Plasmidi come vettori di clonaggio

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1 Plasmidi come vettori di clonaggio Un vettore plasmidico di buona qualità deve possedere le seguenti proprietà: 1. Piccole dimensioni (<10kb) 2. Possedere uno o più marcatori genetici, la cui presenza o assenza permette di selezionare le cellule che ospitano il plasmide (resistenze ad antibiotici o marcatori nutrizionali). 3. Contenere singoli siti di taglio per il più alto numero possibile di enzimi di restrizione. Questi siti devono stare al di fuori delle regioni essenziali (replicone e marcatore). Plasmidi ad alto numero di copie (rilassati) Sono i più utilizzati per la clonazione del DNA. Plasmidi a basso numero di copie (stringenti) Sono richiesti in applicazioni speciali : 1. Propagazione di sequenze di DNA instabili o di geni che sono letali per E. coli se presenti in molte copie 2. Costruzione di cromosomi batterici artificiali (BAC), che possono trasportare grandi segmenti (~100 kb) di DNA. 1

2 Il primo vettore artificiale di grande successo fu pbr322, creato nel 1977 da Bolivar e Rodriguez (Università di Città del Messico). E una molecola circolare di 4361 bp Contiene geni per la resistenza a tetraciclina e ampicillina Contiene siti unici di restrizione Contiene una origine della replicazione Derivato da RSF2124 Derivato da psc101 Derivato da pmb1/cole1 pbr322 2

3 TRASFORMAZIONE E. coli - ceppi RecA - (incapaci di fare ricombinazione) - ceppi mancanti degli enzimi di restrizione 1) CaCl 2 + shock termico cfu/µg DNA (dipende da dimensioni del DNA da introdurre) 2) Vettori fagici 3) Elettroporazione 10 9 cfu/µg DNA (più efficiente con DNA di grandi dimensioni - >100 kb -) altri organismi Competenza innata (dipendente dalle condizioni di crescita) es: Bacillus spp. (Gram+) Formazione di protoplasti Liposomi Elettroporazione Biolistica (Gene gun) Vettori virali SELEZIONE I. Resistenza agli antibiotici II. Screening delle singole colonie per controllare la presenza del costrutto specifico (tramite PCR, analisi di restrizione, test di espressione, ecc) 3

4 Serie dei plasmidi puc Contengono un sito di policlonaggio (polylinker), introdotto con la tecnica della clonazione di oligonucleotidi sintetici Il sito di policlonaggio è diverso in ogni plasmide della serie Il sito di policlonaggio è inserito nel gene lacz. Importante per la selezione delle colonie contenenti l inserto Sono disponibili primer universali per il sequenziamento degli inserti, disegnati sulle regioni che fiancheggiano il sito di policlonaggio da ambo i lati (2686 bp) puc18 puc19 4

5 Saggio di α-complementazione Gene laci Proteina repressore IPTG Gene lacz peptide α della β-galattosidasi + Peptide complementare della β-galattosidasi codificato dalla cellula ospite β-galattosidasi intera = 1021 aa (3.1 kb) Il plasmide contiene solo i primi 146 codoni del gene lacz (peptide α) X-Gal Ceppo mutante M15 di E. coli contenente la delezione dei residui del gene lacz colonie blu Saggio di α-complementazione Se si fornisce un substrato cromogeno (X-gal), l idrolisi del substrato da parte dell enzima β-galattosidasi dà luogo a molecole che si colorano di blu dopo esposizione all aria: Se avviene α-complementazione le cellule si colorano di blu (plasmidi non ricombinanti). Se non avviene α-complementazione le cellule restano bianche (plasmidi ricombinanti: l inserzione di DNA ha reso il peptide α non funzionale). Bisognatuttavianotareche: Il saggio può dare un certo numero di falsi negativi, cioè colonie blu che in realtà sono ricombinanti. Questo si verifica spesso con inserti piccoli di DNA (<100 bp) Il saggio può dare falsi positivi, cioè colonie bianche che in realtà non sono ricombinanti. Questo si può verificare se il ceppo accumula mutazioni nei geni lacz, oppure quando si tratta il vettore con un eccesso di fosfatasi alcalina. 5

6 Batteriofago λ 1. dsdna lineare lungo 48.5 kb 2. Estremità ss coesive (cos) che permettono la circolarizzazione all interno dell ospite ciclo litico ciclo lisogeno 6

7 Lisi dell ospite Regolazione delle funzioni tardive Sintesi del DNA Regolazione e immunità Integrazione e ricombinazione Regione b2 (escissione) cos testa coda cos Può essere sostituita senza danneggiare il ciclo litico del virus Quantità di DNA del fago per un efficace impaccamento: 75% 105% < 38 kb > 52 kb fagi non infettivi ~50 kb Vettori di inserzione : sito di restrizione unico in cui inserire il DNA Vettori di sostituzione: 2 siti delimitano una regione di riempimento clonaggio di inserti grandi (15-20 kb) 7

8 Clonazione di un frammento di DNA di grandi dimensioni in un batteriofago λ Fenotipo Spi+ Sensibile alla inibizione da P2 (non è in grado di infettare batteri lisogeni per il fago P2 possiede i geni red e gam) Fenotipo Spi _ Stratagene DNA da clonare STUFFER 8

9 Efficienza di trasformazione del DNA di λ con un inserto clonato: placche /µg di DNA => Impaccamento in vitro (anche con DNA monomerici) 10 6 placche /µg di DNA Proteina E (principale componente del capside) non espressa Non si ha produzione dei precursori delle teste Proteina D non espressa Non si ha impaccamento del DNA nelle teste +ATP +DNA Lisi e miscelazione degli estratti Assenza di DNA profagico delezione b2- Fago filamentoso M13 ssdna circolare Pilo F di E. coli F+ 9

10 Non ci sono limitazioni della lunghezza del DNA dovute all impaccamento La forma replicativa ds si può manipolare come un plasmide Il DNA fagico ss si può usare come stampo per: Sequenziamento mutagenesi tramite oligonucleotidi preparazione di sonde M13 come vettore di clonazione (α-complementazione) 10

11 M13 mp18 Cosmidi Riuniscono le caratteristiche di plasmidi e vettori basati sul fago λ ~6 kb Blunt ends / defosforilazione ~50 kb 11

12 Impaccamento in vitro Selezione tramite resistenza all antibiotico Stratagene 12

13 Vettori basati sul fago P1 (PAC) NB: genoma fago P1= 115 kb Replicone plasmidico:low copy Replicone P1: high copy Kanamicina-resistenti Cromosomi artificiali batterici (BAC) Derivati da: Plasmide F di E. coli Sito cosn (da fago λ) sitoloxp (da fago P1) siti di clonaggio (BamHI, HindIII) 1-2 copie per cellula Possono essere introdotti nelle cellule tramite trasformazione Vettore di clonazione estremamente stabile (adatto per costruzione di genoteche) 13

14 Cromosomi artificiali di lievito (YAC) Vettori replicativi di lievito + telomeri vettore in grado di propagarsi come molecola lineare Stabilità proporzionale alla grandezza dell inserto Ma puo contenere inserti chimerici Dimensioni massime degli inserti nei diversi vettori di clonaggio VETTORI PLASMIDICI fino a 10 kb VETTORI BASATI SUL FAGO λ kb VETTORI COSMIDICI kb VETTORI PAC (basati sul fago P1) kb VETTORI BAC (cromosomi artificiali batterici) fino a 300 kb VETTORI YAC (cromosomi artificiali di lievito) Mb 14

15 Creazione e screening di una genoteca Creazione e screening di una genoteca clonaggio 1.Tramite sonda 2.Tramite PCR 3.Immunologico 4.Attività della proteina (complementazione genica) screening 15

16 Sintesi del cdna Sintesi del cdna * * Degradazione RNA Apertura delle anse Degradazione ssdna *Azione difficilmente controllabile 16

17 Sintesi del cdna CCCC 5 GGGG 3 CCCC mrna cdna Terminal transferasi + dctp AAAA 3 TTTT 5 mrna AAAA CCCC 3 TTTT 5 cdna Idrolisi dell RNA Recupero del cdna Sintesi del 2 filamento tramite oligo-dg 3 cdna ds TTTT 5 Clonaggio tramite linker 17