Metodi di Miglioramento genetico. Stefano Pavan DiS.S.P.A

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1 Metodi di Miglioramento genetico Stefano Pavan DiS.S.P.A

2 Legge di Hardy-Weinberg Si assuma una popolazione diploide che si riproduca sessualmente attraverso generazioni discrete e in cui i genitori muoiano dopo la riproduzione Siano p la frequenza di A, e q la frequenza di a Le frequenze genotipiche derivano dallo sviluppo del quadrato del binomio (p+q) 2. Quindi rimangono costanti nelle generazioni successive

3 Relazione tra frequenze geniche e genotipiche all equilibrio

4 Significato della legge di Hardy-Weinberg I meccanismi di eredità mendeliana non comporta evoluzione (cambiamento nel tempo delle caratteristiche di una popolazione), che invece deriva dai processi di: Unione non casuale Mutazione Migrazione Deriva genetica Selezione

5 Unioni non casuali L inbreeding è un tipo di unione non casuale, dovuta ad una frequenza di unioni tra individui imparentati superiore a quella dovuta ad eventi casuali L inbreeding è legato al concetto di identità per discendenza (i.b.d.), ossia la probabilità due varianti genetiche (es. alleli) derivino (=coalescano) dalla stessa variante ancestrale

6 Unioni (non) casuali e probabilità di i.b.d. Probabilità di i.b.d. (popolazione ideale di Wright-Fisher composta da N individui diploidi ed ermafroditi, chiusa, di dimensione costante, in cui vi sia random mating e vi sia assenza di selezione sugli alleli) = (1/4N 2 )2N = 1/2N L inbreeding aumenta la probabiltà di i.b.d. rispetto al random mating (pensate se tutti gli individui in figura si autofecondassero, la probabilità di i.b.d nella generazione successiva sarebbe 1/2). Di conseguenza aumenta la probabilità di omozigosi

7 Unioni non casuali e coefficiente di inbreeding Il coefficiente di inbreeding F di una popolazione è definito come la probabilità che due varianti (es. alleli) di un individuo preso a caso nella popolazione siano i.b.d. a causa di inbreeding, cioè in eccesso rispetto al valore atteso dovuto a random mating. Definito F, dopo una generazione di inbreeding si ha che: f(aa)=(1-f)p 2 +Fp=p 2 +F(p-p 2 )=p 2 +Fp(1-p) =p 2 +Fpq f(aa)= q 2 +Fpq f(aa)=1-f(aa)-f(aa)=2(1-f)pq

8 Effetto dell inbreeding continuato Alla seconda generazione di autofecondazione si ha che F t = ½(1+F t-1 ), ossia del prodotto tra: 1) la probabilità ½ che i due alleli di un individuo nella generazione t derivano dalla replicazione dello stesso allele presente nella generazione t-1; 2) la probabilità ½F t-1 che i due alleli di un individuo nella generazione t derivano da alleli diversi nella generazione t-1, ma a loro volta i.b.d. perché provengono dallo stesso allele presente nella generazione t-2 Diverse generazioni di autofecondazione (o comunque di inbreeding) in assenza di random mating fanno in modo che F tenda ad un valore di equilibrio F * =1. Poiché f(aa)=2(1-f)pq, si ha che la quota di eterozigosi nella popolazione tende a 0

9 Quantificare l incremento dell omozigosi: popolazioni autogame Assumiamo una popolazione S 0 che non sia il risultato di inbreeding (es. una popolazione di ibridi F 1 derivante da incrocio tra linee pure). Per quanto detto, alla prima generazione di autofecondazione (S 1 ), F S1 =½. Dopo due generazioni di autofecondazione, F S2 =½(1+½)=¾, dopo 3 generazioni F S3 =7/8, e cosi via, fino a tendere come detto a F * =1. Considerato che f(aa)=2(1-f)pq, si ha il risultato che la quota di eterozigosi si dimezza ad ogni generazione di autofecondazione. Le popolazioni naturali di specie autogame sono un insieme di differenti linee pure

10 Incremento dell omozigosi in popolazioni autogame Considerato un genotipo eterozigote per n coppie alleliche, ed m generazioni di autofecondazione 100 Individui omozigoti (%) N di geni (n) N di generazioni segreganti (m) [F 2 ] ( 2 m - 1 ) n 2 m

11 Incremento dell omozigosi dovuto all inbreeding

12 Quantificare l incremento dell omozigosi: popolazioni con una certa quota di random mating Sia S la probabilità che uno zigote derivi da autofecondazione (ed 1-S conseguentemente la probabilità che derivi da random mating) Sia F il coefficiente di inbreeding ad una data generazione. Nella generazione successiva, si ha che F =S/2(1+F). Di conseguenza il cambiamento del coefficiente di inbreeding ΔF=S/2-(1-S/2)F Il coefficiente di inbreeding tende ad un equilibrio in cui F =F=F*(coefficiente di inbreeding all equilibrio), e dunque ΔF=0. Riarrangiando l equazione precedente per ΔF=0 si ha che F*=S/(2-S). Si noti che, in caso di autofecondazione stretta (S=1), F*=1, così come visto in precedenza L equilibrio di Sewall Wright è tale per cui: f(aa)=p 2 +F * pq; f(aa)=2(1-f * )pq; f(aa)=q 2 +F * pq Per F=0, l equilibrio di Sewall-Wright si riduce alle condizioni di equilibrio di Hardy- Weinberg

13 Struttura genetica di popolazioni naturali di specie coltivate Popolazioni naturali di specie prevalentemente autogame sono assimilabili ad un insieme di differenti linee pure Popolazioni naturali di specie prevalentemente allogame sono composte da diversi individui eterozigoti che si interincrociano liberamente (possibilità di equilibrio H. W.) Popolazioni naturali di specie che si propagano per via vegetativa sono normalmente multiclonali

14 Tipi di costituzione varietale 1. Linee pure 2. Popolazioni a libero interincrocio 3. Cloni 4. Ibridi F 1 (a partire da parentali omozigoti) 5. Altro (varietà multilinea, apomittiche, ibridi dall incrocio di cloni o popolazioni) Le costituzioni di tipo (1), (2) e (3) richiedono costi minimi di ottenimento in specie coltivate prevalentemente autogame, prevalentemente allogame e a propagazione vegetativa, rispettivamente (hanno una struttura genetica simile a quella di popolazioni naturali) Le costituzioni di tipo (4) richiedono costi maggiori: per specie allogame è necessario forzare il sistema riproduttivo verso l autofecondazione; per specie autogame e allogame è necessario applicare strategie per effettuare incroci controllati su larga scala. Vantaggi, come si dirà, sono lo sfruttamento dell eterosi e, per il costitutore, l impossibilità di riutilizzare il seme

15 Metodi di Miglioramento genetico Sarebbe più opportuno parlare di schemi di selezione che permettono, partendo dalla disponibilità di variabilità genetica, di arrivare alla costituzione varietale Classificazione 1 Metodi per specie autogame Metodi per specie allogame Metodi per specie a propagazione vegetativa Classificazione 2 Metodi per la costituzione di varietà omozigoti Metodi per la costituzione di varietà a libera impollinazione Metodi per la costituzione di varietà ibride Metodi per la costituzione di varietà clonali

16 Metodi di miglioramento genetico per la costituzione di varietà omozigoti Base: disponibilità di popolazioni geneticamente variabili da popolazioni naturali (es.ecotipi, varietà locali) Metodi di miglioramento per la costituzione di varietà omozigoti da popolazioni derivanti da incrocio Selezione massale Selezione per linea pura Pedigree Popolazione riunita SSD Reincrocio

17 Selezione massale

18 Considerazioni sulla selezione massale 1 Le varietà che derivano da selezione massale sono un miscuglio di linee pure più o meno omogenee per una serie di caratteristiche distintive In pratica, la selezione massale viene operata per scartare piante con difetti evidenti da ecotipi o varietà locali, senza compromettere le caratteristiche di adattabilità delle stesse all ambiente oppure per selezionare, nell ambito di un ecotipo o varietà locale, i genotipi più adatti ad un nuovo areale di coltivazione Le varietà ottenute per selezione massale non si ritrovano per colture economicamente importanti

19 Base teorica della selezione per linea pura: esperimenti di Johannsen

20 Selezione per linea pura

21 Considerazioni sulla selezione per linea pura Vantaggi: rapida; relativamente poco costosa; conduce a cultivar uniformi; applicabile per caratteri a bassa ereditabilità (selezione sulla base della media di linee omozigoti) Svantaggi: bassa adattabilità delle cultivar in relazione all uniformità genetica, necessità che il genotipo ideale sia già presente nella popolazione

22 Metodi a partire da popolazioni artificiali da incrocio Comunemente uno dei due parentali è costituito da una varietà di pregio. L altro parentale è scelto sulla base di uno o più caratteristiche su cui il primo parentale è deficitario INCROCIO Caratteri semplici Caratteri poligenici REINCROCIO PEDIGREE POPOLAZIONE RIUNITA S.S.D.

23 Reincrocio per trasferire un allele dominante

24 Reincrocio per trasferire un allele dominante

25 Reincrocio per trasferire un allele recessivo

26 Considerazioni sul metodo del reincrocio Viene applicato quando si vuole migliorare una varietà coltivata per caratteri ad eredità semplice (qualitativi, es. resistenza a malattie). Il parentale ricorrente è molto spesso una varietà di pregio; il parentale donatore è un genotipo che presenta una caratteristica interessante, ma in generale scadente da un punto di vista agronomico (es. una specie selvatica). Di solito si fanno 6-7 reincroci Per caratteri recessivi, ad ogni reincrocio deve seguire un ciclo di autofecondazione Problema derivante dall associazione del gene favorevole con geni sfavorevoli (fenomeno del linkage drag)

27 Linkage drag Donor variety Commercial Variety Resistance Gene X New Variety

28 Metodo pedigree

29 Metodo pedigree Si selezionano piante delle circa piante F2 allevate in modo spaziato. Da ciascuna pianta selezionata, si raccoglie il seme e si costituisce una progenie-fila di individui F3 allevati spaziati Si seleziona, in F3, per pianta singola e (in misura minore) in base alle caratteristiche medie della progenie fila. Da ciascuna pianta si costituiscono progenie fila F4 allevate spaziate Si seleziona, in F4, per pianta singola e (in misura maggiore) in base alle caratteristiche medie della progenie fila. Da ciascuna pianta si costituiscono progenie fila F5 allevate spaziate Si seleziona in F5 come in F4. Si selezionano circa 200 famiglie F5 (o linee, perché altamente omozigoti) Dalla F6 in poi si semina alle comuni densità e si seleziona solo in base alla performance media della linea. Circa 100 linee sono valutate in F7 F8-F10: prove agronomiche con le varietà in commercio in più località Nelle prime generazioni segreganti (F2 ed F3) si seleziona prevalentemente per caratteri qualitativi. Nelle generazioni successive si seleziona per caratteri quantitativi

30 Considerazioni sul metodo pedigree Vantaggi: Le note pedigree riportano informazioni circa le caratteristiche fenotipiche della genealogia. Ciò aiuta ad effettuare scelte (es. valutare una linea anche in base alle caratteristiche parentali, oppure portare avanti linee migliori di diversa discendenza, in modo da esplorare più variabilità genetica) Svantaggi: Lungo Laborioso (selezione in ogni generazione) Selezione su piante singole ed eterozigoti, dunque inefficiente per caratteri quantitativi Selezione su piante spaziate non rispecchia le reali situazioni di campo Compilare le note pedigree ha un costo importante

31 Metodo bulk

32 Considerazioni sul metodo bulk I prodotti dell incrocio iniziale vengono allevati insieme per 5-7 generazioni, in modo da ottenere un ampia popolazione di linee pure all interno delle quali iniziare il lavoro di selezione La popolazione F2 è molto grande ( individui) e seminata secondo normali densità, non dovendosi effettuare selezione antropica. Alla fine del ciclo il seme viene raccolto in massa (bulk) e si estrae un campione casuale di semi In F3-F6 si procede come in F2 In F7 si seleziona per piante singole, seminate in maniera spaziata, e si allestiscono linee F8 seminate spaziate Si seleziona in base alla media delle linee e si allestiscono linee F9, seminate secondo le normali densità di semina Dalla F9 alla F12 si allestiscono prove replicate in più ambienti

33 Considerazioni sul metodo bulk Vantaggi: Relativamente al metodo pedigree, più semplice e meno costoso (assenza di note e mancanza di selezione nelle prime generazioni) Rispetto al pedigree, la selezione su pianta singola è rimandata a materiale omozigote Ottimale quando si seleziona per adattabilità all ambiente Svantaggi: Lungo Fitness vs valore agronomico

34 Metodo SSD

35 Considerazioni sul metodo SSD Si raccolgono 1-2 semi da ogni individuo F2 ( piante) Si ripete l operazione fino alla F5-F6. Il trattamento delle altre generazioni è simile a quello visto per il metodo bulk Come per la popolazione riunita, si seleziona su molte più piante rispetto al pedigree Come per la popolazione riunita, si seleziona su piante omozigoti, e dunque si minimizza il disturbo dovuto ad effetti di dominanza. Questo è un vantaggio rispetto al pedigree

36 Considerazioni sul metodo SSD Vantaggi: Relativamente al metodo pedigree, più semplice e meno costoso (assenza di note e mancanza di selezione nelle prime generazioni) Rispetto al pedigree, la selezione su pianta singola è rimandata a materiale omozigote Molto breve (3-4 generazioni in un anno) Ottimale quando l adattabilità ambientale è in contrasto con il valore agronomico Svantaggi: Non è ideale per selezionare caratteristiche di adattabilità all ambiente Considerare un solo seme per pianta può causare perdita di variabilità favorevole per effetto della segregazione

37 Metodi di Miglioramento genetico per la costituzione di popolazioni migliorate a libera impollinazione A fini didattici, essi possono essere divisi in fenotipici e genotipici. I primi prevedono una selezione di individui sulla base della semplice ispezione del fenotipo degli stessi (buona per caratteri ad alta h 2 N (>50%)) I secondi prevedono che la selezione avvenga sulla base del fenotipo della progenie, valutato in apposite prove

38 Metodi di selezione fenotipica Sono semplici, e possono permettere rapidi miglioramenti in specie minori per cui scarso è stato il lavoro di selezione, o in specie di nuova introduzione in un nuovo areale di coltivazione. Possono altresì essere messi in atto non per costituire direttamente una varietà, ma per costituire popolazioni di base migliorate da cui partire con ulteriori metodi di miglioramento genetico Selezione massale per via materna Selezione massale per via materna e paterna Selezione ricorrente semplice

39 Selezione massale per via materna Si raccolgono i semi dagli individui migliori da una popolazione di partenza (es. ecotipo, varietà locale, F2) Tale seme, opportunamente mescolato, darà origine ad una popolazione migliorata per frequenze geniche e genotipiche (materiale di base per ulteriori programmi di miglioramento genetico) o alla varietà commerciale La selezione è basata esclusivamente sul valore della pianta portaseme, pertanto si parla di selezione per via materna

40 Selezione massale o per via materna

41 Considerazioni sulla selezione massale per via materna e paterna Rappresenta un miglioramento della selezione massale per via materna In pratica, si procede all estirpazione delle piante non interessanti (oppure alla propagazione clonale di quelle interessanti) e si lascia avvenire l incrocio solo tra piante fenotipicamente superiori In questo modo, il polline, e non solo le cellule uovo, deriva da piante agronomicamente valide

42 Schema di selezione massale per via materna e paterna

43

44 Selezione ricorrente E in pratica, rappresentato da più cicli di selezione massale ripetuti a partire da una popolazione di partenza Come gli altri metodi, può essere condotta per produrre una popolazione di base per ulteriori programmi di miglioramento genetico o per ottenere varietà migliorate

45 Selezione ricorrente semplice

46 Selezione genotipica Le piante vengono selezionate sulla base di del valore della loro progenie (circa 50 individui) I test di progenie (progeny test) possono essere atti valutare l attitudine alla combinazione generale (ACG) o l attitudine alla combinazione specifica (ACS) I test per l ACG permettono di ottenere indicazioni sul comportamento medio di un genotipo nelle sue combinazioni ibride. Un individuo con elevata ACG fornisce buone combinazioni ibride qualunque sia il genotipo con il quale viene incrociato. I test per l ACS permettono di ottenere indicazioni sul comportamento di un genotipo quando incrociato con uno specifico genotipo Si può verificare che un genotipo con bassa ACG si combini in modo eccellente con un altro genotipo dimostrando di avere con quest ultimo una elevata ACS L ACG è dovuta ad effetti genici additivi, l ACS anche ad effetti di dominanza

47 Tipi di prove di progenie Autofecondate Open cross Top cross Poly-cross Single cross

48 Prove di progenie da autofecondazione Utile per stimare l ACG, non l ACS

49 Prove di progenie da autofecondazione Utile per stimare l ACG, non l ACS

50 Prove di progenie da libera impollinazione (open-cross) Permette di selezionare per l ACG

51 Prove di progenie da libera impollinazione (open-cross) Permette di selezionare per l ACG

52 Prove di progenie top-cross A seconda del tester, che può essere ad elevata o bassa variabilità genetica, si potranno avere indicazioni e dunque selezionare in base all ACG o ACS

53 Prove di progenie top-cross A seconda del tester, che può essere ad elevata o bassa variabilità genetica, si potranno avere indicazioni sull ACG o ACS

54 Prove di progenie da polincrocio o poly-cross

55 Prove di progenie da polincrocio o poly-cross

56 Selezione basata su progenie da incrocio semplice (single cross) Vengono effettuati tutti gli incroci possibili (escluse autofecondazioni e reciproci) tra materiali in valutazione (linee inbred, cloni o altro) Il valore della progenie dai singoli incroci stima l ACG, quella media delle progenie ottenute da un singolo genotipo stima l ACS Fornisce molte informazioni, ma è inattuabile quando i materiali da valutare sono molti. Il numero di combinazioni ibride possibili è infatti n(n-1)/2

57 Selezione ricorrente per l ACG e ACS generale: progenie da pianta selezionata x tester ad alta variabilità (F2, varietà locale, etc.) specifica: progenie da pianta selezionata x tester a bassa variabilità (linee inbred) Come la selezione ricorrente semplice, permette di ottenere popolazioni migliorate per successive operazioni di miglioramento genetico oppure la costituzione di varietà commerciali

58 Esempio di selezione ricorrente per l ACG

59 Selezione ricorrente reciproca

60 Selezione ricorrente reciproca

61 Varietà sintetiche Per varietà sintetica si intende la varietà ottenuta dall interincrocio di genotipi (linee inbred o cloni) selezionati sulla base di appropriate prove di progenie Sono generalmente costituite da specie per le quali il costo di produzione di varietà ibride sarebbe molto elevato (es. foraggere) Infatti, per alcune generazioni (2-5), le varietà sintetiche non subiscono importanti variazioni per ciò che concerne frequenze geniche e genotipiche (equilibrio Hardy-Weinberg). Ciò permette di riutilizzarne il seme. Oltre tali generazioni, le sintetiche vano incontro ad un processo di ecotipizzazione, a causa dell adattamento ambientale. Ciò comporta generalmente un certo scadimento agronomico

62 Varietà sintetiche I genotipi che danno origine alla sintetica costituiscono la generazione Syn0 Il seme della generazione Syn1 è troppo poco per essere commercializzato Dunque le varietà sintetiche in commercio corrispondono generalmente alle Syn2, Sy3 e Syn4 Per mantenere una sintetica, bisognerà mantenere gli individui Syn0. Inoltre bisognerà mantenere costante l ambiente di moltiplicazione per ciò che concerne tecnica colturale. Infine, bisognerà favorire il libero incrocio tra gli individui in moltiplicazione

63 Schema di ottenimento di una varietà sintetica

64 Stima del valore agronomico di varietà sintetiche Nel 1922, Sewall-Wright propose una formula per prevedere la produttività media di una fintetica prodotta a partire da linee inbred: F2 =F1-[(F1-P)/n] Dove F2 è la produzione media della sintetica in Syn1 e nelle altre generazioni poste le condizioni di equilibrio HardY-Weinberg; F1 è la produzione media delle varie combinazioni ibride; P è la produzione media delle linee inbred n è il numero di linee inbred Dunque, per aumentare il valore di una sintetica, il breeder può utilizzare linee inbred che producano ibridi più produttivi, utilizzare linee inbred più produttive o aumentare il numero di linee inbred

65 Numero linee e Produzione t x ha N linee inbred Media delle F1 Attesa in F2 2 6,59 4,41 3 6,3 5,14 4 6,33 5,35 5 6,18 5,41 6 6,02 5,41 7 5,85 5,33 8 5,70 5,26 9 5,59 5, ,39 5,04

66 Ibridi F 1 Per varietà ibrida si intende comunemente la la generazione F1 ottenuta dall incrocio di due linee inbred (specie allogame) o due linee pure (specie autogame) opportunamente selezionate sulla base di prove di progenie Oggi, ibridi F 1 sono prodotti un po per tutte le specie ad alto reddito, sia autogame che allogame (incluse le ortive) Vantaggi delle costituzioni ibride sono la loro uniformità (maggiore rispetto a varietà in equilibrio H. W.), il maggiore sfruttamento dell eterosi (vedi dopo), e, per il costitutore, l impossibilità di reimpiego del seme Svantaggi: bisogna effettuare incroci controllati oppure sfruttare particolari barriere riproduttive

67 Eterosi L eterosi (sinonimo vigore ibrido) è definita come l incremento in dimensioni, vigore fertilità e produttività (in generale, la performance) di un ibrido rispetto alla media dei parentali L effetto eterotico è positivamente correlato al numero di loci eterozigoti dell ibrido e, dunque, generalmente si ha che esso aumenta all aumentare della distanza genetica tra i parentali Perché l effetto eterotico sia di interesse per il breeder, non basta che l ibrido abbia performance superiore alla media dei parentali, ma superiore al migliore dei due parentali L effetto eterotico è maggiore nelle allogame, ma è stato dimostrato anche per specie autogame come i frumenti o il pomodoro

68 Eterosi B73 F 1 H99 1 cm

69 Eterosi

70 Eterosi Stime dell eterosi negli ibridi F 1 (in termini percentuali rispetto alla media delle prestazioni parentali) per la produzione di seme.

71 Depressione da inbreeding in mais

72 Teorie per spiegare l eterosi (e la depressione da inbreeding) Secondo la teoria della dominanza, la depressione da inbreeding è determinata da mutazioni recessive deleterie, che l inbreeding stesso porta in omozigosi. Particolari incroci tra parentali geneticamente diversi minimizzano la percentuale di alleli deleteri allo stato omozigote, con conseguente eterosi. Ipotesi della sovradominanza: superiorità del valore genotipico degli eterozigoti rispetto agli omozigoti aa d AA Aa

73 Teorie per spiegare l eterosi (e la depressione da inbreeding) Probabilmente, tutte e due le ipotesi sono veritiere. Infatti, specie autogame sono meno soggette a depressione da inbreeding. Ciò è compatibile con il fatto che mutazioni deleterie in specie autogame, a differenza che in specie allogame, sono sottoposte all azione della selezione e dunque eliminate. In ogni modo, come detto in precedenza una certa eterosi è ottenibile anche in specie autogame, tanto che per specie autogame di pregio è comune produrre varietà ibride, il che indica fenomeni di sovradominanza.

74 Depressione da inbreeding e costituzione varietale In specie allogame, la produzione dell ibrido richiede la costituzione di linee inbred attraverso ripetute autofecondazioni. Nel corso di tali autofecondazioni si rende evidente il fenomeno della depressione da inbreeding, ovvero lo scadimento della performance agronomica man mano che si raggiungono livelli elevati di omozigosi Alcune specie allogame (es. erba medica) risentono moltissimo della depressione da inbreeding, tanto che l autofecondazione è associata a ibridi non vitali o sterili. Altre specie tollerano più autofecondazioni. Tra queste mais, girasole e, soprattutto, Cucurbitaceae da orto. Le varietà eterozigoti, e in particolare gli ibridi, sono le uniche in grado di sfruttare il fenomeno eterotico

75 Gruppi e pattern eterotici Gruppo eterotico: gruppo di individui che mostrano attitudine combinatoria simile quando incrociati ad individui di altri gruppi Un pattern eterotico è definito come una coppia specifica di gruppi eterotici che esprimono un elevato livello di eterosi nei loro incroci La conoscenza di gruppi e pattern eterotici è ovviamente importante al fine di massimizzare le possibilità di costituire combinazioni ibride di successo Poiché l eterosi è legata all eterozigosi, pattern eterotici sono generalmente osservati all aumentare della distanza genetica tra i parentali

76 Distanza genetica dei parentali e performance in melanzana

77 Definizione di gruppi eterotici Marcatori molecolari Prove di attitudine alla combinazione Esempio di pattern eterotici: Minor, Major e Mediterraneo per la fava

78 Scelta dei parentali dell ibrido Gruppi e pattern eterotici Caratteri qualitativi e performance produttiva Prove di progenie. Se un parentale dell ibrido è già noto (una linea di élite), si testa direttamente l ACS. Alternativamente, si testano prima l ACG e quindi l ACS attraverso incroci diallelici

79 Produzione della semente ibrida Sincronizzazione della fioritura dei parentali (semine scalari) Adeguato rapporto file portaseme-impollinanti Attenzione a contaminazioni ed eliminazione dei fuori tipo Emasculazione manuale portaseme e incrocio controllato (pomodoro, peperone, melanzana) Sfruttamento monoicia (es. Cucurbitaceae) Sfruttamento autoincompatibilità in associazione a metodi fisici o chimici in grado di rompere tale barriera e assicurare il mantenimento delle linee parentali (Brassicaceae) Maschiosterilità (es. barbabietola, carota, cipolla) Massime cure colturali e raccolta a maturità fisiologica

80 Produzione semente ibrida attraverso la demasculazione

81 Autoincompatibilità Impossibilità di fecondazione a causa di incompatibilità genetica tra polline e pistillo dello stesso individuo. Tale incompatibilità deriva dalla presenza di loci di incompatibilità (S) Oltre che impedire l autofecondazione, l autoincompatibilità impedisce l incrocio tra individui diversi portatori degli stessi alleli Tipi di autoincompatibilità: 1. Gametofitica: la fecondazione non avviene se il polline (gametofito, numero cromosomico n) è portatore di un allele al locus S presente nel corredo cromosomico 2n del pistillo 2. Sporofitica: la presenza o meno di fecondazione dipende dai genotipi del pistillo (2n) e della pianta madre del polline (anch essa 2n). Evidentemente, in tal caso, i prodotti dei geni S si trovano sulla superficie del granulo pollinico, derivata da tessuti sporofitici

82 Autoincompatibilità gametofitica Es. ciliegio, mandorlo, susino, melo

83 Autoincompatibilità sporofitica

84 Maschiosterilità o femminasterilità Mancanza della capacità funzionale dell androceo o gineceo Risulta inevitabilmente in alloincrocio Linee portasemi maschiosterili sono di grande interesse per la produzione di ibridi senza ricorrere all incrocio manuale Lo studio della femminasterilità potrebbe avere un applicazione pratica nel miglioramento genetico delle specie da fiore (fioritura più prolungata)

85 Maschiosterilità genetica Inconveniente: difficoltà nel mantenere la linea maschiosterile

86 Maschiosterilità citoplasmatica Controllata da geni mitocondriali Facile mantenere la linea maschiosterile C è bisogno di impollinatori maschiofertili perchè gli ibridi producano seme

87 Maschiosterilità genetico-citoplasmatica Geni ristoratori (R) nucleari permettono di ripristinare la fertilità in presenza di citoplasma con geni di maschiosterilità Il mantenimento della linea maschiosterile può essere ottenuto per incrocio di questa con genotipi (maschiofertili) portanti citoplasma normale e non dotati di geni ristoratori (rr) Si possono produrre ibridi maschiofertili che possono incrociarsi tra loro

88 Costituzione di varietà ibride di mais I primi ibridi di mais, costituiti dall incrocio di due linee inbred, non ottennero un grande successo, a causa della scarsa produzione di seme dalla inbred portaseme, la scarsa produzione di polline dalla inbred inpollinante, e il modesto incremento di produttività Pertanto, ebbero successo ibridi doppi (o a quattro vie), del tipo (AxB) x (CxD). In questo modo, il portaseme e l impollinante sono entrambi vigorosi, è ciò permette di avere una quantità maggiore di seme. D altra parte, non si tratta di ibridi F1 veri e propri e dunque sono piuttosto eterogenei Via via che si rendevano disponibili linee inbred più produttive, sono stati costituiti dapprima ibridi a tre vie e finalmente ibridi semplici Nei paesi ad agricoltura evoluta, gli ibridi semplici sono i più diffusi anche in virtù di tecniche che permettono la semina di precisione, con conseguente risparmio sul costo di acquisto della semente ibrida

89 Ibridi doppi nel mais

90 Ibridi a tre vie nel mais

91 Schemi per la costituzione di ibridi semplici di mais I campi di moltiplicazione delle inbred e di produzione degli ibridi devono essere isolati tra loro e da altre coltivazioni (per il mais circa 200m) I campi di moltiplicazione delle inbred devono essere sottoposti a selezione negativa dei fuori tipo Nel campo di produzione dell ibrido, il rapporto di file portaseme e file dell impollinante dipende essenzialmente dalla vigoria della inbred impollinante. Linee inbred impollinanti vigorose permettono di avere in campo un rapporto fila portaseme:fila impollinante anche di 3:1, e dunque produrre più seme per unità di superficie Utilizzo di linee maschiosterili

92 Schemi per la costituzione di ibridi semplici di mais La costituzione degli ibridi di mais prevede le seguenti fasi: Individuazione delle popolazioni da cui estrarre alcuni individui corrispondenti all ideotipo (circa 500). Questi saranno sottoposti ad autofecondazione forzata e selezione per 5-7 generazioni. Alla fine si giungerà a linee inbred per ciascuna delle popolazioni scelte; Le linee inbred migliori sono valutate prima in base all ACG (prove di progenie top-cross). Circa 20 linee inbred selezionate sono quindi valutate in base all ACS. Selezionando 20 linee inbred sarà necessario valutare in campo [(20 x 19)/2 ibridi semplici I campi di moltiplicazione delle inbred e di produzione degli ibridi devono essere isolati da altre coltivazioni (per il mais circa 200m)

93 Campo di produzione di seme ibrido

94 Reincrocio in specie prevalentemente allogame Il metodo non differisce concettualmente da quanto riportato per specie autogame. Per quanto riguarda varietà ibride, si tratta di introdurre uno o pochi geni di interesse in linee inbred Per quanto riguarda varietà in equilibrio Hardy Weinberg, il parentale ricorrente deve essere rappresentato da un numero sufficiente di piante in modo da non incorrere in depressione da inbreeding e mantenere inalterate frequenze geniche e genotipiche.

95 Metodi per la costituzione di varietà clonali Specie a propagazione vegetativa: Annuali e, soprattutto, poliennali Molte sono anche prevalentemente allogame (eterosi e depressione da inbreeding) Popolazioni naturali con struttura policlonale Clone: popolazione costituita da piante originate da un unico capostipite moltiplicato vegetativamente.

96 Metodi per la costituzione di varietà clonali Selezione clonale Ibridazione intra e interspecifica

97 Varietà clonali da ibridazione

98 Varietà clonali originate da ibridazione Strategia molto utilizzata per specie ortive La selezione si basa esclusivamente sul fenotipo ed è pertanto efficace solo per caratteri ad elevata ereditabilità Se il prodotto principale non è il seme o il frutto è più semplice inserire l ibridazione interspecifica nel programma di miglioramento genetico (eventuali problemi di sterilita non compromettono il risultato)

99 Ibridi direttamente impiegati in coltivazione:es. tangelo C. reticulata x C. paradisiaca

100 Ibridi direttamente impiegati in coltivazione:es. mapo C. reticulata x C. grandis

101 Ibridi direttamente impiegati nella coltivazione

102 Selezione clonale Valutazione fenotipica della popolazione di partenza Selezione degli individui superiori Propagazione vegetativa di tali individui

103 Problematiche! Per piante presentanti un ciclo vitale lungo è necessario attendere anche anni per ottenere i primi risultati (nelle piante arboree)

104 Selezione assistita da marcatori molecolari

105 Associazione Due loci (es. genici) sono associati se posizionati in prossimità sullo stesso cromosoma Per effetto dell associazione, i gameti prodotti dalla segregazione del diibrido tendono ad avere combinazioni alleliche parentali, a meno di eventi di ricombinazione

106 Associazione La probabilità di formazione di gameti ricombinanti dipende dalla distanza fisica tra i loci Dunque, la frequenza di gameti ricombinanti può essere utilizzata per effettuare una stima della distanza fisica tra due loci, detta distanza genetica

107 Associazione L unità di misura della distanza genetica è il centimorgan (cm) 1 cm può essere interpretato come la distanza corrispondente all 1% di gameti ricombinanti Se i loci sono molto lontani sullo stesso cromosoma, si dimostra che la loro distanza tende a 50 cm

108 Associazione Per calcolare la distanza genetica bisogna dunque determinare la frequenza di gameti ricombinanti (r) Non si può determinare direttamente il genotipo dei gameti! In pratica, il genotipo dei gameti viene ricostruito indirettamente attraverso l analisi del fenotipo di una popolazione segregante

109 Reincrocio 4 diversi fenotipi corrispondono a 4 diversi genotipi di gameti! Facile calcolare la distanza genetica tra A e B

110 Altre popolazioni sperimentali Il genotipo dei gameti può essere ricostruito anche per mezzo di altri tipi di popolazioni sperimentali (es. F 2 ) In F 2 non si può risalire così facilmente dall esame del fenotipo al genotipo dei gameti. Es. in caso di dominanza, il fenotipo AaBb è uguale a quello di AABB, etc. e dunque il genotipo dei gameti rimane indeterminato Metodologia statistica più complessa (maximum likelihood) stima r (opportuni software)

111 Mappatura genica Una mappatura accurata porta alla formazione di un numero di gruppi di associazione pari al numero cromosomico aploide

112 Sulla definizione di cm Se la distanza in cm è espressa come percentuale di gameti ricombinanti, le distanze genetiche non sono additive Nelle mappe, la distanza genetica indica il numero medio di eventi di ricombinazione tra due loci, tenendo conto di doppi crossing-over: in questo modo, le distanze genetiche sono additive. Funzioni di mappa convertono la stima dei gameti ricombinanti in distanza genetica

113 Funzioni di mappa

114 Selezione assistita da marcatori molecolari Cosi come i loci genici, anche i loci identificati da marcatori molecolari possono essere associati I diversi marcatori molecolari possibili ad un locus polimorfico (es. presenza e assenza di banda) corrispondono ai diversi alleli che caratterizzano un locus genico

115 Selezione assistita da marcatori molecolari Base: associazione genica tra un locus individuato da marcatori molecolari e un locus genico che sottintende un carattere qualitativo o quantitativo. Conseguenza: associazione statistica, in una popolazione, tra un marcatore presente ad un locus polimorfico e un effetto fenotipico favorevole Applicazione: possibilità di selezionare in base alla presenza di un marcatore molecolare piuttosto che sull effetto fenotipico, evitando gli svantaggi associati alla selezione fenotipica

116 Utilizzo dei marcatori molecolari in Miglioramento genetico Selezione assistita per caratteri qualitativi e quantitativi Stabilire l avvenuta ibridazione nella generazione F 1 Stabilire la diversità genetica di parentali, al fine di massimizzare l eterosi Identificazione (e protezione) di genotipi

117 Linkage drag Donor variety Commercial Variety Resistance Gene X New Variety

118 Vantaggi della selezione assistita nel reincrocio Permette di evitare test fenotipici Molto utile quando l allele da introdurre è recessivo e si fa uso di marcatori codominanti. Essi permettono infatti di distinguere gli omozigoti dominanti dagli eterozigoti, e dunque si può evitare una generazione di autofecondazione ad ogni generazione di reincrocio Si può limitare di molto il linkage drag

119 Molecular markers for MAS at Di.S.S.P.A

120 MAS for er1 resistance

121 Functional markers for er1 resistance selection

122 Genomic selection

123 Selezione genomica (GS o GWS) Conseguenza della disponibilità di piattaforme high-throughput per la genotipizzazione (soprattutto SNPs) Selezione non sulla base di particolari marcatori associati ad alleli di interesse (MAS), ma sulla base della stima genomica del valore di breeding (GEBV) Training phase in cui si sviluppano formule per il calcolo del GEBV, sulla base di dati fenotipici e genotipici Breeding phase in cui si applicano i risultati della training phase sulla popolazione in selezione

124 Genomic selection Nakaya e Isobe, 2012

125 Breeding value (BV) dove: m 0 = media del carattere nella popolazione h 2 = ereditabilità in senso stretto y i = valore fenotipico dell individuo i Nella GS, V(A) è scomposta nella varianza degli effetti di marcatori lungo tutto il genoma, V(A 1 ), V(A 2 ) V(A N ), assumendo nessuna correlazione tra marcatori Dalla relazione tra marcatori e fenotipo nella training population si stimano y i e V(A). Da questo si calcola il BV che, dato il modo con cui viene stimato, viene detto GEBV

126 Modello lineare per la stima di y i nella training population dove: Y i = valore fenotipico dell individuo i X 1i =valore del marcatore dell individuo 1 (valori 0 e 1) e i = termine di errore (si assume distribuito normalmente con media 0) В o e В 1 = parametri da stimare ad es. con il metodo dei minimi quadrati Nakaya e Isobe, 2012 Per M marcatori:

127 Correzioni al modello lineare LASSO (least absolute shrinkage and selection operator) Ridge regression Metodi bayesiani