Le innovazioni di ESPLORA nel settore orto-floricolo

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1 Le innovazioni di ESPLORA nel settore orto-floricolo Giuseppe L. Rotino (CRA-ORL, Montanaso L.)

2 specie studiate Anemone Pisello da industria Fagiolo Pomodoro Melanzana

3 Anemone Costruzione di una mappa genetica in Anemone coronaria mediante marcatori SSR e SNP CRA FSO, Unità di Ricerca per la Floricoltura e le Specie Ornamentali (Sanremo) Responsabile: Andrea Allavena Marina Laura, Cristina Borghi, Valentina Bobbio

4 Anemone: Obiettivi Mappaggio molecolare di caratteri di rilevanza economica -Costruzione di una mappa genetica marcatori SSR e SNP popolazione segregante Sequenziamento del trascrittoma dei due parentali di mappa opportunamente scelti; Individuazione di SNP e SSR; Genotipizzazione della progenie F2.

5 Anemone: Risultati raggiunti Roma Dal sequenziamento Illumina Sono stati trovati SSR, di cui utili per il mapping Una quota di SSR è stata validata utilizzando 132 coppie di primers. 9 coppie di primers hanno prodotto polimorfismi 40 risultati dubbi ed 83 bande non informative Per 28 SSR è stata valutata una seconda coppia di primers.

6 Anemone: Risultati raggiunti Roma Gel virtuale di polimorfismi di 4 SSR evidenziati con Qiaxcel (LL e TB indicano le due varietà; le sigle i diversi SSR) 93bi LL 93bi TB 80bi LL 80bi TB 92bi LL 92bi TB 54LL 54 TB

7 Anemone: Impatto dell attività di ricerca Roma La disponibilità dei primi marcatori derivati dal trascrittoma faciliterà l identificazione dei geni responsabili di caratteri utili. Possibili ricadute sul miglioramento della specie utilizzando la MAS Contributo alle conoscenze genomiche in Anemone coronaria.

8 Pisello proteico Selezione di linee elite e phenotyping per definire tecniche di selezione assistita per ambienti climaticamente contrastanti CRA FLC, Centro di ricerca per le Produzioni Foraggere e Lattiero- Casearie (Lodi) Responsabile: P. Annicchiarico Partecipanti: B. Ferrari, M. Romani, L. Pecetti Collaborazioni internazionali: INRA Dijon (Francia), Noble Foundation (USA)

9 Pisello proteico: Obiettivi Identificare: marcatori molecolari utili per il breeding per ambienti padani e potenziali varietà mediante costruzione, fenotipizzazione e genotipizzazione di 3 set di recombinant inbred lines (RIL) identificare marcatori molecolari associati alla resistenza allo stress idrico mediante bulk segregant analysis

10 Pisello proteico: costruzione ed analisi delle RIL Roma Prodotte ~270 RIL, ~90 per ognuna di 3 popolazioni RIL interconnesse (da 3 parentali elite) Linee F 6 genotipizzate con 384 marcatori SNP (polimorfici: ), fenotipizzazione dele progenie per resa e tenore proteico della granella e altri caratteri in un ambiente padano Valutazione bio-agronomica di 270 linee a Lodi

11 Pisello proteico:genotipizzazazione ed analisi QTL Identificati QTL per resa e % proteica della granella, etc; costruita una mappa consenso (ma SNP in numero limitato) es. Kaspa Attika Un applicazione preliminare della tecnica innovativa del genotypeby-sequencing (GBS) sui 3 parentali ha fornito oltre 3000 SNP polimorfici per incrocio (a costi molto ridotti)

12 Pisello proteico: linee tolleranti a siccità da bulk segregant analysis Roma Selezionate 30 linee per ognuna delle 3 popolazioni biparentali interconnesse, dopo 3 cicli di selezione massale stratificata con stress crescente (acqua Set-Apr.: mm) sulle generazioni F 2, F 3 e F 4 Selezione stratificata in condizioni di stress idrico controllato file di piante di bordo eliminate

13 Pisello proteico: Impatto e sviluppi Associazioni tra marcatori e importanti caratteri agronomici (resa, % proteica, etc.) da confermare in nuovi ambienti Sviluppo di nuovi genotipi (~360, tra cui potenziali varietà) Nuova tecnica di genotipizzazione (genotype-by-sequencing) Completamento e sviluppo in nuovi progetti delle seguenti attività: Arimnet REFORMA: genotipizzazione genotype-by-sequencing; identificazione di linee, marcatori utili (bulk segregant analysis) e markerassisted selection per la tolleranza a forte stress idrico CoreOrganic COBRA, e PNSB: identificazione di linee e marker-assisted selection per resa e % proteica in Nord e Centro Italia

14 Fagiolo Mapping della resistenza ai nematodi galligeni in fagiolo CRA-CIN, Centro di Ricerca per le Colture Industriali, Bologna Resp. Andrea Carboni Carla Busatto Bruno Parisi Coll. UNIVPM Ancona Laura Nanni Eleonora Biagetti

15 Fagiolo: scopo del lavoro / attività Ricerca di materiali resistenti / fenotipizzazione nell ambito della collezione di Phaseolus disponibile a CRA-CIN e UNIVPM (> 1000 accessioni). Sviluppo di materiali / genetica e breeding sviluppo di progenie segreganti e RILs da incroci Resistenti x Sensibile in varie tipologie Validazione del marcatore molecolare SCAR associato alla resistenza a Meloidogyne incognita razza 1 utilizzando la collezione di germoplasma disponibile Costruzione di una mappa di linkage utilizzando marcatori SSR e SCAR Struttura popolazione ed analisi biogeografica (origine resistenza) utilizzando una core-collection, marcatori SNPs

16 Fagiolo: Risultati Genotipizzazione e fenotipizzazione collezione Analizzati 1094 genotipi con marcatore SCAR (associato a resistenza a M. incognita razza 1): 27 accessioni selvatiche e 4 domesticate presentano il frammento associato alla resistenza (27 sequenze identiche, 4 con una delezione di 15 bp). La fenotipizzazione ha identificato 3 accessioni domesticate resistenti: 2 nuove linee italiane (Pali 1 e Pali 2) e una varietà resistente (Kabanima). Mappa di linkage 3 progenie F4 di 200 individui 314 marcatori SSR sono stati testati sui parentali di origine: 89 SSR polimorfici 38 marcatori SCAR associati alle principali fitopatie in fagiolo sono stati testati. 14 SCAR mappati. Identificate due regioni ricombinanti nei cromosomi 3 e 11 utili per futuro mappaggio fine.

17 Fagiolo: Risultati Struttura genetica ed analisi biogeografica Una collezione di 190 accessioni è stata analizzata con 296 SNPs. E in corso la revisione finale dell analisi di associazione. 27 selvatici su 662 risultano positivi al marcatore SCAR ma solo 1 è risultato resistente a Meloidogyne incognita razza 1. Questo dato ha permesso di identificare come proveniente dal Guatemala l origine della resistenza. Breeding MAS per sviluppare materiali con resistenza multipla dei materiali migliori ora in F4 e F5 (piramidyng mai descritto prima) da oltre 4000 incroci resistenti x varietà commerciali

18 Fagiolo: impatto dell attività di ricerca Roma Nuove fonti di resistenza (sia rampicanti che di tipo snap). 2. Sviluppo di materiali innovativi: breeding lines avanzate (F4 e F5) multiresistenti a M. incognita e M. javanica. 3. Validazione marcatore SCAR associato alla resistenza a M. incognita razza Mapping: individuazione di due regioni sui cromosomi 3 e 11, oggetto di futura ricerca. 5. Incontri con azienda straniera per futura collaborazione.

19 Pomodoro Sviluppo di marcatori molecolari per approcci di association mapping in pomodoro finalizzati allo studio del contenuto di acido ascorbico e fenilpropanoidi nel frutto Dipartimento di Agraria Università degli Studi di Napoli Federico II A. Barone V. Ruggieri A. Sacco M.M. Rigano Caratterizzazione di una popolazione di pomodoro per approcci di "association mapping" finalizzati allo studio del contenuto di carotenoidi ed altri metaboliti secondari nel frutto CRA-ORT, Cemtro di Ricerca per l Orticoltura Pontecagnano G. Mennella G. Francese A. D Alessandro M. Parisi M. Milone T. Cardi

20 Pomodoro: obiettivi Caratterizzare una popolazione di ecotipi/varietà di pomodoro per caratteristiche qualitative e nutrizionali della bacca Cercare alleli favorevoli per il miglioramento genetico di tali caratteristiche

21 Pomodoro: Materiali e Metodi Collezione di 80 genotipi di pomodoro, che include ecotipi italiani, landraces sudamericane, e alcune cultivar. La maggior parte dei genotipi sono da consumo fresco e da serbo, alcuni anche da industria. Tutti i genotipi sono stati caratterizzati a livello fenotipico (analisi biochimiche) in una prova di campo per due anni consecutivi La genotipizzazione è stata effettuata con marcatori molecolari di tipo SNP utilizzando una piattaforma Illumina disponibile per il pomodoro, che consente di analizzare contemporaneamente oltre 7000 SNP.

22 Pomodoro: Analisi fenotipiche Carattere Media± SD Min Max Ereditabilità Acido ascorbico(mg/100gfw) ± Trans-licopene (mg/100gfw) ± cis licopene (mg/100gfw) 0.14 ± cis licopene (mg/100gfw) 1.69 ± cis licopene (mg/100gfw) 1.57 ± β-carotene (mg/100gfw) 2.26 ± Solidi solubili(brix ) 6.60 ± ph 4.35 ± Acidità (ac.citrico /100ml succo) 0.47 ± Peso secco(g/100g) 8.55 ± Peso fresco FW(g) ±

23 Pomodoro: Analisi Genotipica Su140 marcatori risultati associati ai caratteri, 5 sono altamente associati a trans-licopene, b- carotene ed acidità titolabile Per i geni associati sono stati identificati gli alleli favorevoli che potranno essere trasferiti in varietà coltivate mediante programmi di selezione assistita SolCAP Tomato SNP assay (7720 SNPs) ANALISI DI ASSOCIAZIONE Trait Carattere GLM MLM GLM+k3 MLM+k3 Acido Ascorbic ascorbico acid Trans-lycopene Trans-licopene cis licopene lycopene cis licopene lycopene cis licopene lycopene b-carotene β-carotene Solidi Soluble solubili solids ph Acidità Tritatable titolabile acidity Peso Dry weight secco Peso fresco Fruit weight

24 Pomodoro: SNPs mapping Tutti i marcatori associati sono stati mappati sui 12 cromosomi del pomodoro dove sono stati identificati anche i potenziali geni candidati utili per il trasferimento mirato mediante schemi di breeding di precisione [MB] 0 CHR Tritatable acidity_ta1_1 BHLH transcriptor factor Tritatable acidity_ta1_2 [MB] 0 CHR2 Unknown General vescicular transporter factor p115 Novel protein containing PHD-finger domain Unknown PBSP plant based secretory protein solcap_snp_sl_54697 Methylthioribose kinase solcap_snp_sl_17161 Zing finger protein Unknown Unknown 70 UDP_glucosyltransferase 1 40 GATA transcription factor 9 80 Unknown 50 90

25 Melanzana Mappaggio di QTL di interesse agronomico e sviluppo di una collezione di germoplasma in melanzana CRA-ORL, Unità di Ricerca per l Orticoltura, Montanaso L. Giuseppe L. Rotino Laura Toppino Tea Sala Fabio Cericola M. Grazia Tacconi Giuseppe Mennella (CRA-ORT) Antonietta D Alessandro Gianluca Francese DiSAFA, UniTO Sergio Lanteri Ezio Portis Lorenzo Barchi Fabio Cericola Alberto Aquadro Nazzareno Acciarri (CRA-ORA) Tommaso Ciriaci Roberto Lo Scalzo (CRA-IAA) Laura Pulcini Giampiero Valè (CRA-GPG)

26 Melanzana: Obiettivi Costruzione di una mappa molecolare Analisi QTL identificazione di associazione fra marcatori molecolari e caratteri agronomici (fenotipizzazione della progenie F2 in due ambienti) Ampliamento e caratterizzazione molecolare e fenotipica della collezione varietale Association mapping analysis e confronto con family based QTL mapping (validazione QTL)

27 Melanzana: costruzione mappa Sviluppo di una mappa in melanzana (S. melongena) 305 E40 X 67-3 X 305 E40 (IL da S. aethiopicum) Origine: [Sa+Dourga] Parentale ricorrente: Talina Precocità: + precoce Resistenza: + Rfo-Sa1; +++ Verticillium Colore Frutto: viola nero Forma frutto: allungata Colore fusto: verde Habitus: eretto Note: stabilizzata per coltura di antere HF Origine: Purpura x Cin Parentale ricorrente: - Precocità: - precoce Resistenza: - Rfo-Sa1; + Verticillium Colore Frutto: lilla scuro Forma frutto: tonda Colore fusto: antocianico Habitus: prostrato Note: breeding line stabilizzata per 8 selfing 156 individui F2

28 Melanzana: costruzione mappa Principali caratteristiche della mappa molecolare (Barchi et al, 2012 PloS ONE) Chromosome Length (in cm) Number of markers Average density (cm) Gaps (>10 cm) Gaps (>15 cm) RAD tag SNP HRM SSR CAPs RFLP COSII E E E E E E E E E E E E Average Total Ultima versione della mappa: 419 marcatori molecolari (339 SNP, 3 HRM, 27 COS, 3 CAPS, 36 SSR e 11 RFLP) Lunghezza totale della mappa =1401,5 cm, lunghezza media cromosomi =116,8 cm (range : 80, cm), numero di marcatori per cromosoma da 22 (E11) a 67 (E2); media: 34,8 distanza media tra i marcatori: 3,3 cm (range 1,9-5,3 cm).

29 Melanzana: analisi QTLs circa 40 caratteri morfologici, agronomici, biologici e biochimici in 2 località: sono stati trovati major QTLs per quasi tutti i caratteri, distribuiti in tutti i cromosomi tranne Ch 9 Ch1 Ch2 Ch3 Ch4 Ch5 Ch6 Ch7 Ch8 Ch9 Ch10 Ch11 Ch12

30 Melanzana: Association Mapping Costituzione della collezione di germoplasma (~250 accesioni) pre-screening e identificazione di una core population (191 accessioni) Fenotipizzazione e genotipizzazione (SNPs, SSR) core population Analisi struttura della popolazione Valutazione del decadimento del LD Analisi QTL (associazione caratteri-marcatori)

31 Melanzana: Association Mapping L approccio di Association mapping utilizzando una collezione di 191 accessioni ha permesso di: stimare il Linkage Disequilibrium (circa3,4 cm); confrontare i QTLs con quelli da bi-parental mapping (46% confermati); scoprire nuovi QTL (54%). AM_195 AM_196 AM_213 AM_222 AM_057 AM_021 AM_063 AM_062 AM_288 AM_064 AM_026 AM_134 AM_139 AM_127 AM_141 AM_144 AM_151 AM_153 AM_233 AM_236 AM_253 AM_059 AM_028 AM_029 AM_031 AM_230 AM_030 AM_025 AM_249 AM_137 AM_138 AM_175 AM_265 AM_284 AM_069 AM_070 AM_072 AM_073 AM_170 AM_160 AM_224 AM_056 AM_060 AM_124 AM_212 AM_216 AM_238 AM_231 AM_015 AM_264 AM_228 AM_074 AM_218 AM_058 AM_241 AM_126 AM_221 AM_024 AM_038 AM_135 AM_142 AM_143 AM_067 AM_193 AM_129 AM_146 AM_147 AM_157 AM_128 AM_251 AM_243 AM_156 AM_158 AM_271 AM_273 AM_274 AM_200 AM_013 AM_234 AM_194 AM_203 AM_240 AM_055 AM_076 AM_103 AM_204 AM_010 AM_071 AM_163 AM_173 AM_174 AM_148 AM_199 AM_205 AM_201 AM_114 AM_086 AM_034 AM_169 AM_293 AM_121 AM_140 AM_149 AM_252 AM_018 AM_208 AM_053 AM_215 AM_098 AM_099 AM_100 AM_102 AM_159 AM_206 AM_279 AM_207 AM_275 AM_290 AM_289 AM_278 AM_202 AM_036 AM_168 AM_285 AM_155 AM_014 AM_152 AM_266 AM_136 AM_150 AM_016 AM_162 AM_171 AM_037 AM_052 AM_046 AM_235 AM_176 AM_011 AM_051 AM_054 AM_106 AM_269 AM_268 AM_001 AM_198 AM_167 AM_ Similarity

32 Melanzana: Impatto dell attività di ricerca oltre 110 QTL sono stati finora identificati e mappati su 11 cromosomi utilizzabili per la MAS. QTL con maggiore effetto: Produzione precoce e totale di frutti sui cr. 2 e 11 Resistenza a Fusarium sul cr. 2 Dimensione del frutto sul cr. 2 Lunghezza e forma del frutto sul cr. 3 e 11 Presenza dell anello verde sotto l epidermide del frutto sul cr. 8 Colore del frutto sul cr. 5 Spinosità del calice del frutto sul cr. 7 Lunghezza del peduncolo del frutto sul cr. 4 N sacche seminali del frutto e n fiori/infiorescenza sul cr. 12 Consistenza del frutto sul cr. 5 Resistenza a Verticillium Glicoalcaloidi Antocianine (Nasunina e D3R) Roma L imminente disponibilità del genoma di riferimento di S. melongena (parentale 67-3) renderà ancora più efficiente e precisa l attività di breeding basata su strumenti molecolari (es. CNV, geni privati).