicum miliaceum) spontaneo dal Caucaso alla Siberia, era noto già ai tempi del neolitico, ma fu solo alla fine dell età del bronzo che questo cereale raggiunse un certo livello d importanza, ulteriormente in crescita nella prima età del ferro mentre, oggi, la sua produzione è in lieve regressione. Ricco di ferro, il miglio resta comunque l alimento principale per molte popolazioni povere. L affine panico (Setaria italica), la cui coltivazione ebbe inizio nell età del ferro, viene generalmente utilizzato come nutrimento per gli uccelli. Mais (Zea mays) originario dell America, la sua coltivazione è stata introdotta in Italia verso la fine del XVI secolo ed è, a tutt oggi, uno dei cereali più diffusi nel mondo. Può essere consumato lessato, abbrustolito, in farina o in fiocchi. Dal germe si ottiene un olio ricco di acidi grassi essenziali e acido linoleico. Le Angiosperme vengono ulteriormente suddivise in Dicotiledoni, i cui semi sono provvisti di due cotiledoni e le foglie si presentano con una venatura reticolata. Tra le Dicotiledoni possono essere annoverate le Archiclamidee, le quali possono essere apetale (con fiori senza petali). Quest ultime comprendono le Poligonali che, a loro volta, comprendono le Poligonacee, caratterizzate da foglie partenti da una guaina membranosa distinta che circonda il fusto. Tra le Poligonacee può essere 13

14 menzionato il grano saraceno (Fagopyrum vulgare), una pianta spontanea dal Nepal alla Manciuria e coltivata soprattutto nell Asia Orientale, anche se la sua coltura è attualmente in lieve regresso. Ricca di calcio, la sua farina può essere utilizzata per l alimentazione umana, dove trova alto impiego nella preparazione di polente, pizzoccheri, pasta e pane. Il grano saraceno viene infine utilizzato come mangime per animali (soprattutto volatili) e per il foraggio verde. Le Archiclamidee vengono ulteriormente suddivise in dialipetale (con fiori provvisti di calice e corolla e, spesso, anche di petali), tra le quali è possibile trovare le Centrospermali che, a loro volta, possono essere con petali (piante grasse) o senza petali. Tra le Centrospermali senza petali possono essere menzionate le Amarantacee, tra le quali troviamo l amaranto (Amarantus specie) da cui è possibile ottenere farine alimentari. L amaranto era, fra l altro, alla base dell alimentazione delle popolazioni inca e atzeca. Ricco di calcio, proteine, ferro, fosforo e magnesio, si utilizza oggi per primi piatti, insalate e zuppe. Tra le Centrospermali senza petali possono essere annoverate le Chenopodiacee, tra le quali troviamo la quinoa (appartenente alla famiglia delle Chenopodium specie), da cui è possibile ricavare farine alimentari. Simile al sesamo e ricca di calcio e ferro, la quinoa viene oggi impiegata per la preparazione di pane, biscotti e sfarinati. Se ne può ricavare anche una bevanda alcolica. Nella figura 1.5 sono schematizzate le relazioni e/o distanze tassonomiche tra i cereali e altre specie da cui si possono ricavare farine per uso alimentare (45) Le proteine tossiche e/o immunogeniche In base alla loro funzione e localizzazione, le proteine dei semi (o chicchi) del frumento possono essere classificate in tre tipi: 1. proteine di membrana, localizzate in tutte le parti del chicco; 2. proteine di deposito, presenti esclusivamente nello strato impermeabile (endosperma); 3. proteine metaboliche, localizzate sia nell aleurone che nell embrione. Le sequenze di interesse per la MC sono comprese fra le proteine di deposito dell endosperma che, in base alla loro solubilità, possono essere classificate in quattro tipi: 1. albumine, solubili in soluzioni acquose; 2. globuline, solubili in soluzioni saline; 3. gliadine, solubili in soluzioni alcoliche; 4. glutenine, solubili in soluzioni debolmente acide. L insieme delle gliadine e glutenine costituisce il glutine, che può essere definito come la massa coesiva che rimane dopo il lavaggio di un impasto farinoso in acqua. Le qualità reologiche degli impasti farinosi dipendono proprio dall abilità del glutine di intrappolare il diossido di carbonio. Di norma, al glutine non viene attribuito alcun valore nutrizionale (46,47). 14

15 Figura Schema tassonomico dei cereali e altre specie da cui si ricavano farine Piante Crittogame Fanerogame Gimnosperme Alghe e funghi Angiosperme Pino, abete, ginepro, etc. Dicotiledoni Monocotiledoni Apetale Archiclamidee Glumiflore Graminacee (Poacee) Festucoidacee Avenacee Poligonali Poligonacee Grano saraceno Amarantacee Amaranto Dialipetale Centrospermali Senza petali Con petali Piante grasse Chenopodiacee Avena Cloridacee Teff Ordacee (Triticacee) Orizacee Riso Panicoidacee Quinoa Frumento Orzo Segale Farro Kamut Triticale Andropogonacee Sorgo Panicacee Miglio Tripsacee Mais Lacrima Jobi 15

16 Le frazioni alcool-solubili provenienti dai semi di più cereali vengono chiamate collettivamente prolamine, un termine che riflette la loro composizione aminoacidica, il più delle volte caratterizzata da un alto contenuto in prolina e glutamina, mentre aminoacidi essenziali come l acido glutamico, l acido aspartico, la lisina, la metionina e il triptofano sono inaspettatamente rari. Per questa ragione, da un punto di vista nutrizionale, una dieta priva di glutine non è svantaggiosa per i pazienti celiaci (48-50). D altra parte, a seconda del cereale di provenienza, le prolamine vengono designate come gliadine dal frumento, ordeine dall orzo, secaline dalla segale, avenine dall avena, orizine dal riso, zeine dal mais, etc. Il contenuto di prolamine nelle farine ottenute a partire da diversi cereali dipende dalla specie, dalla varietà e dalle condizioni di crescita. In questo senso, la farina di frumento esibisce il maggior contenuto in prolamine (4-5 g/100 g di farina) fino a giungere al riso che, di norma, ne è quasi privo (46,47). Come riportato nella tabella 1.3, le prolamine di alcuni di questi cereali sono ritenute responsabili delle lesioni che si generano nella mucosa intestinale dei pazienti celiaci (44,47,51). Tabella Cereali e relative prolamine in relazione alla MC Legenda: A = alanina; L = leucina; P = prolina; Q = glutamina. Cereale Prolamine Composizione Tossicità Frumento Gliadine 35% Q; 17-25% P +++ Orzo Ordeine 35% Q; 17-25% P + Segale Secaline 35% Q; 17-25% P + Avena Avenine Q; P? Riso Orizine Q; A, L - Mais Zeine Q; A, L - Le prolamine più studiate in relazione alla MC sono le gliadine, un complesso proteico estremamente eterogeneo contenente più di cento elementi monomerici lunghi circa residui aminoacidici che, sulla base della loro mobilità elettroforetica in ambiente acido, sono stati inizialmente ripartiti in quattro gruppi: α-, β-, γ- e ω-gliadine (52). Successivamente, sulla base delle loro sequenze aminoacidiche N-terminali che, peculiarmente, presentano tratti ripetuti ricchi in prolina e glutamina, tali elementi sono stati raggruppati nelle gliadine di tipo α, γ, e ω (53,54). Anche se la corrispondenza tra la vecchia e la nuova nomenclatura non è completa, si può assumere che le α- e β-gliadine separate elettroforeticamente costituiscano le gliadine di tipo α, mentre le γ- e ω-gliadine siano comprese, rispettivamente, tra quelle di tipo γ e ω (55). Al contrario delle gliadine, le frazioni parzialmente solubili in soluzioni alcaline (glutenine) tendono a formare grandi strutture polimeriche, contribuendo sostanzialmente alle caratteristiche di 16

17 elasticità e viscosità degli impasti farinosi (qualità reologiche). Tali frazioni proteiche sono state ripartite in glutenine ad alto peso molecolare (High Molecular Weight, HMW), lunghe circa residui aminoacidici, e in glutenine a basso peso molecolare (Low Molecular Weight, LMW), lunghe circa residui aminoacidici. Come le gliadine, sia le HMW che le LMW sono caratterizzate da un alto contenuto in prolina e glutamina e da un basso contenuto in acido glutamico e aspartico. Per questo motivo, anche alle glutenine di norma non viene attribuito alcun valore nutrizionale. Per ogni tipo gluteninico esistono infine molte varianti, anche se il più alto grado di varianza rimane quello esibito dalle gliadine (21). Poiché la funzione delle proteine del glutine è semplicemente quella di fornire aminoacidi nel momento della germinazione, mutazioni e/o duplicazioni dei relativi geni non sono state selezionate negativamente durante i processi evolutivi. Di conseguenza, tutti i frumenti coltivati portano copie geniche multiple raggruppate in cluster che, a loro volta, sono localizzati su differenti cromosomi, determinando un enorme grado di variazione allelica. Questa eterogeneicità, combinata con le caratteristiche peculiari dei prodotti genici, rende difficile analizzare e, soprattutto, classificare il glutine in modo univoco. Nella tabella 1.4 sono riassunte alcune caratteristiche dei geni e delle proteine del glutine (21,56). Tabella Caratteristiche dei geni e delle proteine del glutine Legenda: G = glicina; P = prolina; Q = glutamina. Gliadine LMW HMW Geni: Numero dei cluster Designazione dei cluster Gli-1; Gli-2; Gli-3/5 Glu-3; Gli-3/5 Glu-1 Numero dei geni >100 >40 6 Proteine: Proteine espresse >100 > Dimensioni delle proteine kd kd kd Numero degli aminoacidi Aminoacidi prevalenti Q (35%); P (25%) Q (35%); P (15%) Q (35%); G (20%) g proteine/100 g di farina 4,0-5,0 3,9-4,5 2,1-2,5 Le conoscenze attuali indicano che vari peptidi del glutine sono coinvolti nella MC con diverse modalità, così che alcuni frammenti vengono definiti tossici ed altri immunogenici. Nello specifico, un frammento viene definito tossico se è in grado di indurre un danno mucosale in vitro (colture di biopsie duodenali) o in vivo (intestino prossimale e/o distale). Parimenti, un frammento viene 17

18 definito immunogenico se è in grado di stimolare linee cellulari T HLA DQ2- o DQ8-ristrette e cloni cellulari T derivati dalla mucosa duodenale o dal sangue periferico dei pazienti celiaci. Innanzitutto, tramite l uso delle colture di biopsie duodenali, è stato possibile dimostrare che le gliadine hanno un grado di tossicità decrescente nei tipi α γ ω. La presenza di tratti simili (sequenze ripetute ricche in prolina e glutamina) nelle porzioni N-terminali delle prolamine di frumento, orzo e segale ha poi suggerito che, virtualmente, una certa sequenza aminoacidica può costituire il determinante tossico. A seguito del sequenziamento di una frazione delle α-gliadine lunga 266 residui aminoacidici, alcuni peptidi gliadinici sono stati sintetizzati e testati allo scopo di valuatare il loro grado di tossicità nella MC (Tabella 1.5) (41). Tabella Peptidi gliadinici tossici Legenda: A = alanina; E = acido glutamico; F = fenilalanina; G = glicina; L = leucina; N = asparagina; P = prolina; Q = glutamina; R = arginina; S = serina; V = valina; Y = tirosina. Sequenza aminoacidica Posizione Tossicità VPVPQLQPQNPSQQQPQEQ α-gliadina: PGQQQPFPPQQPY α-gliadina: PGQQQPFPPQQPYPQPQPF α-gliadina: PGQQQPFPPQQPYPQPQPFPSQQPY α-gliadina: PQPQPFPSQQPY α-gliadina: SQQPYLQLQPFPQPQLPY α-gliadina: LQLQPFPQPQLPYPQPQLPY α-gliadina: QQYPLGQGSFRPSQQNPQA α-gliadina: LGQGSFRPSQQN α-gliadina: Negli ultimi anni, grazie all uso combinato della cromatografia liquida a fase inversa e la spettrometria di massa, un numero ragguardevole di peptidi gliadinici e gluteninici sono stati purificati e testati per la loro immunogenicità. Tra i peptidi riportati in tabella 1.6, quelli la cui attività immunogenica è designata +++ sono stati definiti epitopi immunodominanti, quelli la cui attività è indicata come + sono stati descritti come peptidi ad attività immunogenica, mentre l unico la cui attività è designata - è stato definito semplicemente inattivo. Altre caratteristiche di questi dati sono: gli epitopi immunodominanti elicitano una forte risposta T cellulo-specifica in quasi tutti i pazienti mentre, quelli ad attività immunogenica, stimolano le cellule T solo in alcuni di loro; alcuni peptidi definiti inattivi o semplicemente immunogenici nella loro forma nativa, diventano potenti stimolatori delle cellule T dopo deamidazione di specifici residui di glutamina, una reazione che comporta la perdita di un gruppo aminico (NH 3 ) e la trasformazione della glutamina bersaglio in acido glutamico; 18

19 a seguito di riesposizione antigenica in vivo eseguita su pazienti celiaci guariti, nel loro sangue periferico è possibile rilevare alcune cellule T responsive verso gli epitopi immunodominanti prima ancora che le stesse cellule T possano rispondere a questo insulto, suggerendo un fenomeno di memoria immunologica (41). Tabella Peptidi gliadinici e gluteninici immunogenici Legenda: A = alanina; C = cisteina; D = acido aspartico; E = acido glutamico; F = fenilalanina; G = glicina; I = isoleucina; L = leucina; M = metionina; N = asparagina; P = prolina; Q = glutamina; R = arginina; S = serina; T = treonina; V = valina; W = triptofano; Y = tirosina; d = peptidi deamidati. Sequenza aminoacidica Posizione Immunogenicità VRVPVPQLQPQNPSQQQPQ α-gliadina: QNPSQQQPQEQVPLVQQQ α-gliadina: QVPLVQQQQFPGQQQPFPPQ α-gliadina: PGQQQPFPPQQPYPQPQPF α-gliadina: FPGQQQPFPPQQPYPQPQPF α-gliadina: QPYPQPQPFPSQQPYLQL α-gliadina: PQPFPSQQPYLQLQPFPQ α-gliadina: PQPQLPYPQPQLPY α-gliadina: 62-75/(d) +/+++ QLQPFPQPQLPY α-gliadina: 57-68/(d) +/+++ QLQPFPQ α-gliadina: (d) +++ LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF α-gliadina: 57-89/(d) +/+++ QLQPFPQPQLPY α-gliadina: 58-69/(d) +/+++ PQPQLPYPQPQLPY α-gliadina: 63-76/(d) +/+++ PFRPQQPYPQPQPQ α-gliadina: (d) + LIFCMDVVLQ α-gliadina: QQPLQQYPLGQGSFRPSQQNPQAQG α-gliadina: QYPLGQGSFRPSQQNPQA α-gliadina: /(d) +/+ PSGQGSFQPS α-gliadina: PSGQGSFQPSQQ α-gliadina: /(d) +/+++ SGQGSFQPSQQN α-gliadina: /(d) +/+++ QGSFQPSQQN α-gliadina: /(d) -/+++ LQPQQPFPQQPQQPYPQQPQ γ-gliadina: FPQQPQQPYPQQPQ γ-gliadina: FSQPQQQFPQPQ γ-gliadina: /(d) -/+ QPQQSFPEQQ γ-gliadina: /(d) +/+++ VQGQGIIQPQQPAQL γ-gliadina: /(d) +/+ QQQQPPFSQQQQSPFSQQQQ Glutenina: 40-59/(d) -/+ QQPPFSQQQQPLPQ Glutenina: 46-60/(d) -/+ SGQGQRPGQWLQPGQGQQGYYPTSPQQSGQGQQLGQ Glutenina: /(d) +/+ PGQGQQGYYPTSPQQSGQ Glutenina: GYYPTSPQQSGQGQQLGQ Glutenina: GYYPTSPQQSG Glutenina: QGYYPTSPQQS Glutenina: /(d) -/+ QQGYYPTSPQQSG Glutenina: GQQGYYPTSPQQSG Glutenina: GQQGYYPTSPQQS Glutenina: Poiché un peptide definito tossico non necessariamente è in grado di attivare cellule T-specifiche e viceversa, i dati sopra riportati esprimono una certa discrepanza tra la tossicità e l immunogenicità, anche se non escludono che una o più frazioni proteiche possano avere simultaneamente entrambe 19

20 le competenze. Ulteriori studi sono auspicabili per dirimere questo e altri dubbi, nonché per completare la già nutrita mappa di peptidi del glutine coinvolti nella patogenesi della MC. 1.4 Teorie evoluzionistiche E ormai noto che la sensibilità al glutine è conferita da un particolare assetto HLA, ciò nonostante, le origini evoluzionistiche della MC sono a tutt oggi incerte e limitate ad alcune ipotesi. La teoria più accreditata si basa sul fatto che l uomo, in origine, non introduceva glutine con la dieta né coltivava il grano da cui quest ultimo deriva mentre, con il passare del tempo, ha imparato sia a produrlo che a nutrirsene. In alcuni casi, il sistema HLA non sarebbe riuscito a tollerare tale apporto proteico scatenando, di conseguenza, una risposta irragionevole Il primo incontro dell uomo con il glutine Circa diecimila anni fa, con il passaggio dal Paleolitico al Neolitico, emerse la produzione del cibo, seguita dai primi grandi cambiamenti nello stile di vita umano (Tabella 1.7). Tabella Differenze e similitudini tra il Paleolitico e il Neolitico Paleolitico Uomini cacciatori e raccoglitori Nomadismo Famiglia nucleare Gruppi limitati Cambiamento molto lento Neolitico Uomini agricoltori e allevatori Sedenterizzazione Famiglia nucleare Gruppi più numerosi Curva del cambiamento più veloce Mentre nel Paleolitico l uomo era nomade, si nutriva di cacciagione e solo occasionalmente di piante spontanee (foraggiamento), a partire da diecimila anni fa alcune mutazioni ambientali e il raggiungimento della densità di saturazione (in questo caso, numero di prede insufficiente a sfamare la popolazione di una determinata area geografica) lo spinsero verso la sedenterizzazione. In termini pratici, l uomo cominciò ad allevare bestiame e a coltivare piante prettamente a scopo alimentare. E per questo motivo che si tende a datare il primo incontro massivo dell uomo con il glutine proprio agli albori della storia antica. Diecimila anni di coesistenza uomo-glutine e gli esiti di questo impatto suggeriscono che tale complesso proteico deve essere stato uno dei fattori influenzanti i processi evolutivi del Neolitico. Ciò nonostante, questo periodo può apparirci decisamente esiguo se confrontato con la lunghezza della storia evolutiva dell uomo o, a maggior ragione, con quella della terra (Tabella 1.8). Quest ultimo aspetto, insieme ai dati di pervalenza della MC nel mondo, suggerisce che il glutine potrebbe ancora oggi esercitare una pressione biologica sull evoluzione della specie umana (57). 20

21 Tabella Ere, periodi, riferimenti temporali espressi in milioni di anni fa e principali eventi storico-evoluzionistici che li caratterizzano Ere Neozòica (quaternaria) Cenozòica (terziaria) Mesozòica (secondaria) Paleozòica (primaria) Archeozoica (precambriàna) Periodi Milioni di anni fa Principali eventi Neolitico (86 milioni di uomini, sviluppo dell agricoltura, commercio e artigianato, lavorazione del rame, bronzo e ferro, grandi civiltà 0,008 Olocène storia antica Medio evo e rivoluzione industriale storia moderna) 0,015 Mesolitico (civiltà arcaiche, espansione dell umanità) 0,080 Paleolitico superiore (6 milioni di uomini, credenze religiose solari, rappresentazioni artistiche, uso delle abitazioni, gruppi sociali) Paleolitico medio (comparsa di H. sapiens in Africa e dell uomo di 0,180 Neandertal in Eurasia, H. sapiens colonizza l Eurasia, lavorazione delle Pleistocène pelli, utensili e inumazione dei morti) Paleolitico inferiore (inizio delle ere glaciali, estinsione di grandi 1,8 mammiferi, comparsa di Homo habilis e H. erectus in Africa, H. erectus colonizza l Eurasia, uso del fuoco, caccia e pesca preistoria) Ultimo antenato in comune con le scimmie (scimpanzè), primi ominidi Pliocène 7 (Australopithecus afarensis, A. africanus, A. boisei, A. robustus) Miocène 23 Oligocène 40 Eocène 60 Paleocène 70 Diffusione dei mammiferi e degli uccelli, grande sviluppo e diversificazione dei mammiferi (cavalli, balene, primati), diffusione delle angiosperme Cretàcico 130 Estinsione dei dinosauri, primi mammiferi placentati, prime angiosperme Giuràssico 200 Diffusione dei dinosauri, primi uccelli, primi mammiferi marsupiali Triàssico 245 Primi dinosauri, diffusione delle gimnosperme Permiàno 290 Numerose estinsioni di invertebrati, diffusione dei rettili, prime gimnosperme Carbonifero 350 Diffusione degli anfibi, diffusione degli invertebrati terrestri, primi rettili Devoniàno 400 Diffusione dei pesci, primi anfibi, primi invertebrati terrestri (insetti), diffusione delle pteridofite Siluriàno 420 Prime piante terrestri (briofite, pteridofite) Ordoviciàno 500 Primi vertebrati marini (ostracodermi), primi pesci (placodermi) Cambriàno 570 Diffusione degli invertebrati marini e delle alghe Algonchiano 700 Primi organismi pluricellulari (alghe, meduse e spugne) Comparsa dell atmosfera ossigenata, primi eucarioti Primi procarioti (batteri e alghe azzurre), fotosintesi Archeano Formazione della terra, evoluzione chimica (brodo primordiale) La mezzaluna fertile, l evoluzione e la diffusione del grano Indagini storico-geografiche hanno permesso di identificare la mezzaluna fertile, una fascia di territorio compresa fra l Anatolia, il sistema montuoso del Caucaso, l Arabia Saudita e il mar Mediterraneo, come la più antica area di produzione alimentare del mondo (Figura 1.6). Infatti, grazie al clima caratterizzato da un estate caldo-secca e un inverno mite con precipitazioni regolari, 21

22 tale zona è risultata particolarmente adatta alla domesticazione di piante spontanee a ciclo breve in grado di superare la stagione avversa sotto forma di semi non deperibili (tra cui, appunto, i cereali). Oltre alle condizioni climatiche, i caratteri che hanno reso questa regione così particolare sono stati: il fatto che fosse la più vasta distesa di terre a clima mediterraneo; la presenza di specie vegetali già molto produttive nella varietà selvatica e in grado di autofecondarsi, mantenendo così ogni mutazione utile per l uomo; la presenza di specie vegetali selvatiche già molto simili alle corrispondenti coltivate poiché, in tal modo, hanno subito nel tempo un minor numero di mutazioni rispetto a quelle di altre zone dove l agricoltura è comparsa spontaneamente (basti pensare al mais del Mesoamerica, il cui antenato selvatico aveva semi avvolti da uno spesso tegumento non commestibile e pannocchie lunghe poco più di un centimetro); la presenza di mammiferi adatti alla domesticazione, preziosi aiuti e fonti di proteine; la non adeguata presenza di prede animali che, nella scelta di tipo competitivo tra la produzione alimentare e la caccia-raccolta, ha favorito il primo stile di vita (57). Figura Posizione geografica della mezzaluna fertile Comprendente gli odierni stati Iraq, Libano, Palestina e Turchia del sud, la mezzaluna fertile è un territorio prevalentemente pianeggiante i cui rilievi si riducono al Libano, l Antilibano, i monti Zagros e il Tauro. I fiumi più importanti sono il Tigre e l Eufrate. Si pensa che all alba del Neolitico alcune piante selvatiche mutarono in modo da essere più gradite all uomo, che inizialmente le aiutava nella dispersione dei semi attraverso le latrine o i rifiuti. In 22

23 seguito, la grande quantità di semi ricavabile da alcune piante fra cui il predecessore del frumento attuale (l einkorn), convinse i cacciatori-raccoglitori della mezzaluna fertile a creare villaggi stanziali, segnando così la nascita dell agricoltura. Da quel momento il frumento selvatico andò incontro a una serie di modificazioni graduali, fino a raggiungere l espressione di tutte le specificità agro-alimentari che caratterizzano le varietà odierne. Per esempio, quando l einkorn raggiungeva la maturazione, i semi avvolti da un involucro erano soliti cadere sul terreno. Dato che si tendeva a mietere i semi saldamente attaccati alla spiga piuttosto che quelli sciolti, tale caratteristica limitava la resa del raccolto. La comparsa di piante i cui semi nudi rimanevano attaccati alla spiga, si è verificata grazie ad ibridazioni casuali tra l einkorn e altre graminacee selvatiche. Ciascuna ibridazione diede luogo a diverse combinazioni geniche e, quindi, a generazioni con differenti caratteristiche fenotipiche. In due di queste ibridazioni, l einkorn (genoma AA) si combinò con altre due graminacee selvatiche (BB e DD) dando luogo al frumento da pane contemporaneo (AABBDD). Dato che le generazioni successive mantennero queste caratteristiche, vennero coltivate sempre più varietà con semi nudi e saldamente attaccati alla pianta piuttosto che quelle con semi rivestiti e spighe fragili, facendo sì che tali caratteristiche siano ancora oggi presenti in tutte le specie coltivate (Tabella 1.9) (58). Tabella Tappe evolutive del grano Gruppo Einkorn Frumenti diploidi 2n=14 T. boeoticum [AA] (Einkorn più antico) T. urartu [AA] T. speltoides [BB] T. tauschii [DD] Gruppo Emmer Frumenti tetraploidi 2n=28 T. dicoccoides [AABB] (Sviluppato da T. urartu e T. speltoides) Gruppo Spelt Frumenti esaploidi 2n=42 Specie selvatiche Semi rivestiti, spiga molto fragile - Specie coltivate Semi rivestiti, spiga fragile T. monococcum [AA] (Farro piccolo, sviluppato da T. boeoticum) T. dicoccum [AABB] (Farro grande, sviluppato da T. dicoccoides) T. spelta [AABBDD] (Sviluppato da T. urartu, T. speltoides e T. tauschii) Specie coltivate Semi nudi, spiga robusta T. sinskajae [AA] T. turgidum [AABB] (Grano duro) T. turanicum [AABB] (Kamut) T. polonicum [AABB] (Gommer) T. aestivum [AABBDD] (Grano tenero, sviluppato da T. urartu, T. speltoides e T. tauschii) Anche se non particolarmente diffuso, il clima mediterraneo non è di certo una caratteristica esclusiva della mezzaluna fertile. Infatti, la nascita e l evoluzione dell agricoltura non avvenne soltanto nel vicino Oriente ma, più o meno contemporaneamente, anche nell America Centrale, 23

24 nell Africa equatoriale e nell Asia sud-orientale, tutte aree di diffusione delle piante selvatiche da cui derivano quelle a tutt oggi coltivate (frumento, mais, orzo e riso). In seguito, la velocità di propagazione delle tecniche agricole non fu influenzata da una diversa capacità di utilizzo delle specie domesticabili da parte delle popolazioni locali quanto, piuttosto, dalla direzione preferenziale degli assi dei continenti. Ad esempio, alle latitudini della mezzaluna fertile, questa propagazione venne facilitata dall estensione est-ovest del continente eurasiatico, lungo il quale le specie vegetali non incontrarono barriere climatiche insormontabili quali il freddo del nord o le continue piogge dell equatore (Figura 1.7) (57). Figura Diffusione dell agricoltura in accordo alla direzione preferenziale degli assi dei continenti La propagazione dell agricoltura (mais nelle Americhe, sorgo in Africa, frumento e orzo nella mezzaluna fertile, riso e miglio nell Asia sud-orientale) avvene in tempi più o meno brevi solo seguendo i percorsi preferenziali tracciati dagli assi dei continenti, simboleggiati in cartina dalle freccie con la doppia punta. La diffusione agricola a partire dalla mezzaluna fertile fino ad arrivare ai confini del mar Glaciale Artico (vale a dire dal tipico clima mediterraneo al freddo del nord Europa) avvenne, invece, con un ritardo di oltre quattromila anni. Certamente l agricoltura rappresentò un passo fondamentale nella storia evolutiva permettendo, fra l altro, la nascita e lo sviluppo di tecnologie avanzate, la conservazione del surpuls alimentare, un notevole aumento della densità di popolazione e l affermazione di classi non dedite alla produzione del cibo. Questi fattori portarono alla nascita e allo sviluppo di vere e proprie città, che in Medio Oriente contavano qualcosa come abitanti. Etimologicamente, il termine civilizzazione (dal latino civitas, da cui anche il sostantivo civiltà ) significa infatti vita da cittadino, nelle città. Come rovescio della medaglia, il passaggio dalla preistoria alla storia antica si fece portatore di alcuni elementi negativi quali la comparsa delle prime malattie epidemiche, dovute soprattutto al crescente contatto dell uomo con il bestiame (57). 24

25 1.4.3 L origine e l evoluzione della MC La responsabilità del ritardo esistente tra il primo incontro dell uomo con il glutine (10000 anni fa) e il riconoscimento della MC come tale (fine del XIX secolo) è da ricercarsi in diverse concause. Prime fra tutte le scarse conoscenze mediche, che hanno reso pressochè impossibile l osservazione e la descrizione del quadro tipico di malattia prima dell intervento di Samuel Gee e, in secondo luogo, i cambiamenti socio-alimentari che si sono verificati a partire da tre milioni e mezzo di anni fa, vale a dire con la comparsa dei primi ominidi. Accorpando i suddetti cambiamenti in Ere alimentari e valutando la presenza del glutine nella dieta in funzione di tali periodi, ne risulta un grafico come quello riportato in figura 1.8. Figura Variazioni della quantità di glutine nella dieta in funzione dei cambiamenti avvenuti nelle principali Ere alimentari Nell Era pre-agricola il contenuto del glutine nella dieta era tendente allo zero, fatta eccezione delle piante selvatiche raccolte dalle popolazioni nomadi, che solo occasionalmente venivano utilizzate per scopi alimentari. L Era agricola segnò l inizio della produzione alimentare che, a causa dei limiti tecnico-sociali e del ritardo nella diffusione delle conquiste sul campo, conobbe una curva evolutiva piuttosto lenta. Durante l Era agroindustriale, grazie soprattutto alla netta accelerazione registrata nella curva del cambiamento, il contenuto del glutine nella dieta crebbe rapidamente fino a raggiungere un plateau nel corso del XX secolo. Osservando il grafico riportato in figura 1.8, ciò che suscita maggiore attenzione è che, nonostante la prima Era alimentare sia cominciata tre milioni e mezzo di anni fa, i cambiamenti più importanti si sono verificati nell arco degli ultimi duecento anni. Quest ultimo aspetto, oltre a motivare il ritardo esistente tra il primo incontro dell uomo con il glutine e l esordio storico della MC, supporta l ipotesi che tale antigene alimentare possa ancora oggi esercitare una pressione biologica sull evoluzione della specie umana. Al fine di giustificare la sopravvivenza evoluzionistica della MC nella specie umana, è ancora una volta necessario compiere un passo all indietro, fino alla cosiddetta Era dell HLA vincente. In questo senso, è utile accennare che il successo dell uomo sulla maggior parte delle malattie è 25

26 mediato dall azione di una grande varietà di molecole, le quali consentono di maneggiare e riconoscere ogni possibile antigene estraneo. E il caso, questo, delle molecole appartenenti al sistema HLA, che nei processi evolutivi sono state selezionate proprio per la capacità di legare e presentare ai linfociti le proteine appartenenti ai patogeni più comuni. Tra queste molecole figura senz altro l HLA-DQ2, tipico del soggetto celiaco, ma attualmente presente anche nel 20-30% della popolazione generale. Stimando che nell Era pre-agricola gli eventi infettivi erano certamente più diffusi dell alimentazione a base di cereali, l utilità dell HLA-DQ2 nella risposta agli agenti patogeni dev essere stata molto più importante della nocività causata dal riconoscimento del glutine come proteina indesiderata. Per questo motivo, l HLA-DQ2 sarebbe stato trasmesso così frequentemente dai nostri antenati. A partire dalla seconda metà dell Era agricola, la concentrazione del glutine nella dieta salì rapidamente fino ad arrivare alla fine del XIX secolo, momento in cui venne descritto, nel dettaglio, il quadro tipico di MC. In quel periodo le infezioni alimentari erano ancora piuttosto diffuse e, verosimilmente, l insorgenza del quadro tipico di malattia poteva essere favorito dalla concomitanza di un danno intestinale post-infettivo e una massiccia assunzione di glutine durante il primo anno di vita. E probabile anche che, nei bambini affetti da celiachia, un infezione intestinale in atto potesse favorire la comparsa di un grave quadro di diarrea protratta nel tempo, perdita eccessiva di liquidi e ipoprotidemia fino allo shock (crisi celiaca). Poiché a partire dalla seconda metà del XX secolo le infezioni alimentari sono diventate sempre più rare e il glutine nel divezzamento è stato posticipato, è possibile affermarre che nel tempo la celiachia ha imparato a nascondere la sua facies intestinale, che oggi costituisce il quadro sintomatologico più raro. In questo momento storico stiamo vivendo, infatti, l Era della condizione celiaca, caratterizzata da un certo numero di malattie da intolleranza al glutine, ognuna delle quali si presenta con un quadro clinico variabile da una sintomatologia tipicamente intestinale (forme più rare) all occorenza di uno o più sintomi extra-intestinali (anemia sideropenica, ipertransaminasemia, osteopenia, etc.) o, ancora, alla sola evenienza di una patologia strettamente correlata (ad esempio, la dermatite erpetiforme) fino a giungere alle forme silenti, apparentemente prive d indicazioni cliniche suggestive di MC. Tutto questo evidenzia come da una malattia rara d interesse pediatrico, si è passati oggi a definire una condizione molto più diffusa (1) La teoria dell HLA vincente: una visione attuale Quella dell HLA vincente è rimasta una teoria speculativa fino al primo studio eseguito sui Saharawi, una popolazione arabo-berbera che, fino al secolo scorso, si cibava di latte e carne di cammello, modeste quantità di cereali, legumi e datteri. In particolare, nei primi anni di vita, i bambini venivano alimentati esclusivamente con latte materno. A seguito della colonizzazione 26

27 spagnola la loro alimentazione si arricchì di prodotti a base di cereali, mentre l allattamento al seno subì una riduzione drastica, tanto che i lattanti venivano divezzati già durante i primi tre mesi di vita. Attualmente i Saharawi vivono in un campo profughi dell Algeria centro-occidentale, dove il rifornimento alimentare, assicurato dagli aiuti umanitari europei, è costituito in larga misura da derivati del frumento. Recentemente, su un campione di quasi 1000 bambini Saharawi, è stata calcolata una prevalenza di MC pari a circa dodici volte quella attualmente stimata in Europa (18). Uno studio successivo ha dimostrato che questa popolazione presenta anche un elevata incidenza dell aplotipo HLA-DQ2, il quale, insieme al sopra menzionato carico alimentare a base di glutine, sembra essere stato il fattore responsabile del primo caso storico di endemia celiaca (19). Dal punto di vista evoluzionistico, è possibile ipotizzare che nei Saharawi HLA-DQ2 positivi, l atrofia intestinale potrebbe aver rappresentato un fattore protettivo. E infatti noto che una mucosa intestinale lievemente atrofica è rivestita da enterociti poveri di recettori per i microrganismi enterici i quali, non riuscendo ad aderire alle pareti, scivolano via senza esercitare il loro potere patogeno (59). Questo semplice corollario suggerisce come l HLA-DQ2, in grado di proteggere il singolo individuo da infezioni intestinali come il colera, potrebbe aver rappresentato un vantaggio selettivo nella storia naturale di questo popolo. Il cambiamento delle abitudini alimentari avrebbe poi causato il passaggio da un enteropatia lieve a una grave atrofia dei villi intestinali, sovvertendo così un equilibrio tra fattori genetici e ambientali stabilitosi in tempi più o meno remoti. Questa interpretazione evoluzionistica, sebbene necessiti di ulteriori conferme sperimentali, rappresenta oggi l unico modello applicabile al paradigma della conservazione dell aplotipo HLA-DQ2 nella storia naturale della MC. 1.5 La mucosa dell intestino tenue Dal punto di vista morfologico, la mucosa del piccolo intestino (detto tenue e formato dai tratti duodeno, digiuno e ileo) consta di tre strati: 1. Epitelio di rivestimento costituito da un monostrato di cellule cilindriche dette enterociti, si solleva in numerose estroflessioni digitiformi alte circa 1 mm e dette villi che sono, a loro volta, circondate da avvallamenti circolari, le cripte del Lieberkühn. Nel polo apicale, gli enterociti sono ricoperti da una struttura striata costituita da migliaia di microvilli, l orletto a spazzola o brush border, la cui funzione, al pari di quella dei villi e delle pieghe mucosali (pliche o valvole conniventi), è quella di aumentare la superficie di assorbimento. Un altra caratteristica delle cellule epiteliali è quella di aderire tenacemente l una all altra, così da formare una lamina di tessuto compatta che costituisca una barriera selettiva al passaggio di batteri, virus e vari antigeni alimentari per via paracellulare. Gli enterociti posano, infine, su una lamina basale, un 27

28 sottile strato di fibrille costituite da collageno, laminina, fibronectina e glicosaminoglicani (eparina e proteoglicano). 2. Lamina propria composta da tessuto connettivo areolare lasso, si solleva in sottili protrusioni coniche, ognuna delle quali forma lo stroma di un villo. Questo strato presenta una notevole varietà di tipi cellulari (leucociti, macrofagi, plasmacellule e linfociti), numerose ghiandole, linfonodi e capillari sanguigni e linfatici. 3. Muscolaris mucosae costituente lo strato più interno della muscolatura liscia intestinale, non partecipa alla formazione dei villi ma invia, al loro interno, esili fascetti muscolari che ne assicurano la motilità (60). Una delle caratteristiche della mucosa dell intestino tenue è la sua partecipazione ai processi finali della digestione. In questo senso la superficie dei microvilli è ricca di enzimi (di- e oligosaccaridasi, peptidasi e proteasi, lipasi, nucleosidasi, nucleotidasi etc.), spesso riconoscibili come glicoproteine associate alle membrane e dotate di catene laterali che sporgono nel lume, le quali operano la digestione finale di alcune piccole molecole alimentari. L epitelio dell intestino tenue è specializzato inoltre nella funzione di assorbimento dell acqua, degli elettroliti, dei vari nutrienti (carboidrati, proteine, lipidi, minerali e vitamine) e dei farmaci. In questo senso il polo apicale, rivolto verso il lume, è specializzato nell assorbimento dei prodotti della digestione mentre il polo baso-laterale, rivolto verso la lamina propria, interviene nei processi di trasporto delle sostanze assorbite verso la rete capillare sanguigna o linfatica sottostante. I tipi di trasporto implicati nei processi di assorbimento sono il cotrasporto, il controtrasporto, il trasporto attivo, la diffusione facilitata, la diffusione passiva e l endocitosi. La mucosa intestinale rappresenta infine la superficie corporea più esposta agli insulti antigenici, costituiti principalmente dai microrganismi e dagli antigeni alimentari. Di conseguenza, prevenire la penetrazione di composti indesiderati attraverso la barriera mucosale diventa essenziale per il mantenimento dello stato di salute. Tale barriera è costituita dal microambiente iuxtamucoso (barriera idrolitica), dalle plasmamenbrane (barriera fisica) e dal sistema immunitario mucosale (barriera immunologica). La barriera idrolitica comprende le mucine, le IgA secretorie, i sistemi secretori litici come il lisozima, le difensine e le criptidine, i batteri commensali e il gradiente di ph tra la superficie della mucosa (acida) e il contenuto intraluminale (alcalino). Per quanto concerne la barriera fisica, in prossimità del polo basale gli enterociti sono tenuti insieme dai desmosomi (macula adherens), verso il lume dalle intermediate junction (zonula adherens) e, vicino al polo apicale, dalle giunzioni serrate o tight junction (zonula occludens). Queste ultime giunzioni, costituite da glicoproteine calcio-dipendenti (E-caderine), sono particolarmente serrate, così che le 28

29 membrane apicali degli enterociti risultano congiunte a formare uno strato continuo (61). Il sistema immunitario mucosale verrà ampiamente descritto nei prossimi paragrafi Componenti cellulari del sistema immunitario associato alla mucosa intestinale A livello della mucosa intestinale, le cellule del sistema immunitario si trovano disseminate in tre regioni: lo strato epiteliale, la lamina propria e i follicoli linfatici mucosi o Placche di Peyer (PP). In ognuna di queste aree le cellule hanno caratteristiche fenotipiche e funzionali diverse. Lo strato epiteliale è popolato da linfociti intraepiteliali (IEL) T CD8+, nel numero massimo di 40 IEL ogni 100 enterociti. Un numero maggiore di IEL è indicativo di un processo patologico coinvolgente il sistema immunitario (62). Il 90% degli IEL esprime un TCR di tipo α/β mentre, il restante 10%, di tipo γ/δ. La lamina propria contiene una popolazione cellulare composita, nella quale spiccano i linfociti T CD4+ che, di norma, non esprimono marcatori di attivazione. In condizioni patologiche, è possibile riscontrare la presenza di linfociti T CD4+ provenienti dal tessuto linfoide associato all intestino (Gut-Associated Lymphoid Tissue, GALT) che esprimono marcatori di attivazione immunologica. Altri tipi cellulari riscontrabili nella lamina propria sono: plasmacellule, macrofagi, mastociti e, in condizioni particolari, granulociti eosinofili. Questi tipi cellulari sono in parte associati al GALT. All interno delle PP è possibile riscontrare i linfociti B (che, in questa sede, costituiscono la maggior parte della popolazione linfocitaria) e i linfociti T CD4+, in numero ridotto rispetto alla lamina propria (63) Alterazioni mucosali tipiche di MC La MC è caratterizzata da un complesso quadro di alterazioni morfologiche e funzionali a carico della mucosa dell intestino prossimale (duodeno e alto digiuno), in quanto esposto ad alte concentrazioni di glutine. All analisi morfologica si evidenzia un enterite diffusa caratterizzata dalla perdita della normale struttura dei villi, con immagini di distorsione, accorciamento o atrofia da parziale a totale. Lo spessore complessivo della mucosa appare diminuito a causa della perdita di cellule superficiali (esfoliazione), con evidenza di inadeguati stadi maturativi a carico degli elementi neoformati. Gli enterociti appaiono cuboidali, con perdita dei microvilli e vacuolizzazione del citoplasma. Le cripte del Lieberkühn presentano un attività mitotica aumentata e appaiono allungate, iperplastiche e tortuose. La lamina propria diventa sede di un infiltrato infiammatorio costituito da plasmacellule, macrofagi, eosinofili, mastociti e linfociti che, spesso, presentano un aspetto plasmocitoide o immunoblastico. Si evidenzia, infine, un aumento significativo del numero degli IEL (Figura 1.9). Poiché queste alterazioni, o parti di esse, possono manifestarsi in altre condizioni come la sprue tropicale (sindrome da malassorbimento ad etiologia infettiva, comune nei Carabi, nell Africa 29

30 centro-meridionale, in India, nel sud-est asiatico e nell America centro-meridionale), al fine di porre una corretta dignosi di MC diventa necessario verificare la condizione a seguito di una dieta aglutinata (64). Figura Alterazioni mucosali tipiche di MC A sinistra è visibile la situazione normale mentre, a destra, è riportato un caso di atrofia totale dei villi e marcato aumento di profondità delle cripte del Lieberkühn (vedi le frecce). E possibile ottenere una stima del grado di lesione grazie al rapporto altezza dei villi/profondità delle cripte che, normalmente, deve essere 3:1. Nel caso di destra, è evidente come tale rapporto sia alterato. A livello funzionale, l esposizione al glutine causa la ridotta attività di alcuni enzimi del brush border (ad esempio, lattasi, sucrasi, α-glucosidasi neutra, alcalin fosfatasi e leucil-β-naftilamidasi), mentre l attività di certi enzimi lisosomiali (ad esempio, fosfatasi acida) risulta aumentata. Al pari delle alterazioni morfologiche, anche quelle funzionali sono glutine-dipendenti (65). Non sempre il quadro sopra descritto è riscontrabile nei pazienti affetti da MC. Una delle forme atipiche meglio caratterizzate è infatti la celiachia latente, in cui la mucosa, pur apparendo morfologicamente integra, mostra fenomeni di attivazione immunologica del tutto sovrapponibili a quelli osservati nei celiaci classici (incremento del numero degli IEL γ/δ+ e/o aumento dell espressione di alcuni marcatori di attivazione immunologica sulle cellule mononucleate della lamina propria) (1,66). In alternativa, questa condizione può essere ricondotta ad un artefatto strumentale, correlabile alla piccola estensione della lesione e alla casualità del prelievo bioptico. In questo caso si parla di MC con atrofia a placche (la patchy atrophy degli autori anglosassoni). 30

31 1.6 Patogenesi Il coinvolgimento del sistema immunitario nella MC è un dato ormai acclarato. Il legame con gli antigeni HLA, i fenomeni d attivazione immunologica locali e gli elevati livelli sierici di AGA, EMA e anti-ttg, sono elementi qualificanti. Alla base di questa patologia gastroenterologica esiste, dunque, una risposta immune diretta contro diversi costituenti del glutine, in un primo momento innata e, successivamente, adattativa Ingresso dei peptidi del glutine nella lamina propria e permeabilità intestinale Sebbene un gran numero di studi siano stati eseguiti per chiarire il ruolo dei linfociti T nell induzione del danno intestinale, le conoscenze sulla fase di innesco della MC sono ancora limitate. Gli eventi primari della risposta immune glutine-indotta richiedono che gli oligopeptidi incriminati, nella loro forma nativa, abbiano libero accesso alla lamina propria attraverso la superficie relativamente impermeabile del monostrato enterocitario. In genere, gli oligopeptidi vengono efficientemente idrolizzati in aminoacidi, di- o tri-peptidi, ad opera delle peptidasi del brush border, prima che questi possano essere trasportati attraverso l epitelio. L evidenza di un gradiente di lesione del piccolo intestino in direzione prossimale distale, in associazione alla mancanza di una risposta immune diretta contro peptidi immunodominanti pretrattati con l enzima PREP, suggerisce un disequilibrio già a questo primo livello funzionale (41). Fino a pochi anni fa, un incrementato trasporto dei peptidi del glutine attraverso l epitelio intestinale era descritto solo nella celiachia attiva, suggerendo che l immaturità enterocitaria e/o i processi infiammatori tipici di questa fase di malattia potessero essere responsabili di tale evento. Questa interpretazione non spiegava, comunque, il passaggio degli oligopeptidi incriminati attraverso un epitelio ancora integro, durante le fasi iniziali di malattia (41). In questo senso, un importante contributo è stato fornito dall evidenza che i peptidi del glutine possono essere traslocati negli enterociti (trasporto transcellulare) all interno di vacuoli positivi per antigeni HLA di classe II (67), anche se la chiave di volta per la comprensione di questo meccanismo è stata fornita dall evidenza che il trasporto dei peptidi incriminati può avvenire per via paracellulare, tramite alterazione delle Tight Junction (TJ) (68). Inizialmente si è visto che alcune citochine proinfiammatorie, come il TNF-α e l IL-1, sono in grado di ridurre i livelli di trascrizione dell Ecaderina, allentando così le TJ (69). Ma l evidenza risolutiva è giunta da uno studio eseguito su intestino di ratto, in cui si è dimostrato che la somministrazione di glutine causa un apertura delle TJ in un pathway modulato dalla zonulina, una proteina in grado di alterare la polimerizzazione dei microfilamenti di actina, importanti regolatori della via di trasporto paracellulare (70). Un incrementata espressione della zonulina è stata inoltre dimostrata nella mucosa intestinale di 31

32 pazienti celiaci in fase attiva (71), deponendo ulteriori indizi a favore di un suo possibile ruolo nell innesco dei processi patogenetici tipici di MC. In dettaglio si ipotizza che i peptidi del glutine, via interazione con un recettore espresso sulla superficie enterocitaria, siano in grado di indurre una sovraespressione della zonulina che a sua volta, interagendo con i microfilamenti di actina, causerebbe l apertura della TJ (Figura 1.10). Figura Aumento della permeabilità intestinale via alterazione delle TJ Legenda: Zot = zonulina. In ogni modo, resta ancora da chiarire come i peptidi del glutine attraversino la membrana sulla quale poggiano le cellule epiteliali intestinali (membrana basale). A questo riguardo, è stato recentemente dimostrato che gli enterociti sono in grado di rilasciare vescicole esprimenti il complesso HLA di classe II/peptide antigenico del tutto simili agli esosomi secreti dalle APC professionali, e che questo processo viene amplificato dall Interferone (IFN)-γ, una citochina chiave nelle risposte adattative. I peptidi incriminati possono quindi attraversare quest ultima barriera tramite gli esosomi rilasciati dalla porzione baso-laterale degli enterociti (41). Una volta penetrati nella lamina propria, i frammenti del glutine possono essere catturati, processati e presentati dalle APC professionali ai linfociti T Risposta innata In generale, la risposta innata è un sistema di prima difesa contro l invasione di agenti microbici, agisce entro poche ore dall incontro con l antigene, prima che l attivazione T-cellulare e/o la sintesi anticorpale possano avere inizio e, infine, non è MHC-ristretta (27). 32

33 Nella MC, alcuni peptidi tossici (ad esempio, il p31-43 dell α-gliadina) sono in grado di indurre una cascata di eventi che si concretano con una sovraespressione dell IL-15 e della ciclossigenasi (COX)-2, la fosforilazione dell enzima MAP chinasi p-38 e l espressione dei marcatori di attivazione CD25 e CD83 su alcune cellule della lamina propria (macrofagi, monociti e cellule dendritiche, tutte a funzione APC). L espressione della COX-2, del CD25 e del CD83 è dipendente dall IL-15 e dalla MAP chinasi p-38 mentre, a sua volta, la fosforilazione di questo enzima dipende dall IL-15 (72). Tali eventi promuovono la differenziazione di vari tipi cellulari residenti nella lamina propria, rendendoli idonei alla funzione di APC. Questa prima fase, specificamente promossa dalle frazioni tossiche, assume quindi un ruolo propedeutico alla successiva presentazione dei peptidi immunodominanti ai linfociti T (72,73). Nella figura 1.11 sono schematizzati questi eventi e le loro interazioni con la risposta adattativa. Figura Alcuni eventi della risposta innata nella MC 1 = aumento della permeabilità intestinale; 2 = risposta innata; 3 = risposta adattativa. Legenda: Fosfo p-38 = MAP chinasi p-38 fosforilata; Anti-IL-15 mabs = anticorpi monoclonali anti-il-15; SB = inibitore selettivo della MAP chinasi p-38; COX-2 = ciclossigenasi-2; APC = cellule presentanti l antigene; DC = cellule dendritiche. L IL-15 stimolata dai peptidi tossici è inoltre implicata in alcune modificazioni epiteliali come l induzione dell espressione enterocitaria di Ki67, un marcatore di proliferazione cellulare, di TFR, il recettore della transferrina, e di Fas, un recettore coinvolto nei processi apoptotici (74). E stata infine descritta la capacità dell IL-15 di stimolare la migrazione di linfociti T specifici, con fenotipo TCR-γδ+ e CD94+, nel compartimento intraepiteliale (75). Parallelamente è ben noto che, sotto 33

34 stimoli infiammatori (IL-15) e/o di stress, gli enterociti esprimono non solo molecole HLA di classe II, ma anche di classe I-like tra cui il MIC-A e l HLA-E, normalmente riconosciuti dai recettori ad attività di natural killer NKG2D e CD94, presenti sugli IEL specificamente attivati dall IL-15 (41,75,76). Le interazioni NKG2D-MIC-A e CD94-HLA-E sono sufficienti ad attivare gli IEL e a promuovere, quindi, un marcato effetto citotossico ai danni degli enterociti (41,76). D altra parte la molecola Fas, la cui espressione sulla superficie enterocitaria (cellula bersaglio) è sempre indotta dall IL-15 (74), è in grado di riconoscere il suo ligando FasL espresso, fra l altro, sugli IEL (cellule effettrici). Da questa interazione risulta un effetto citotossico apoptosi-mediato ai danni degli enterociti (41). Attraverso l induzione dell IL-15, i peptidi ad attività tossica stimolano, quindi, un meccanismo risultante in un danneggiamento del tessuto intestinale (41,76). In definitiva, tutti questi eventi depongono per un ruolo chiave dell IL-15 nella risposta innata e, a più ampio respiro, nella patogenesi della MC. Nello specifico, oltre a causare un danneggiamento mucosale, la risposta innata ha il compito di promuovere alcune modificazioni a carico delle APC professionali atte a preparare il terreno alla successiva risposta adattativa, diretta contro gli epitopi immunodominanti. E interessante infine notare che questo meccanismo non prende mai corpo nei controlli sani, anche se HLA-DQ2 positivi. Dato che la risposta innata risulta essere propedeutica alla successiva coinvolgente gli antigeni HLA di classe II, questa evidenza può spiegare il motivo per cui solo alcuni degli individui HLA-DQ2 positivi sono in grado di sviluppare la MC (41) Risposta adattativa In generale, la risposta adattativa comprende i linfociti T e B, è MHC-ristretta, è in grado di ricordare precedenti incontri con l antigene, di adattarsi ed essere pronta per incontrare di nuovo la medesima molecola antigenica (27). Nella MC, questa fase ha inizio quando le APC riconoscono gli antigeni primari (epitopi immunodominanti) e li presentano, in associazione alle molecole HLA-DQ2 o -DQ8, ai linfociti T CD4+, determinando lo sviluppo di cloni di cellule T antigene-specifici sia a profilo Th1 (risposta cellulo-mediata) che Th2 (risposta umorale). La deamidazione dei peptidi incriminati, ad opera dell enzima ttg, crea neoepitopi che si legano con maggiore affinità agli antigeni HLA di classe II coinvolti in questo processo (41) Ruolo della trasglutaminasi tessutale La ttg è un enzima Ca 2+ -dipendente responsabile di alcune modificazioni post-traduzionali delle proteine a mezzo della reazione di transamidazione o, in alternativa, di deamidazione di specifici residui glutaminici. La reazione di transamidazione consiste nella formazione di legami crociati ε(γglutamil)lisina tra il gruppo γ-carbossiamidico di un residuo glutaminico di una proteina e l ε-amino 34

35 gruppo (amina primaria) di un residuo lisinico di un'altra catena polipeptidica. La reazione di deamidazione coinvolge, invece, il gruppo γ-carbossiamidico di un residuo glutaminico di una proteina e una molecola di acqua, determinando la trasformazione della glutamina bersaglio (neutra) in acido glutamico (acido). In tutte e due le reazioni è previsto il rilascio di una molecola di ammoniaca (NH 3 ). A ph fisiologico (7,3-7,4) e in abbondanza di amine primarie, la reazione di transamidazione avviene più velocemente rispetto a quella di deamidazione. Al contrario, a ph debolmente acido e/o in mancanza di amine primarie, il rapporto tra la velocità delle due reazioni risulta invertito. I residui in posizione -1, +1, +2 e +3 rispetto alla glutamina bersaglio, e in particolare gli spazi che intercorrono tra un residuo glutaminico e la prolina più vicina, influenzano l attività enzimatica della ttg (Tabella 1.10) (21). Tabella Specificità enzimatica della ttg Legenda: F = fenilalanina; G = glicina; I = isoleucina; L = leucina; P = prolina; Q = glutamina; S = serina; T = treonina; V = valina; W = triptofano; Y = tirosina; Xaa = qualsiasi aminoacido. La glutamina bersaglio è indicata in grassetto. Specificità enzimatica Sequenze preferite dalla ttg Sequenze non preferite dalla ttg Sequenze Q-Xaa-P Q-Xaa-P-(I, L, V, F, Y, W, T, S) Q-P Q-G Q-Xaa-Xaa-P Q-Xaa-Xaa-G I peptidi del glutine, particolarmente ricchi in residui glutaminici, si presentano come ottimi substrati per l attività enzimatica della ttg (21) Legame dei peptidi immunodominanti con le molecole HLA di classe II Una volta penetrati nella lamina propria, i peptidi immunodominanti vengono deamidati nell ambiente leggermente acido del piccolo intestino (ph ~6.6), una condizione favorente questo tipo di reazione ad opera dell enzima ttg. I peptidi così acidificati vengono quindi catturati dalle APC professionali e, successivamente, presentati ai linfociti T a mezzo della molecola HLA-DQ2 che, per operare un legame ad alta affinità, richiede residui caricati negativamente alle posizioni di ancoraggio P4, P6 e P7, o a mezzo dell HLA-DQ8, il quale richiede residui caricati negativamente alle posizioni di ancoraggio P1, P4 e P9 (21). Tramite cristallografia a raggi X, il complesso formato da un HLA-DQ2 e un epitopo del glutine è stato recentemente descritto come un intricato network di legami idrogeno tra le due molecole. Nello stesso studio si è dimostrato che, se deamidato, tale epitopo mostra un affinità di legame con 35

36 l HLA-DQ2 venticinque volte superiore a quella esibita nella sua forma nativa. L ipotesi è che l epitopo deamidato presenta accettori più potenti e per questo in grado di formare legami idrogeno addizionali, risultanti in un complesso peptide-hla-dq2 più stabile (77). A questo punto è possibile affermare che, lungo la sequenza aminoacidica dei peptidi del glutine, la presenza di tratti ripetuti ricchi in prolina e glutamina assume un senso ben preciso, riassumibile nei successivi tre punti: 1. La prolina è un aminoacido la cui alta concentrazione in date sequenze peptidiche ne incrementa la resistenza all azione digestiva delle proteasi umane. Questo fa sì che peptidi particolarmente ricchi in prolina e glutamina come quelli di cui sopra, non potendo essere scissi in componenti più semplici, risultino fortemente immunogenici. 2. La presenza ripetuta di residui prolaminici e glutaminici nella loro sequenza aminoacidica, fa di questi peptidi un substrato preferenziale per l enzima ttg che, a sua volta, ne incrementa l immunogenicità. 3. Questi peptidi assumono naturalmente una configurazione strutturale caratterizzata da una conformazione secondaria elicoidale levogira di tipo poliprolinico, una delle preferite da tutte le molecole HLA di classe II (41) Risposta cellulo-mediata e rimodellamento mucosale La risposta cellulo-mediata a profilo citochinico Th1, controllata dai linfociti T CD4+ che riconoscono i peptidi del glutine ristretti per l HLA-DQ2 o -DQ8, gioca un ruolo centrale nei processi infiammatori e nella genesi delle lesioni mucosali tipiche di MC (41). Le fasi precoci sono mediate dall azione delle citochine pro-infiammatorie IFN-α e IL-18 rilasciate dai macrofagi e dalle cellule dendritiche (APC) che, in associazione alla presentazione antigenica degli epitopi immunodominanti, promuovono l attivazione dei linfociti T CD4+ a profilo Th1 con conseguente rilascio di IFN-γ (21). Il contributo dell IL-12, un induttore del profilo citochinico Th1 tramite attivazione del fattore di trascrizione Signal Transducer and Activator of Transcription (STAT)-4, sembra invece essere meno rappresentativo (21,32). Recentemente si è visto che, in presenza di STAT-1, l IFN-γ è in grado di indurre il T-bet, un membro della famiglia dei fattori di trascrizione T-box che, a sua volta, promuove la produzione dell IFN-γ in un pathway IFNγ STAT-1 T-bet IFN-γ. Questo pathway amplifica la produzione dell IFN-γ inizialmente stimolata dall IFN-α e dall IL-18 e, inoltre, fornisce una valida alternativa alla via tradizionale IL- 12/STAT-4 per la regolazione e lo sviluppo del profilo citochinico Th1 (32). A questo punto, le cellule T CD4+ producenti IFN-γ stimolano i linfociti T CD8+ i quali, attraverso un meccanismo apoptotico Fas-FasL mediato e la produzione di granzyme, contribuiscono ai fenomeni di citotossicità a carico degli enterociti. Parallelamente, l INF-γ prodotto da tutte le linee cellulari T 36

37 induce i fibroblasti a rilasciare le metalloproteasi (MMP)-1 e -3, le quali si rendono responsabili della degradazione sia della matrice extracellulare che della membrana basale. In dettaglio, l MMP- 3 degrada varie proteine non-collagenose a livello della matrice extracellulare mentre l MMP-1 disgrega le fibrille di collageno presenti nella lamina basale. Infine, l INF-γ stimola gli enterociti a rilasciare gli esosomi contenenti i peptidi del glutine, nonché i fibroblasti a secernere l enzima ttg, eventi questi che alimentano ulteriormente l attivazione immunologica attraverso la deamidazione dei frammenti immunodominanti e la successiva formazione di neoepitopi (41). Nella tabella 1.11 sono riassunte alcune caratteristiche delle proteine del glutine in relazione ai processi patogenetici tipici di MC (56). Tabella Caratteristiche delle proteine del glutine in relazione alla MC Gliadine LMW HMW Requisiti associati alla MC: Epitopi T-cellulari 9 (DQ2); 1 (DQ8) 2 (DQ2) 1 (DQ8) Motivi ttg-specifici Molti Molti Pochi Affinità di legame con l HLA-DQ2: Peptidi nativi Scarsa?? Peptidi trattati con la ttg Buona?? Risposta T-cellulare a: Peptidi nativi Rara Rara Rara Peptidi trattati con la ttg Assoluta Frequente Frequente Risposta umorale La risposta umorale a profilo citochinico Th2, controllata dai linfociti T CD4+ che riconoscono i peptidi del glutine ristretti per l HLA-DQ2 o -DQ8, comporta la produzione degli anticorpi specifici di MC (41). Questa fase ha inizio quando i linfociti B quiescenti, grazie alle loro Ig di membrana, vengono a contatto con gli antigeni presenti nella lamina propria. A questo punto, per l attivazione e la differenziazione in plasmacellule secernenti anticorpi, sono necessari ulteriori segnali forniti dai linfociti T CD4+ a profilo Th2 (cooperazione T-B). Il contatto tra questi due tipi cellulari avviene in seguito alla riesposizione degli antigeni in associazione alla molecola HLA-DQ2 o -DQ8 ad opera dei linfociti B, processo mediato da molecole di adesione (LFA1 e LFA3 sulla cellula B che si legano, rispettivamente, con ICAM-1 e CD2 sulla cellula T) e di costimolazione (B7/BB1 sulla cellula B che si lega al CD28 sulla cellula T). In seguito a questo contatto, il linfocita T rilascia alcune citochine come l IL-4 e l IL-5, le quali incrementano la secrezione di anticorpi da parte delle 37

38 cellule B attivate. Per lo sviluppo, l espansione clonale e la commutazione di classe, è necessario inoltre il legame tra il recettore CD40, espresso sulle cellule B, e il suo ligando CD40L, espresso sui linfociti T (27,33). Per quanto concerne gli anticorpi prodotti, è facilmente intuibile come gli AGA siano una conseguenza diretta della risposta T glutine-specifica. Risulta più complesso, invece, tentare di spiegare il motivo per cui vengono prodotti anticorpi diretti contro la ttg. L ipotesi più probabile, basata sull evidenza che la ttg è in grado di promuovere cross-link tra se stessa e i peptidi del glutine, prevede che quando tali complessi proteici vengono catturati dai linfociti B, processati e riesposti alle cellule T glutine-specifiche, vale a dire già attivate da un primo incontro con i peptidi del glutine presentati da APC professionali, ne risulta un pool di plasmacellule secernenti o solo AGA, o AGA e anti-ttg o, in alternativa, solo anti-ttg. Questo scenario indica che gli anticorpi anti-ttg potrebbero essere secondari allo sviluppo della risposta T glutine-specifica e, quindi, non attivamente coinvolti nei processi tipici di MC (76). Nella figura 1.12 sono riassunti i processi immunologici trattati in questa sede Autoimmunità secondaria Fenomeni di autoimmunità secondaria sono stati descritti solo per quanto concerne la risposta umorale, con evidenze di autoanticorpi diretti contro specificità antigeniche diverse da quelle direttamente coinvolte nella MC ma che, spesso, si rendono responsabili di altre condizioni patologiche. La presenza di anticorpi diretti contro la transglutaminasi epidermica (anti-tge) è stata dimostrata in soggetti affetti da dermatite erpetiforme (DE), una manifestazione cutanea della MC. Dato che questa condizione è caratterizzata da depositi cutanei di IgA recentemente descritti come immunocomplessi formati dall antigene TGe legato agli anticorpi specifici, questi ultimi sono stati indicati come l agente causale delle manifestazioni tipiche della DE (78). Parallelamente, la presenza di anticorpi diretti contro la ttg ossea è stata evidenziata in celiaci con complicazioni coinvolgenti tale distretto tessutale. Anche in questo caso, si è ipotizzato che gli anti-ttg ossea possono avere un ruolo chiave nella genesi delle manifestazioni osteoporotiche associate alla MC (79). Queste due evenienze sono indicative di spreading antigenico, un fenomeno nel quale i cloni linfocitari adattano la propria specificità a diverse condizioni ambientali come, ad esempio, l inversione del rapporto tra la disponibilità dell antigene primario (in questo caso, la ttg del piccolo intestino) e quella di una sua isoforma (TGe o ttg ossea) (27). L ambiente leggermente acido del piccolo intestino induce la ttg a catalizzare reazioni di deamidazione piuttosto che di transamidazione, anche se la formazione di cross-link tra i residui glutaminici degli antigeni primari e quelli lisinici dell enzima stesso sono stati descritti e imputati 38

39 nel processo di genesi degli autoanticorpi specifici di MC (76). Dato che la lamina propria dell intestino tenue è ricca di proteine del self in grado di esibire amine primarie utili alla reazione di trasamidazione, virtualmente il processo di cui sopra potrebbe prendere corpo anche per altre specificità antigeniche. Se fondata, questa ipotesi potrebbe giustificare la presenza degli anticorpi anti-zonulina, anti-calreticulina e anti-actina nel siero di alcuni pazienti celiaci (71,80,81). Figura Risposta immunologica al glutine tipica di MC Legenda: IL = interleuchina; IL-15R = recettore dell interleuchina 15; MIC = molecole MHC di classe I-like; HLA = complesso maggiore di istocompatibilità umano; IEL = linfociti intraepiteliali; TJ = tight junction; LPMC = cellule mononucleate della lamina propria; CD25 = catena α del recettore dell interleuchina 2; COX-2 = ciclossigenasi-2; CD83 = marcatore di attivazione superficiale delle cellule mononucleate; DC = cellule dendritiche; ttg = transglutaminasi tessutale; TCR = recettore dei linfociti T; FasL = ligando della molecola Fas; IFN-γ = interferone-γ; IgA e IgG = isotipi anticorpali. Nei pazienti celiaci è stata recentemente riscontrata la presenza di anticorpi diretti contro un costituente nucleare in grado di cross-reagire con alcuni componenti del glutine. Sulla base di queste evidenze, gli autori dello studio hanno suggerito che un meccanismo di mimetismo molecolare potrebbe innescare i processi patogenetici della MC (82). Il mimetismo molecolare è basato sul concetto di degenerazione dei legami antigene-mhc e antigene-mhc-tcr, vale a dire che un clone linfocitario attivato da un antigene primario può rispondere anche a un altro antigene 39