Plant Genetic variability

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1 Plant Genetic variability Somatic hybridization Mutagenesis Somaclonal variability Haploids Genetic modified plants

2 Plant Genetic variability Haploid

3 Haploid refers to those plants which posses a gametophytic number of chromosome (single set) in their sporophytes Introduction Scoperti per la prima volta in Datura stramonium (Blakeslee, 1922). Gli aploidi possono originarsi spontaneamente in natura, ma possono anche essere prodotti artificialmente. Riportati in numerose specie: mais, sorgo, riso, orzo, patata,frumento, segale, erba medica, tabacco, cotone...

4 Perchè produrre Aploidi L aploidia delle piante presenta numerosi vantaggi per il miglioratore: o o o Partner di fusione Facile identificazione di mutazioni (tutti i loci sono emizigoti) Produzione di linee omozigoti La poliploidizzazione di linee aploidi generalmente è effettuata attraverso trattamenti con colchicina. Di fatto, con tale tecnica sono state selezionate linee isogeniche dotate di resistenza a insetti, funghi e virus. La disponibilita di queste linee ha rappresentato un passo importante anche verso la costituzione di ibridi con alto grado di eterozigosi.

5 Notevole potenziale applicativo nel miglioramento genetico degli aploidi Per le piante autogame questi genotipi costituicono varietà potenziali, poiché attraverso la loro moltiplicazione si possono ottenere linee puree Per le piante allogame essi rappresentano le piante da incrociare per la costituzione di varietà ibride. In frumento e in riso la coltura di antere è frequentemente usata per promuovere l androgenesi utilizzando piante ibride F 1 ottenute attraverso l incrocio tra due linee pure (H 1 ). In questo modo la valutazione delle linee omozigoti, ottenute per raddoppiamento cromosomico, può essere effettuata gia nella generazione successiva (H 2 ) anziché attendere fino alla generazione F 6 come di solito accade segeuendo gli schemi classici di miglioramento genetico.

6 Aploidi naturali In vivo vs in vitro Si formano mediante partenogenesi a carico di ovocellule non ancora fecondate, di sinergidi di sacchi embrionali ridotti oppure a partire dal nucleo vegetativo del polline. Aploidi da coltura in vitro Si possono ottenere in vivo trattando gli organi riproduttivi con agenti fisici o chimici Agenti fisici: o Radiazioni ionizzanti o shock termici Agenti Chimici Auxine

7 Piante aploidi da coltura in vitro Con le tecniche di coltura in vitro è possibile ottenere piantine aploidi a partire da cellule gametiche La possibilità di ottenere piante a partire da granuli pollinici fu dimostrata nel 1964 ad opera di S. Guha e S.C. Maheshwari Piante aploidi non sono ottenute solo mediante la coltura in vitro di antere o polline (androgenesi), ma anche di ovuli (ginogenesi) sia su terreno solido che in terreno liquido mantenuto in agitazione

8 Produzione di Aploidi La tecnica si basa sull impiego di un terreno di coltura capace di nutrire le spore aploidi: le microspore contenute all interno delle logge polliniche o le megaspore contenute all interno del sacco embrionale. La stimolazione della divisione mitotica delle cellule apolidi avviene con l uso di appropriati substrati nutritivi.

9 L androgenesi ha avuto in a passato ed ha tuttora una maggiore diffusione rispetto alla ginogenesi in quanto è molto più semplice collezionare antere che non ovuli. Androgenesi

10 Tappe fondamentali La fase gametofitica maschile inizia con la formazione di 4 microspore aploidi attraverso la meiosi Il nucleo di ogni microspora subisce in seguito una divisione mitotica dando origine a due nuclei: un piccolo nucleo generativo ed un nucleo vegetativo piu grande. Il nucleo generativo subisce un ulteriore divisione originando i due nuclei spermatici, i gameti maschili

11 Tappe fondamentali Mediante la coltura in vitro di antere o polline la divisione del nucleo generativo e/o di quello vegetativo puo essere stimolata, promuovendo uno sviluppo di tipo sporofitico che porta alla formazione di calli o di embrioni avventizi aploidi. Evoluzione di un embrione ottenuto dalla coltura di antere di un ibrido somatico

12 MODELLI NUCLEO MICROSPORA Divisione Nucleo vegetativo Nucleo generativo Divisione Nucleo vegetativo Divisione Nucleo Nucleo generativo vegetativo Nucleo vegetativo Ripetute Divisioni Ripetute Divisioni Ripetute Divisioni Ripetute Divisioni Ripetute Divisioni Divisione Nucleo vegetativo Nucleo generativo Ripetute Divisioni Poche divisioni sviluppo del tessuto aploide

13 Androgenesi diretta: dalla divisione delle cellule aploidi si ottengono strutture simili ad embrioni chiamate embriodi Tipi di androgenesi Androgenesi indiretta: dalla divisione delle cellule aploidi si ottengono calli indifferenziati Sia dai calli che dagli embriodi secondo diversi modelli di sviluppo si possono rigenerare per embriogenesi o per organogenesi plantule aploidi.

14 Differenze tassonomiche Nelle Graminaceae la rigenerazione delle piante aploidi passa generalmente attraverso la formazione del callo La tendenza da parte di una microspora di originare embriodi oppure calli posti in coltura in vitro è in qualche modo connessa a differenze tassonomiche. Nella maggior parte delle Solanaceae e delle Brassicaceae l androgenesi avviene per embriogenesi diretta.

15 Fattori che influenzano la risposta androgenetica Genotipo della pianta Condizioni di allevamento della pianta madre Substrati di coltura Pretrattamenti (freddo, calore, chimici Non si può fornire un unico protocollo sperimentale per tutte le specie vegetali è possibile descrivere le tappe fondamentali dell androgenesi mediante la coltura di antere e di polline

16 Genotipo della pianta In ogni specie genotipi diversi hanno attitudine differente a dare origine a piante aploidi vitali. In base ai risultati ottenuti in esperimenti di androgenesi su frumento, patata, segale, orzo si dimostro che tale attitudine è di natura genetica (carattere ereditabile). Per ciascuna specie e per ciascun genotipo opportune condizioni di coltura consentano di incrementare le attitudini androgenetiche.

17 Stadio di sviluppo dell antera Un fattore molto importante è lo stadio di sviluppo dell antera e quindi delle microspore al momento del prelievo e della messa in coltura. Il processo di differenziazione gametofitico può essere deviato verso solo quello sporofitico esclusivamente in corrispondenza di un preciso stadio di sviluppo del Tale stadio varia da specie a specie e solitamente compreso tra la fine dello stadio di tetrade e le primissime fasi dello stadio binucleato granulo pollinico.

18 Stadio ottimale dell antera L analisi al microscopio delle antere opportunamente schiacciate e trattate con carminio acetico permette determinare lo stadio di sviluppo delle microspore in vivo. La raccolta dei boccioli fiorali viene effettuata a diversa età in modo da porre in relazione un carattere fenotipico distintivo con lo stadio della microsporogenesi. Nella maggioranza delle specie saggiate lo stadio ottimale per il prelievo delle antere è risultato quello uninucleato, immediatamente prima o durante la divisione mitotica.

19 Pretrattamenti 3-5 C per 2 giorni (tabacco) 35 C per 24 ore (brassica) 4-10 C per 3-28 giorni (cereali)

20 A cultured tobacco anther showing globular stage and torpedo stage Tobacco A cultured tobacco anther after 6 wks

21 Antere o Microspore? M: non si forma callo da tessuti somatici M: si eliminano interazioni negative tra microspora e tessuti dell antera (svantaggio se l antera ha effetto stimolante) M: migliore controllo della risposta androgenetica PROBLEMI coltura di M più laboriosa successo solo in poche specie

22 Ginogenesi Riportata per la prima volta nell orzo Utile per ottenere aploidi da piante maschiosterili Successo solo in poche specie (es. barbabietola da zucchero) Tecnicamente la procedura è difficile e richiede grande esperienza

23 Risposta Ginogetica I FATTORI CHE INFLUENZANO LA RISPOSTA GINOGENETICA Genotipo della pianta Stadio di sviluppo dell ovulo (non ancora fecondato!) Condizioni di allevamento della pianta madre Substrato Fattori stagionali (x barbabietola estate) Pretrattamenti (freddo)

24 RADDOPPIAMENTO CROMOSOMICO Colchicina/orizalina Antere Gemme apicali Embrioni Nodi di pianta aploide capitozzata Immersione delle radici di piante capitozzate in soluzione contenente colchicina (cereali) Organogenesi da espianto dell aploide

25 Limitazioni Bassa frequenza di aploidi Raddoppiamento cromosomico poco efficiente (chimere) Aploidi e aploidi-raddoppiati devono essere geneticamente stabili Variabilità genetica (somaclonale) negli aploidi ottenuti in vitro Albinismo