Studies of the number of different mrnas suggest that, at any one time, a typical

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1 REGOLAZIONE DELLA ESPRESSIONE GENICA

2 Una completa descrizione della sequenza di DNA di un organismo non sarebbe in grado di ricostruire lo stesso organismo più di quanto una lista di vocaboli inglesi non sarebbero in grado di ricostruire un sonetto di Shakespeare. In entrambi i casi il problema principale consiste nel conoscere come gli elementi nella sequenza di DNA o le parole nella lista siano usate. Sotto quali condizioni ciascun prodotto genico viene generato? E una volta sintetizzato, cosa fa?

3 IN GENERE IL CONCETTO DI REGOLAZIONE RISPONDE ALLA NECESSITA DI INDURRE O REPRIMERE CERTE ATTIVITA GENICHE, IN RELAZIONE ALLA RICHIESTA DI ACCENDERLE O SPEGNERLE.

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5 Studies of the number of different mrnas suggest that, at any one time, a typical human cell expresses approximately 10,000-15,000 of its approximately 22,000 genes. The level of expression of almost every active gene varies from one cell type to another. The patterns of mrna abundance are so characteristic of cell type that they can be used to type human cancer cells of uncertain tissue origin.

6 mirna

7 Filamento lungo il quale il DNA viene scansionato, detto filamento stampo.. La sequenza di RNA sarà identica (a meno della U alposto della T) a quella del filamento antisenso (complementare dello stampo)

8 PROCARIOTI 5 3 A livello trascrizionale le cellule batteriche regolano l espressione genica attraverso il modello dell operone. L operone è un tratto di DNA comprendente (in sequenza dal 5 -P al 3 -OH) tratti regolativi (promotore ed operatore) e geni strutturali (solitamente correlati tra loro nella loro funzione).

9 Gli operoni si distinguono in: 1) Inducibili (se possono essere accesi da un determinato induttore). Solitamente sono catabolici (degradano cioè substrati); 2) Reprimibili (se possono essere accesi da un determinato repressore). Solitamente sono anabolici (sintetizzano cioè substrato)

10 OPERONE Lac: : UN ESEMPIO DI OPERONE INDUCIBILE 6.1 Kb PREMIO NOBEL 1965 Françis Jacob Jacques Lucien Monod

11 IL LATTOSIO, UNA VOLTA ENTRATO NELLA CELLULA AD OPERA DELLA PERMEASI E CONVERTITO IN GLC E GAL OPPURE IN ALLOLATTOSIO DALLA β-galattosidasi. NOTA: L ALLOLATTOSIO E IL REALE INDUTTORE DELL OPERON Lac!

12 OPERONE Lac: : UN ESEMPIO DI OPERONE INDUCIBILE Un esempio di come il Lattosio viene degradato, se presente nel mezzo di coltura, in Glucosio e Galattosio nei REGOLAZ. ALLOSTERICA batteri.

13 REGOLAZIONE POSITIVA DELL OPERONE Lac MEDIANTE L ATTIVITA DEL GLUCOSIO In E. coli l adenilato ciclasi viene attivata dalla forma fosforilata dell enzima IIIGlc. Alti livelli di Glc determinano la defosforilazione di IIIGlc, con conseguente inattivazione dell adenilato ciclasi e diminuzione dei livelli di camp! Alti livelli di Glc nel mezzo di coltura = scarsa efficienza di trascrizione (e traduzione) dell operone; Bassi livelli di Glc nel mezzo di coltura Associati a presenza di Lattosio = elevata efficienza di trascrizione dell operone

14 OPERONE Trp: : UN ESEMPIO DI OPERONE REPRIMIBILE

15 OPERONE Trp: : UN ESEMPIO DI OPERONE REPRIMIBILE IL GENE REGOLATORE DELL OPERON Trp E trpr, LOCALIZZATO AD UNA CERTA DISTANZA DALL OPERON Trp. IL PRODOTTO DI TrpR E UNA PROTEINA APO= REPRESSORE CHE AGISCE COME REPRESSORE SOLO IN PRESENZA DELLA MOLECOLA EFFETTORE Trp! IN PRESENZA DI REPRESSORE ATTIVO LA TRASCRIZIONE PUO ESSERE RIDOTTA DI CIRCA 70 VOLTE.

16 REGOLAZIONE A LIVELLO POST-TRASCRIZIONALE TRASCRIZIONALE IL MECCANISMO DELL ATTENUAZIONE OPERON Trp

17 OPPURE L ATTENUAZIONE DELLA TRADUZIONE, ATTRAVERSO IL LEGAME DI MOLTI His-tRNA E, CONSEGUENTEMENTE, DI MOLTI RIBOSOMI A LIVELLO DI UNA SEQUENZA DETTA Leader, INTERPOSTA TRA LA SEQUENZA OPERATORE ED I GENI STRUTTURALI. TALE LEGAME DETERMINA UN RIPIEGAMENTO DELL mrna TALE CHE SI STACCHI DALLA POLIMERASI.

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20 REGOLAZIONE A LIVELLO POST-TRASCRIZIONALE TRASCRIZIONALE IL MECCANISMO DELL ATTENUAZIONE OPERON His NEL CASO DELL OPERONE His, SI PUO AVERE UNA REGOLAZIONE A LIVELLO TRASCRIZIONALE, DIRET= TAMENTE SUL DNA, ATTRAVERSO IL LEGAME DEL COREPRESSORE (His STESSA) ALLA PROTEINA L ATTENUAZIONE PUO RIDURRE IL LIVELLO DI TRASCRIZIONE DELL OPERONE DA 8 A 10 VOLTE. REPRESSORE

21 EUCARIOTI mirna CONTROLLO A LIVELLO DEL DNA CONTROLLO TRASCRIZIONALE CONTROLLO POST-TRASCRIZIONALETRASCRIZIONALE CONTROLLO DELLA TRADUZIONE CONTROLLO POST-TRADUZIONALETRADUZIONALE

22 IL CODICE ISTONICO

23 RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINA (In particolare iperacetilazione a livello delle Lisine)

24 Epigenetic modifications fall into two main categories: DNA methylation and histone modifications. Methylation of histone H3 lysine 4 (H3K4) and H3 lysine 36 is associated with transcribed chromatin. In contrast, methylation of H3 lysine 9 (H3K9), H3 lysine 27 (H3K27), and H4 lysine 20 (H4K20) generally correlate with repression ( Histone Code ).

25 H3K4 DIMETILATI E TRIMETILATI SONO PRESENTI NEL GENOMA IN PICCHI CHE SI SOVRAPPONGONO ALLA REGIONE PROMOTORE. IN PARTICOLARE VENGONO RICONOSCIUTE DA TAF3, INNESCANDO COSì L INIZIO DELLA TRASCRIZIONE! AL CONTRARIO LA DNA-METILTRANSFERASI (RESPONSABILE DELLA METILAZIONE DELLE ISOLE CpG) RICONOSCE SOLAMENTE REGIONI DEL DNA CON H3K4 NON METILATI! CIO E IMPORTANTE SOPRATTUTTO PER I GENI HOUSEKEEPING,, I CUI PROMOTORI TATA-LESS SONO CARATTERIZZATI DALLA PRESENZA DI ISOLE CpG

26 Compared with exocrine and β cells, differentiated α cells exhibited many more genes bivalently marked by the activating H3K4me3 and repressing H3K27me3 histone modifications. This was particularly true for β cell signature genes involved in transcriptional regulation. Remarkably, thousands of these genes were in a monovalent state in β cells, carrying only the activating or repressing mark. Our epigenomic findings suggested that α to β cell reprogramming could be promoted by manipulating the histone methylation signature of human pancreatic islets

27 CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION

28 L ESPRESSIONE GENICA DIPENDE DA UN EQUILIBRIO TRA EFFETTI DI STIMOLAZIONE ED EFFETTI DI INIBIZIONE PIUTTOSTO CHE DA UN SEMPLICE CODICE ISTONICO BIUNIVOCO. GROSSI COMPLESSI MULTIPROTEICI CHE RIMODELLANO LA CROMATINA (IN MODO ATP-DIPENDENTE) SONO IMPORTANTI REGOLATORI DELL ESPRESSIONE GENICA!

29 MENTRE GLI ENZIMI CHE MODIFICANO GLI ISTONI AGISCONO SU DI ESSI MEDIANTE MODIFICHE COVALENTI, I COMPLESSI DI RIMODELLAMENTO ATP-DIPENDENTI MODIFICANO LA POSIZIONE DEI NUCLEOSOMI NEL DNA. ALCUNI COMPLESSI DI RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINA PROVVEDONO A SOSTITUIRE ALCUNI ISTONI CON DELLE VARIANTI. AD ES. CENP-A E UNA VARIANTE DELL ISTONE H3 CHE SI RITROVA A LIVELLO DELL ETEROCROMATINA DEL CENTROMERO. H2A.Z (VARIANTE DELL ISTONE H2A) D ALTRA PARTE SI RITROVA PRINCIPALMENTE IN REGIONI EUCROMATICHE. INFINE MACRO H2A (ALTRA VARIANTE DI H2A) E ASSOCIATO AI NUCLEOSOMI DEL CROMOSOMA X INATTIVO.

30 PROTEINE QUALI HP1 (HETEROCHROMATIN PROTEIN 1) SONO PROTEINE NON ISTONICHE, ALTAMENTE CONSERVATE DALL EVOLUZIONE, CHE NORMALMENTE SI TROVANO NELL ETEROCROMATINA. IN PARTICOLARE HP1 CONTIENE UN CROMODOMINIO CHE LEGA H3K9me3. A SUA VOLTA HP1 LEGHERA H3K9 METILTRANSFERASI PERMETTENDO UNA ESPANSIONE DELL ETEROCROMATIZZAZIONE. HP1 RAPPRESENTA UNA PIATTAFORMA SU CUI POSSONO ESSERE ASSEMBLATE VARIE PROTEINE CHE RIMODELLANO LA CROMATINA (ISTONEMETILTRANSFERASI, HDAC )

31 LA MEMORIA EPIGENETICA DIPENDE DALLA METILAZIONE DEL DNA E DA GRUPPI DI PROTEINE POLYCOMB E TRITHORAX. NELL UOMO POLYCOMB (2 PROTEINE NOTE PRC1 E PRC2) METILANO H3K27 IN GENI BERSAGLIO, PRINCIPALMENTE COINVOLTI IN MECCANISMO DI SVILUPPO (INATTIVAZIONE INATTIVAZIONE). LE PROTEINE TRITHORAX (ES. MLL, IMPLICATA IN RIARRANGIAMENTI CROMOSOMICI ALLA BASE DELLA LEUCEMIA) METILANO H3K4 ATTIVANDO LA TRASCRIZIONE.

32 RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINA (2)

33 Epigenetica I CAMBIAMENTI EPIGENETICI SONO CAMBIAMENTI STABILI DELL ESPRESSIONE GENICA CHE PERò NON IMPLICANO ALCUNA MODIFICAZIONE NELLA SEQUENZA DEL DNA. Ad esempio: - metilazione del DNA (Es: Formazione dei corpi di Barr) ; - acetilazione degli istoni. Questi fenomeni epigenetici alterano l'accessibilita' fisica al genoma da parte di complessi molecolari deputati all'espressione genica e, quindi, alterano il grado di funzionamento dei geni.

34 CAMBIAMENTI EPIGENETICI EREDITARI Più NOTI SONO: 1)INATTIVAZIONE DEL CROMOSOMA X (MAMMIFERI) 2)IMPRINTING GENOMICO (VERTEBRATI IN GENERALE)

35 INATTIVAZIONE DEL CROMOSOMA X (MAMMIFERI) EMBRIONI XX ALLO STATO DI CELLULE INATTIVANO UNO DEI LORO CROMOSOMI X. L EVENTO E CASUALE, CIOE PUO ESSERE INATTIVATO GATTO CALICO FEMMINA O IL CROMOSOMA X MATERNO O QUELLO PATERNO E TALE INATTIVAZIONE VERRA MANTENUTA E PROPAGATA ALLA PROGENIE DI CELLULE DERIVANTI DA QUELLA IN CUI L INATTIVAZIONE SI E MANIFESTATA PER LA PRIMA VOLTA. CONSEGUENZA: LA FEMMINA ETEROZIGOTE E UN MOSAICO DI CLONI CELLULARI CIASCUNO DEI QUALI ESPRIME GLI ALLELI ALTERNATIVI DEL CROMOSOMA X DI ORIGINE PATERNA O MATERNA. ES: DISPLASIA ECTODERMICA IPOIDROTICA (MANCANZA DI GHIANDOLE SUDORIPARE A LIVELLO DI DENTI E CAPELLI (OMIM mutation in the gene encoding ectodysplasin-a (EDA))).)).

36 MECCANISMO DI INATTIVAZIONE DEL CHR. X 1) I CROMOSOMI X VENGONO CONTATI (TRAMITE AVVICINAMENTO DELLE REGIONI XIC (REGIONE DI DNA DI CA bp), DI INATTIVAZIONE DEL CROMOSOMA X); 2) XIC CODIFICA PER UN LUNGO RNA NON CODIFICANTE (XIST X INACTIVATION SPECIFIC TRANSCRIPT) CHE VIENE ESPRESSO SOLO DAL CROMOSOMA INATTIVO. XIST SI PENSA AGISCA RECLUTANDO FATTORI PROTEICI CHE DETERMINANO L ETEROCROMATIZZAZIONE DELL X; 3) ALCUNE REGIONI (SOPRATTUTTO QUELLE PSEUDOAUTOSOMICHE DEL CROMOSOMA X) SFUGGONO PERO ALLA ETEROCROMATIZZAZIONE E SI MANTENGONO ATTIVE; 4) DURANTE L OOGENESI, GLI OVOCITI APLOIDI RI-ATTIVERANNO IL CROMOSOMA X INATTIVO, PER POTER ESPRIMERE I GENI LEGATI ALL X

37 CARATTERISTICHE DEL DNA DEL CHR. X INATTIVATO FORTE ETEROCROMATIZZAZIONE DOVUTA A : i) PRESENZA DELL ISTONE MACRO H2A (IN LUOGO DI H2A); ii) IPOACETILAZIONE DEGLI ISTONI H3 E H4; iii) METILAZIONE INATTIVANTE DELL ISTONE H3; iv) METILAZIONE DEL DNA (A LIVELLO DELLE C DELLE ISOLE CpG)

38 METILAZIONE DEL DNA: 5-MeCpG (I) 5MeCpG NOTA: LA METILAZIONE DEL DNA E UNA CARATTERISTICA DEI VERTEBRATI, DELLE PIANTE SUPERIORI E DI ALCUNI FUNGHI. E PRATICAMENTE ASSENTE IN MOLTI ORGANISMI MODELLO (LIEVITO, DROSOPHILA ) 5HidroxyMeCpG L'OSSIDAZIONE DEL 5MeC È UN PASSO IMPORTANTE NELLA RIPROGRAMMAZIONE DEL GENOMA PATERNO DOPO LA FECONDAZIONE. DOBBIAMO CONSIDERARLO QUINDI COME UN IMPORTANTE EVENTO BIOLOGICO CHE SI VERIFICA NELLE PRIME FASI DEL CICLO DI VITA DEI MAMMIFERI. OGNI CELLULA DI MAMMIFERO SEMBRA CONTENERE 5-IDROSSIMETILCITOSINA, MA I LIVELLI VARIANO NOTEVOLMENTE A SECONDA DEL TIPO DI CELLULA. I LIVELLI PIÙ ALTI SI TROVANO IN CELLULE NEURONALI DEL SISTEMA NERVOSO CENTRALE. LA QUANTITÀ DI 5HMC AUMENTANO CON L'ETÀ, COME MOSTRATO NELL'IPPOCAMPO DI TOPO E NEL CERVELLETTO.

39 METILAZIONE DEL DNA: 5-MeCpG (ii) CpG islands (>50% CG for hundreds of Nucleotides) they are associated to active gene transcription regions and are important for genomic imprinting LA METILAZIONE DELLE C AVVIENE TRAMITE ENZIMI DNA METILTRANSFERASI. NELL UOMO CE NE SONO 3 FUNZIONALI (DNMT1, 3A, 3B), UNA (DNMT3L) CHE AIUTA AD INDIVIDUARE LE SEQUENZE APPROPRIATE ED UNA QUINTA (DNMT2) CHE METILA L RNA.

40 NEL DNA DEI VERTEBRATI UNA GRANDE FRAZIONE DELLE C DELLE ISOLE CpG E METILATA. LA METILTRANSFERASI DI MANTENIMENTO PERMETTE DI EREDITARE PATTERN DI METILAZIONE PRE-ESISTENTI ESISTENTI ANCHE DOPO LA DUPLICAZIONE DEL DNA

41 CIRCA IL 70% DELLE ISOLE CpG MOSTRANO UNA C METILATA NEI MAMMIFERI IN CONDIZIONI FISIOLOGICHE. UNA METILAZIONE ABERRANTE (AD ES. A LIVELLO DELLE ISOLE CpG ASSOCIATE AI PROMOTORI DI GENI ONCOSOPPRESSORI) E STATO DIMOSTRATO CONTRIBUIRE ALLA CANCEROGENESI.

42 LA REGIONE A DEL CHR. 6 E METILATA IN MODO DIFFERENTE A SECONDA DEL TESSUTO ED IN BASE AI DIVERSI CAMPIONI PER UNO STESSO TESSUTO. IL MODELLO DI METILAZIONE DI CpG PUO ESSERE INDIVIDUO-SPECIFICO, TESSUTO-SPECIFICO SPECIFICO E LOCUS-SPECIFICO. SPECIFICO. ALCUNE PROTEINE CHE RICONOSCONO LE 5MeC SE MUTATE POSSONO DETERMINARE MALATTIE ES.: MECP2 MUTATO CAUSA LA SINDROME DI RETT

43 IMPRINTING GENOMICO (VERTEBRATI) FENOMENO ATTRAVERSO CUI L ESPRESSIONE DI UN GENE DIPENDE DALLA SUA EREDITARIETA PATERNA O MATERNA

44 ESEMPIO DI METILAZIONE EREDITATA DAL SOLO ALLELE PATERNO

45 METILAZIONE DEL DNA DURANTE LO SVILUPPO UN ESTESA CANCELLAZIONE EPIGENETICA POTREBBE ESSERE IMPORTANTE PER RAGGIUNGERE UNA CONDIZIONE PLURIPOTENTE RELATIVAMENTE VERSATILE

46 MODIFICAZIONE DEL DNA CON BISOLFITO Treatment of DNA with bisulfite converts cytosine residues to uracil, but leaves 5-methylcytosine residues unaffected.

47 Alcuni geni vengono espressi solo se sono stati trasmessi dal padre, mentre altri vengono espressi solo se vengono trasmessi dalla madre. Il fenomeno della espressione differenziale dipendente dal sesso del genitore di origine viene chiamato imprinting. Mentre nella sindrome di Praeder-Willi è il cromosoma 15 materno ad essere presente in duplice copia, nella sindrome di Angelmann abbiamo una duplice copia del cromosoma paterno (puo verificarsi per Disomia Uniparentale o per Ricombinazione Omologa Non Allelica). In particolare in entrambe le sindromi la regione genomica interessata è quella del chr 15q11-q13. Nella PWS tale regione è metilata nel chr di origine materna e, siccome gli alleli paterni vengono persi per delezione, i geni contenuti nella controparte materna, essendo metilati, non possono esprimersi. Viceversa, nella AS sono i chr 15 paterni ad essere in duplice copia, con conseguente iperattività di quella coppia di cromosomi.

48 I SOGGETTI CON PWS MOSTRANO DIMINUZIONE DEL TONO MUSCOLARE IPOGONADISMO. IN ADOLESCENZA I PWS MOSTRANO RITARDO MENTALE, APPETITO INCONTROLLABILE E CONSEGUENTE GRAVE OBESITA. I SOGGETTI AS INVECE SONO DI PICCOLA STATURA, PIU GRAVEMENTE RITARDATI DEI PWS, HANNO DIFFICOLTA NEL LINGUAGGIO. IN ENTRAMBI I CASI LA REGIONE INTERESSATA E LA BANDA q11-q13 q13 DEL CHR. 15. AS E DETERMINATA DALLA MANCANZA DELLA COPIA MATERNA DEL GENE UBE3A.

49 The epigenome s makeup within a given cell is a function of genetic determinants, lineage-specific cues, and environment.

50 CONTROLLO DELL ESPRESSIONE A LIVELLO TRASCRIZIONALE LE PROTEINE REGOLATRICI DEI GENI CONTENGONO MOTIVI STRUTTURALI CHE POSSEGGONO LEGGERE SEQUENZE DI DNA

51 Cys STRUTTURE SUPER SECONDARIE, MOTIVI STRUTTURALI Zinc Finger (ZF) Motif Leucine Zipper (LZ) Motif a-elica Leu b-sheet Zn ++ His Helix-turn-Helix (HTH) Motif (Es.: Repressore dell operon Lac oppure proteine con omeodominio) Elica di riconoscimento Elica di stabilizzazione

52 PROTEINE CHE ATTIVANO I GENI TIPICAMENTE HANNO DUE DOMINI DISTINTI: 1) DOMINIO DI RICONOSCIMENTO DEL DNA; 2) DOMINIO DI ATTIVAZIONE L EFFETTO CONGIUNTO DI PIU ATTIVATORI CHE SI POSIZIONANO SUL PROMOTORE DI UN GENE E FRUTTO DEL PRODOTTO DEI SINGOLI EFFETTI DI CIASCUN FATTORE (EFFETTO SINERGICO)

53 TECNICHE PER LA IDENTIFICAZIONE DI FRAMMENTI DI DNA CHE LEGANO PROTEINE.OLTRE LA ChIP (1) TECNICA EMSA (ELECTRO MOBILITY SHIFT ASSAY) TECNICA FACILE (SI TRATTA SOLO DI UTILIZZARE ENZIMI DI RESTRIZIONE, METTERE A CONTATTO I FRAMMENTI DI DNA DIGERITO CON ESTRATTO PROTEINE NUCLEARI E FAR CORRERE SU GEL. LIMITE: SCARSA RISOLUZIONE FRAMMENTI OTTENUTI SONO TROPPO GRANDI E QUINDI E DIFFICILE RISALIRE A SEQUENZA DI LEGAME SPECIFICA.

54 (2) TECNICA FOOTPRINTING CON Dnasi I TRATTAMENTO CON DNasi ESEGUITO IN CONDIZIONI LIMITANTI (BASSA TEMPERATURA, SCARSA QUANTITA DI ENZIMA), IN MODO CHE IN MEDIA DA CIASCUNA COPIA DEL FRAMMENTO DI DNA SI ROMA UN LEGAME FOSFODIESTERICO ALLA VOLTA.

55 (3) TECNICA FOOTPRINTING CON DIMETILSOLFATO (DMS) TRATTAMENTO CON QUANTITA LIMITANTI DI DMS, IN MODO CHE IN MEDIA SOLO UNA G PER FRAMMENTO VENGA METILATA.

56 CROMATOGRAFIA PER AFFINITA PER IDENTIFICARE LA PROTEINA LEGANTE UNA SEQUENZA NUCLEOTIDICA

57 CONTROLLO COMBINATORIALE INIZIO TRASCRIZIONE EUCARIOTI

58 QUALE CHE SIA IL MECCANISMO PRECISO E L ORDINE IN CUI SI VERIFICA, UNA PROTEINA REGOLATRICE DEVE ESSERE LEGATA DIRETTAMENTE OD INDIRETTAMENTE PER INFLUENZARE LA TRASCRIZIONE DEL SUO PROMOTORE BERSAGLIO. LA VELOCITA DI TRASCRIZIONE DIPENDERA DALLO SPETTRO DI PROTEINE REGOLATRICI LEGATE A MONTE DEL SITO DI INIZIO DELLA TRASCRIZIONE.

59 6 DIVERSI MODI ATTRAVERSO CUI GLI EUCARIOTI REPRIMONO LA TRASCRIZIONE

60 LE PROTEINE REGOLATRICI EUCARIOTICHE SPESSO SI ASSEMBLANO IN COMPLESSI SUL DNA. LE PROTEINE REGOLATRICI CHE NON LEGANO DIRETTAMENTE IL DNA MA SI ASSEMBLANO SU PROTEINE REGOLATRICI LEGATE DIRETTAMENTE AL DNA SONO CHIAMATE COATTIVATORI O COREPRESSORI, A SECONDA DEL RUOLO SVOLTO.

61 ENHANCEOSOMA DI NORMA L ASSEMBLAGGIO DI UN GRUPPO DI PROTEINE REGOLATRICI SUL DNA E GUIDATO DA ALCUNI TRATTI RELATIVAMENTE BREVI DI SEQUENZA NUCLEOTIDICA. IN ALCUNI CASI SI FORMA UNA STRUTTURA Più COMPLESSA COSTITUITA DA PROTEINE ARCHITETTONICHE CHE INTERAGENDO CON IL DNA NE DETERMINANO UN RIPIEGAMENTO. OLTRE ALLA COMBINAZIONE DI TF ETERODIMERICI, L ASSEMBLAGGIO DI TALI COMPLESSI PROTEICI CONTRIBUISCE AL CONTROLLO COMBINATORIALE DELL ESPRESSIONE GENICA!

62 IL 5-10% DELLA CAPACITA DI CODIFICA DI UN GENOMA DI MAMMIFERO E DEDICATO ALLA SINTESI DI PROTEINE CHE REGOLANO LA TRASCRIZIONE. LE STESSE PROTEINE REGOLATRICI SONO INFLUENZATE DA SEGNALI CHE PROVENGONO DALL ESTERNO DELLA CELLULA E CHE POSSONO ATTIVARLE OD INATTIVARLE IN VARI MODI.

63 MODELLO DI CONTROLLO DEL GENE DELLA β-globina UMANA

64 IL GENE DELLA β-globina UMANA FA PARTE DI UN GRUPPO DI 5 GENI DELLE GLOBINE. I 5 GENI SONO TRASCRITTI ESCLUSIVAMENTE NELLA LINEA ERITROIDE E CIASCUNO E ACCESO IN UNO SPECIFICO STADIO DELLO SVILUPPO ED IN DIVERSI ORGANI. Chr. 11 LCR Regione di Controllo del Locus SOGGETTI CON DELEZIONI A LIVELLO DELLA LCR CHE CONTROLLA ESPRESSIONE DEI GENI GLOBINICI POSSONO ANDARE INCONTRO A TALASSEMIA ε-globina NEL SACCO VITELLINO, γ-globina NEL SACCO VITELLINO E NEL FEGATO FETALE, δ E β-globina NEL MIDOLLO OSSEO ADULTO

65 LCR (Locus Control Region) CONTROLLA LA CONDENSAZIONE DELLA CROMATINA. LE PROTEINE REGOLATRICI CHE SI LEGANO ALL LCR INTERAGISCONO ATTRAVERSO LA FORMAZIONE DI UN ANSA DI DNA CON PROTEINE ATTACCATE ALLE REGIONI DI CONTROLLO DEI GENI CHE REGOLANO. IN QUESTO MODO Può ESSERE ALTERATA LA STRUTTURA DELLA CROMATINMA E FAVORITA O MENO LA TRASCRIZIONE DEI GENI.

66 AN EXAMPLE OF HOW COMPLEX IS THE GENE EXPRESSION: SPATIO-TEMPORAL TEMPORAL PATTERNS Fetal Hb(Gg and Ag) [Liver] Adult Hb(d and b) [Bone Marrow]

67 GLI ELEMENTI ISOLATORI SONO REGIONI DEL DNA CHE LEGANO PROTEINE SPECIFICHE ED HANNO DUE PROPRIETA : 1) SCHERMANO I GENI DAGLI EFFETTI REPRESSIVI DELL ETEROCROMATINA; 2) POSSONO BLOCCARE L AZIONE DEGLI ENHANCER SI PENSA CHE LA DISTRIBUZIONE DEGLI ISOLATORI IN UN GENOMA LO DIVIDA IN DOMINI INDIPENDENTI DI REGOLAZIONE GENICA E DI STRUTTURA DELLA CROMATINA.

68 CONTROLLO COORDINATO DELL ESPR GENICA EUCARIOTICA: IL CASO DEGLI ORMONI STEROIDEI IL CORTISOLO QUANDO PRESENTE SI LEGA AL SUO RECETTORE (CHE ALTRIMENTI SAREBBE INATTIVO NEL CITOPLASMA CELLULARE) ED INTERAGENDO CON LE PROTEINE LEGATE AL PROMOTORE DI DIVERSI GENI, ATTRAVERSO IL RICONOSCIMENTO DI SPECIFICI ELEMENTI DI RISPOSTA COORDINA LA TRASCRIZIONE DI BATTERIE DI GENI IMPLICATE NEL SUO METABOLISMO (RISPOSTA ALLO STRESS, DIGIUNO ). TALI GENI SONO AD ESEMPIO IMPLICATI NELLA GLICOGENOLISI A LIVELLO DEL FEGATO.

69 LA CELLULA DEL MUSCOLO SCHELETRICO E UN SINCIZIO (CELLULA MULTINUCLEATA DERIVANTE DALLA FUSIONE DI PIU MIOBLASTI PRECURSORE). QUANDO I MIOBLASTI SI FONDONO DETERMINANO LA RIMODULAZIONE DELL ESPRESSIONE GENICA ED IL DIFFERENZIAMENTO CELLULARE ATTRAVERSO L ATTIVAZIONE DI PROTEINE MIOGENICHE (MyoD; Myf5; Miogenina; Mrf4) CHE HANNO UN TIPICO MOTIVO HTH E CHE NORMALMENTE SONO ESPRESSE SOLO NELLE CELLULE MUSCOLARI MATURE. OLTRE A TRASCRIVERE GENI PROPRI DEL MUSCOLO TALI PROTEINE MIOGENICHE STIMOLANO LA PROPRIA ESPRESSIONE MEDIANTE CIRCUITI A FEEDBACK! NON SOLTANTO CIASCUN GENE HA MOLTE PROTEINE REGOLATRICI CHE LO CONTROLLANO MA IN PIU CIASCUNA PROTEINA REGOLATRICE CONTRIBUISCE AL CONTROLLO DI MOLTI GENI!

70 COMBINAZIONI DI POCHE PROTEINE REGOLATRICI POSSONO GENERARE MOLTI TIPI CELLULARI DURANTE LO SVILUPPO. DURANTE LO SVILUPPO UNA CELLULA PUO ACCUMULARE UNA SERIE DI PROTEINE REGOLATRICI CHE NON ALTERANO NECESSARIAMENTE L ESPRESSIONE DEI GENI (COMMITMENT O DETERMINAZIONE CELLULARE). QUANDO VIENE AGGIUNTO IL MEMBRO FINALE DELLA COMPOSIZIONE RICHIESTA DI PROTEINE REGOLATRICI IL MESSAGGIO REGOLATORE E COMPLETO E SI PUO ASSISTERE AD UN IMPORTANTE RIMANEGGIAMENTO DELL ESPRESSIONE GENICA (DIFFERENZIAMENTO CELLULARE).

71 UN SINGOLO GENE PUO SCATENARE UNA SERIE DI RISPOSTE A CASCATA CHE DETERMINANO LA FORMAZIONE DI UN INTERO ORGANO.

72 CONTROLLO DELL ESPRESSIONE A LIVELLO POST-TRASCRIZIONALETRASCRIZIONALE SPLICING ALTERNATIVO IL GENE DSCAM DI D. melanogaster (CHE CODIFICA PER UN RECETTORE CHE GUIDA GLI ASSONI DURANTE LO SVILUPPO DEL SISTEMA NERVOSO) PUO PRODURRE TRAMITE SPLICING ALTERNATIVO FINO A DIVERSE PROTEINE. QUESTA VARIABILITA CONTRIBUIREBBE ALLA FORMAZIONE DI CIRCUITI NERVOSI COMPLESSI.

73 LO SPLICING PUO ESSERE CONTROLLATO POSITIVAMENTE O NEGATIVAMENTE

74 SPLICING ALTERNATIVO E SESSO DELLA DROSOPHILA UN RAPPORTO Chr X/ AUTOSOMI DI 0,5 PORTA ALLO SVILUPPO MASCHILE. UN RAPPORTO Chr X/ AUTOSOMI DI 1 PORTA ALLO SVILUPPO FEMMINILE.

75 LA REGOLAZIONE DEL SITO DI TAGLIO DELL mrna E DI AGGIUNAT DI POLY-A DETERMINA SE UNA MOLECOLA ANTICORPALE DEVE RIMANERE ANCORATA ALLA MEMBRANA DEL LINFOCITA B O ESSERE SECRETA

76 EDITING DELL RNA MECCANISMO ATTRAVERSO CUI VENGONO ALTERATE LE SEQUENZE DEGLI RNA TRASCRITTI. E STATO SCOPERTO IN TRASCRITTI CODIFICANTI PER PROT. MITOCONDRIALI E NEI TRIPANOSOMI. NEI MAMMIFERI UN TIPO DI EDITING E ESEGUITO DA ENZIMI PROTEICI ADAR (ADENOSINA DEAMINASI CHE AGISCONO SU RNA) CHE TRASFORMANO ADENINA IN INOSINA MECCANISMO GENERALE

77 UN CASO DI EDITING NELL UOMO: APOLIPOPROTEINA B OLTRE CHE NELLA SINTESI DI DIVERSE APOLIPOPROTEINE (FEGATO ED INTESTINO), L EDITING NELL UOMO E COINVOLTO NELLA DIVERSITA DEGLI Ab PRODOTTI

78 REGOLAZIONE TRASPORTO ATTRAVERSO IL NUCLEO

79 LOCALIZZAZIONE DIFFERENZIALE DEGLI mrna

80 CONTROLLO DELL ESPRESSIONE A LIVELLO TRADUZIONALE FOSFORILAZIONE DEL FATTORE DI INIZIO DELLA TRADUZIONE eif-2 iii) LE CELLULE EUCARIOTICHE DIMINUISCONO LA VELOCITA GLOBALE DI SINTESI PROTEICA A SEGUITO DI UNA VARIETA DI SITUAZIONI ESTERNE QUALI: i) MANCANZA DI NUTRIENTI; ii) INFEZIONI VIRALI; CAMBIAMENTI IMPROVVISI DI TEMP BUONA PARTE DELLA DIMINUZIONE DI SINTESI PROTEICA E DOVUTA ALLA FOSFORILAZIONE DI eif2 CHE NORMALMENTE LEGANDO IL GTP HA IL COMPITO DI MEDIARE L ATTACCO DEL trna CARICO A LIVELLO DELLA SUBUNITA MINORE DEL RIBOSOMA. UNA VOLTA CHE IL trna SI LEGA ALLA SUBUNITA MINORE, GDP SI STACCA DA eif2, GRAZIE ALL AZIONE DI eif2b. SE PERò eif2 E FOSFORILATO, ESSO SEQUESTRA eif2b E DI CONSEGUENZA eif2 NON PUO SLEGARE GDP FASE DI QUIESCENZA CELLULARE (G0) E DIMUNUZIONE SINTESI PROTEICA.

81 INIZIO DELLA TRADUZIONE DA CODONI AUG ALTERNATIVI E uorf I NUCLEOTIDI CHE CIRCONDANO L AUG INFLUENZANO L INIZIO DELLA TRADUZIONE: SE LA SEQUENZA SI DISCOSTA DI PARECCHIO DA QUELLA CLASSICA DI RICONOSCIMENTO (SEQ. DI KOZAK NEL CASO DEGLI EUCARIOTI), LA SUBUNITA MINORE DEL RIBOSOMA SALTERA IL PRIMO CODONE AUG PER INIZIARE LA SINTESI A PARTIRE DALL AUG IMMEDIATAMENTE SUCCESSIVO ( SCANSIONE CHE PERDE ). SI VENGONO COSI A GENERARE VARIE ISOFORME PROTEICHE CHE DIFFERISCONO L UNA DALL ALTRA PER LE LORO SEQUENZE N-TERMINALI. UN ALTRO TIPO DI CONTROLLO PRESENTE NEGLI EUCARIOTI PREVEDE LA PRESENZA DI UNO O PIU QUADRI DI LETTURA APERTI TRA L ESTREMITA 5 DELL mrna E L INIZIO DEL GENE. I PEPTIDISINTETIZZATI A PARTIRE DA QUESTI QUADRI DI LETTURA A MONTE DEL GENE NON SONO CRITICI MA POSSONO INFLUENZARE NEGATIVAMENTE L ESPRESSIONE DEL GENE A VALLE INTRAPPOLANDO IL COMPLESSO DI INIZIO DELLA TRADUZIONE E CONSEGUENTE RALLENTAMENTO DELLA TRADUZIONE DELLA ORF A VALLE.

82 SITI INTERNI DI INGRESSO DEI RIBOSOMI (IRES) GLI IRES SONO SEQUENZE DELL RNA LUNGHE DI SOLITO ALCUNE CENTINAIA DI NUCLEOTIDI. QUESTE SEQ. SI RIPIEGANO IN STRUTTURE SECONDARIE SPECIFICHE CHE VENGONO RICONOSCIUTE E LEGATE DA DIVERSI FATTORI eifs. MECCANISMI DI INIZIO TRADUZIONE IRES-MEDIATI SI RITROVANO IN DIVERSI SISTEMI VIRALI E IN ALCUNI mrna CELLULARI (ES.: mrna CHE CODIFICANO PER PROTEINE COINVOLTE NELL APOPTOSI)

83 mrna decay VITA MEDIA mrna PROCARIOTICO (CA. 3 MIN.). VITA MEDIA mrna EUCARIOTICO (VARIA DA MENO DI 30 MIN. A PIU DI 10H. TIPICAMENTE FATTORI DI TRASCRIZIONE HANNO EMIVITE PIU BREVI). LA LUNGHEZZA DELLA CODA DI POLY-A NEGLI EUCARIOTI SVOLGE UN RUOLO CRITICO IN QUESTO TIPO DI CONTROLLO.

84 CONTROLLO DELL ESPRESSIONE A LIVELLO POST-TRADUZIONALETRADUZIONALE LO SPLICING DELLE PROTEINE : IL CASO DELLE INTEINE LA MAGGIORPARTE DELLE INTEINE HA UNA LUNGHEZZA DI 150 aa. E LE GIUNZIONI DI SPLICING HANNO SEQUENZE SIMILI IN TUTTI GLI ESEMPI NOTI. ATTUALMENTE SONO STATE IDENTIFICATE CIRCA UN CENTINAIO DI INTEINE SOPRATTUTTO IN BATTERI ED IN EUCARIOTI INFERIORI.

85 REGOLAZIONE A LIVELLO POST-TRASCRIZIONALE TRASCRIZIONALE I MICRORNA I MICRORNA INTERAGISCONO CON I LORO mrna BERSAGLIO MEDIANTE PARZIALE O TOTALE COMPLEMENTARIETA CON IL 3 UTR DI QUESTI ULTIMI. TALE INTERAZIONE PUO PORTARE AL BLOCCO PARZIALE DELLA TRADUZIONE OD ALLA TOTALE DEGRADAZIONE DELL mrna!

86 RNAi PATHWAY: THE COMMON WAY OF mirnas AND sirnas NOBEL PRIZE

87 Canonical Binding Between micrornas and 3 UTR of the Gene Target

88 MECHANISMS OF microrna ACTION 2 POSSIBLE MECHANISMS: 1) TRANSLATIONAL REPRESSION; 2) mrna CLEAVAGE

89 FAVOURITE mirna TARGETS Ligands Cell-surface receptors Intracellular central signaling proteins Nuclear proteins Fraction of mirna target 9.1% (3/33) 31.2% (122/391) 18.8% (15/80) 50.0% (19/38) mirnas predominantly target positive regulatory motifs, highly connected scaffolds and most downstream network components such as signaling transcription factors, but less frequently target negative regulatory motifs, common components of basic cellular machines and most upstream network components such as ligands. Cui Q. er al, 2006 modified

90 micrornas and pathology

91 Human microrna genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers Calin G A et al., PNAS March 2, 2004 vol. 101 no

92 Human microrna genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers Calin G A et al., PNAS March 2, 2004 vol. 101 no

93 micrornas CAN FUNCTION AS TS AND OG

94 micrornas as potential therapeuitics

95 Possible microrna therapy Stoffel studies micrornas in diabetes and metabolism and realized that he needed a delivery system to get RNA sequences into cells where they could silence micrornas.to accomplish this, Stoffel collaborated with Muthiah Manoharan of Alnylam Pharmaceuticals, an RNAi company in Cambridge, Massachusetts, to create antagomirs. Stoffel s antagomirs are RNA snippets linked to cholesterol molecules, which help slip the silencers into cells. After being injected into the tail veins of mice, antagomirs travel through the body; they have successfully modified microrna expression in many organs. Antagomirs can t cross the blood-brain barrier, but scientists have injected them directly into the brain, where they penetrated brain cells. By the third day after an antagomir injection, Stoffel says, the micrornas targeted disappear and stay silent for weeks.

96 The cardiology field has an advantage over others: Its doctors have experience supplying drugs straight into the target organ,for example, by injection into the coronary arteries. It should be doable, some predict, to shoot extra micrornas, or microrna suppressors, directly into the heart. I think we might see the first trials [of a microrna-based therapy] in the cardiology field, says Markus Stoffel, a molecular biologist at the Swiss Federal Institute of Technology in Zürich. Science, 28 March 2008, Vol. 319 MicroRNAs Make Big Impression In Disease After Disease

97 Tracks from an ancient RNA world: circrnas as microrna sponges