RELAZIONE FINALE DELLA CAMPAGNA DI ANALISI MICROBIOLOGICA PRESSO IL DEPOSITO DELLA BIBLIOTECA DEL PONTIFICIO COLLEGIO LATINO- AMERICANO

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1 RELAZIONE FINALE DELLA CAMPAGNA DI ANALISI MICROBIOLOGICA PRESSO IL DEPOSITO DELLA BIBLIOTECA DEL PONTIFICIO COLLEGIO LATINO- AMERICANO Analisi effettuate in data 02 Dicembre 2010 Quantificazione del servizio / campioni Missione, sopralluogo e campionamento 1 Analisi diretta al microscopio ottico dei campioni prelevati con nastro adesivo e reverse gel (metodo UNI 4 Normal 10923_2001 modificato per colorazione FDA) Analisi indiretta mediante metodo colturale (funghi, batteri, attinomiceti) delle superfici contaminate 4 Analisi microbiologica aerea con prelievo attivo e passivo 4 Analisi dei dati e report finale 1 1. SOPRALLUOGO Il deposito della biblioteca in esame è sviluppato su un unico piano (al piano terra) in un ambiente diviso in due sale. La climatizzazione è conferita da termoconvettori a termostato. Non è presente un sistema di filtraggio microbiologico dell aria. I volumi, di varia datazione, sono costituiti da coperte di vario materiale: tessuto, cuoio, cartoncini o pergamena. Essi sono conservati su scaffalature aperte metalliche. I problemi microbiologici più evidenti sono concentrati nella sala più lontana (che chiameremo d ora in avanti seconda sala ) rispetto all ingresso. La sala è priva di finestre ed ha quindi un ricambio d aria limitato. Tuttavia, anche nella sala più vicina all ingresso (che chiameremo prima sala), che presenta anche finestre verso l esterno (infissi in legno), sono evidenti deboli contaminazioni di origine fungina, specie nei piani inferiori delle scaffalature. Le contaminazioni più evidenti si trovano sulle coperte di pergamena, cuoio e tessuto dei volumi più antichi conservati nella seconda sala. Sulle coperte sono spesso evidenti efflorescenze biancastre di chiara natura fungina (fig.1) Durante il campionamento l umidità e la temperatura ambientale, misurata nella seconda sala, si attestava attorno al 60% UR e 20 C. Fig.1. micelio e fruttificazioni fungine su coperta in tela (ingrandimento 200x). 1

2 2. CAMPIONAMENTO Prelievo aereo (passivo): Le piastre usate per la sedimentazione aerea, sono state poste sempre a circa 1 metro da terra per 1h. PUNTI CAMPIONE: vedi scheda prelievo. Il testimone di confronto (punto 1), è stato prelevato nell anticamera del deposito, confinante con l ingresso principale della biblioteca. TERRENI DI CRESCITA: MEA: malt extract agar CYA: czapeck agar modificato DRBC: dichloran rose bengal cloramphenicol agar LB: lura-bertani agar DG18: dichloran-glicerol agar Prelievo aereo (attivo): La pompa aspiraspore utilizzata per i prelievi è stata posta su un cavalletto fotografico a circa 1,5m di altezza, negli stessi punti del campionamento passivo. La conta sporale e la determinazione delle colonie formanti colonia (UFC), che rappresenta la quantificazione delle spore vitali in grado di crescere su terreni di coltura, è stata effettuata tramite le celle di raccolta Via-Cell (Zefon). L UFC è stata determinata sui terreni LB e DRBC dopo incubazione a 22 e 37 C. Prelievo su superfici tramite reverse gel, Fungi Tape e membrana di nitrocellulosa: PUNTI CAMPIONE: vedi scheda prelievo I campioni ottenuti con Fungi Tape sono stati utilizzati per la visualizzazione diretta al microscopio ottico previa colorazione specifica per funghi. Quelli ottenuti con reverse agar sono stati trattati per a) la conta sporale in cella Thoma; b) la conta delle UFC tramite diluizioni successive e incubazione sui terreni DG18 (funghi xerofili), MEA (funghi), DRBC (funghi) e Amid Caseina (attinomiceti); c) la visualizzazione al microscopio ad epifluorescenza dell attività biologica delle strutture fungine mediante colorazione con fluorescein diacetato (FDA). I campioni ottenuti con membrana di nitrocellulosa sono stati posti immediatamente dopo il prelievo sui terreni DG18 e CYA per l isolamento e la conta diretta delle UFC. 3. ANALISI MICROBIOLOGICA AEREA 1. prelievo passivo Con questo metodo si enumerano i propaguli che, depositandosi per sedimentazione passiva su piastre Petri agarizzate, lasciate aperte per 1h, riescono a crescere e a formare colonia (tab.1). Per ambienti non deputati ad attività sensibili da un punto di vista igienico-sanitario (come ospedali o mense), la soglia limite su terreni generici come LB è di 75 unità formanti colonia per piastra (Standard IMA secondo Pasquarella et al. Journal of Hospital Infection 2000). 2

3 Batteri Funghi punti (UFC/piastra) (UFC/piastra) campione 37 C 22 C 37 C 22 C 1 (testimone) ,5 1,5 1 1, , Tab.1 Nonostante la bassa presenza microbica registrata nell aria con questo metodo, in tutti i campioni si è registrata la presenza del fungo termofilo Aspergillus fumigatus, che è l unico organismo fungino ad essere indicato come pericoloso per la salute umana dal decreto 81/2008 (ex 626/94) sulla sicurezza dei luoghi di lavoro. La sua presenza è bassa e diffusa in tutti gli ambienti campionati, compreso il testimone esterno. Ciò significa che la sorgente non è da ricercarsi all interno del deposito. Il riconoscimento di questa specie, è stato effettuato mediante l analisi delle caratteristiche biometriche e morfologiche al microscopio ottico. Il riconoscimento definitivo dovrebbe essere condotto mediante analisi del DNA. E da segnalare inoltre che all interno del deposito è presente una discreta abbondanza di UFC batteriche, dominate da un morfotipo che cresce a 37 C, non identificato a livello tassonomico. Il riconoscimento di questo morfotipo dovrebbe essere effettuato mediante analisi del DNA. 2. Prelievo attivo Conta sporale con Via-Cell Con questo metodo si enumerano i propaguli fungini per metro cubo di aria aspirata, sia quelli vitali, sia quelli non vitali (tab.2). In letteratura si considera accettabile da un punto di vista igienico-sanitario, un valore di propaguli inferiore a 10000/m 3 (Baxter et al. J. Occup. Environ. Hyg. 2005). punti campione spore/m Tab. 2. Il punto campione 3 manca, a causa di un inconveniente tecnico. Il punto campione 2, oltre ad essere quello in cui si riscontra la più alta carica microbica, è dominato da un tipo di spora di piccole dimensioni, ovale e in catenelle, simili a quelle dei generi Acremonium o Verticillium. La presenza di questo morfotipo unicamente nel punto 2 indica che la sorgente è interna. Tuttavia la sua abbondanza non supera i valori d attenzione. Nel punto campione 4 è dominante un tipo di spora tondeggiante ed ornamentata appartenente al genere Aspergillus. Tuttavia questa spora non è associabile alla specie fumigatus, ed è comunque a livelli molto bassi (circa 66 spore/m 3 ). In tutti gli ambienti, in particolare nella prima sala, si riscontra una relativa abbondanza di pollini (circa 1000 pollini/m 3 nel punto 2). 3

4 Conta delle unità formanti colonia (UFC) con Via-Cell Con questo metodo si enumerano solo i propaguli vitali dispersi nell areosol in grado di formare colonia su specifici terreni di crescita (tab.3). In letteratura sono proposti diversi limiti, l Unione Europea e l ISPESL indicano come valore medio di contaminazione livelli batterici o fungini compresi fra 100 e 500 UFC/ m 3. punti Batteri Funghi campione 37 C 22 C 37 C 22 C Tab.3 Nel punto 2 corrispondente alla prima sala del deposito, il limite delle 500 UFC è superato, anche se di poche unità. In particolare si riscontra un abbondante livello di UFC batteriche, a conferma di quanto riscontrato col metodo passivo. Ciò indica che in questo ambiente la qualità dell aria è mediocre dal punto di vista microbiologico. Tra le poche colonie fungine isolate, è stata di nuovo riscontrata nel punto campione 2 la presenza del fungo termofilo Aspergillus fumigatus. 4. ANALISI MICROBIOLOGICA DELLE SUPERFICI Analisi visuale dei campioni prelevati con adesivo trasparente (fungi tape), reverse gel e membrane di nitrocelluosa Con Fungi Tape 4

5 Fig.2: Immagini ottenute al microscopio ottico a 600 ingrandimenti, con colorazione blu cotton. Le immagini provengono dai campioni 1-4. In tutti i campioni prelevati con adesivo trasparente si evidenzia la presenza dominante di un unico tipo di Aspergillus, compatibile con la specie Aspergillus halophilicus (anamorfo di Eurotium halophlicum), un fungo xerofilo tipico di archivi e depositi librari. Con reverse gel Con questo materiale è possibile colorare i campioni con sostanze fluorescenti in grado di rilevare l attività biologica dei propaguli microbici. Il campione può essere osservato subito dopo il prelievo o dopo un periodo d incubazione. Fig.3. Osservazione in luce fluorescente. A sinistra campione fresco, a destra campione dopo due giorni d incubazione a 22 C. Come evidenziato dalla figura 3, l attività biologica dei campioni freschi è assai ridotta. Dopo due giorni d incubazione si riscontra la germinazione di alcune spore. Ciò indica che l attività biologica della contaminazione è bassa, in stato di quiescenza. Anche con questo metodo si visualizza la presenza dominante del fungo compatibile con A. halophilicus. Conta sporale del paricolato prelevato dai campioni con reverse agar 5

6 Sono stati enumerati tramite cella Thoma al microscopio ottico propaguli fungini (frammenti ifali e spore vitali e non vitali) prelevati con reverse agar (tab. 4). Punti campione conta sporale (propaguli/cm 2 ) Tab.4 Analisi colturale dei campioni prelevati con reverse agar Con questo metodo si enumerano solo i propaguli vitali (UFC) presenti sulla superficie campionata, in grado di formare colonia su specifici terreni di crescita (tab. 5). Punto campione UFC/cm 2 terreno 1 4 MEA 2 2 MEA 3 11 MEA 3 0 MEA Tab.5: è riportato solo il valore più alto, ottenuto fra i vari terreni utilizzati Il terreno di crescita che ha determinato la formazione del maggior numero di colonie fungine è in questo caso il MEA. Tra i pochi funghi isolati sono state rinvenute colonie associabili ad Aspergillus fumigatus e di un tipo di Penicillium sp. non determinato a livello di specie (che chiameremo tipo 1). Non è stata rinvenuta alcuna colonia di attinomiceti. Analisi dei campioni prelevati tramite membrane di nitrocellulosa. Metodo che permette di enumerare propaguli vitali (UFC) presenti sulla superficie campionata mediante un prelievo a secco assolutamente non invasivo (tab. 6). Punti campione UFC/dm 2 su DG18 UFC/dm 2 su CYA 1 NC 42 2 NC 11 3 NC 14 4 NC 0 Tab. 6. Unità formanti colonia su terreno di crescita DG18 e CYA. Su terreno DG18, in tutti i campioni, soprattutto in 1 e 3, dopo più di 14 giorni d incubazione, compaiono sulla superficie dell agar un numero elevatissimo e non contabile (NC) di micro-colonie fungine, che per tipo di crescita e forma sono compatibili con l Aspergillus evidenziato con il 6

7 microscopio ottico su fungi tape e reverse gel, vale a dire A. halophilicus, sebbene la conferma definitiva dovrebbe essere effettuata mediante analisi del DNA. Oltre a questo fungo si riscontra la presenza di Penicillium tipo 1, altri Penicillium spp., A. fumigatus e Cladosporium sp. In tutti i campioni inoltre sono state rinvenute su CYA alcune colonie batteriche. CONCLUSIONI Le analisi descritte nella presente relazione confermano che parte del materiale librario presente all interno del deposito in particolare nella seconda sala, soffre di una contaminazione di origine fungina, sebbene non attiva al momento del prelievo. La contaminazione si osserva su coperte datate di pergamena, cuoio o tessuto. E invece assente sulle nuove rilegature e su altri materiali cellulosici. La natura fungina e lo stato di attività della contaminazione si desume dalle osservazione condotte in situ mediante microscopio digitale a luce riflessa (fig. 1) e da quelle effettuate al microscopio ottico in luce bianca ed epifluorescente su campioni prelevati con reverse gel e colorati con blu cotton (fig. 2) o fluorescein diacetato, quest ultimo in grado di evidenziarsi in presenza di attività biologica (fig. 3). Il segnale fluorescente aumenta dopo incubazione dei campioni per un giorno a 22 C (fig.3, immagine a destra). Questo significa che il biodeteriogeno fungino è vitale, ma in uno stato di quiescenza. Questa situazione è tipica di ambienti poco disturbati e soggetti a periodici sbalzi climatici, durante i quali il microrganismo dominante si risveglia, cresce e sporifica velocemente. Le immagini ottenute mediante microscopia mostrano strutture fungine, tutte associabili ad una specie di Aspergillus. La sua identificazione a livello di specie è complicata dal fatto che la sua crescita in vitro è assai limitata. Infatti, la sua presenza è rilevabile solo su terreni specifici per funghi xerofili (adattati ad ambienti secchi), come il terreno da noi adottato DG18 e solo se il campione è prelevato e piastrato su agar a secco, vale a dire col metodo delle membrane di nitrocellulosa. Su questo terreno il fungo cresce molto lentamente, producendo raramente strutture morfologiche in grado di permettere un suo riconoscimento specifico tramite microscopio. Dalla tipologia delle strutture sporificanti in vivo su Fungi Tape e dalle caratteristiche fisiologiche e morfologiche delle colonie in coltura, il fungo dominante da noi riscontrato sulle coperte dovrebbe essere riconducibile a Eurotium halophlicum (= Aspergillus halophilicus), tuttavia la certezza della diagnosi, in questo caso, si otterrebbe solo tramite l analisi del DNA (se richiesto dal committente). E. halophilicum è un fungo già rilevato più volte in archivi e biblioteche contaminate. In letteratura non esistono notizie di carattere igenico-sanitario associate a questo fungo. Essendo un fungo adattato a substrati molto secchi, è difficile pensare ad un suo ruolo in casi di infezione e micosi. Tuttavia trattandosi di un Aspergillus, c è il rischio che le sue spore, se presenti in grande numero, possano generare fenomeni allergici. La sua presenza dunque deve essere ridotta e tenuta sotto controllo. L analisi aerea condotta mediante aspirazione attiva e passiva dell aria ha fornito risultati contrastanti. Se da un lato la carica fungina dell aria si è mostrata assai ridotta, d altro canto desta preoccupazione la presenza costante di una specie associabile ad Aspergillus fumigatus, una specie che data la sua potenziale patogenicità non dovrebbe essere mai rilevata. La sua presenza anche nel testimone di controllo, nell anticamera del deposito, non ci consente tuttavia di affermare che la sorgente di A. fumigatus si trovi all interno del deposito. Per risalire all origine della sua presenza dovrebbero essere condotti altri monitoraggi aerei, possibilmente in diversi periodi dell anno, anche in altri locali della biblioteca, nei quali si potrebbero riscontrare livelli anche più elevati. Sempre a livello aereo, non si sono invece isolate colonie vitali dell aspergillo che contamina il materiale librario. Ciò significa che non c è un evidente associazione tra contaminazione aerea e biodeterioramento dei materiali. Ciò potrebbe derivare dal fatto che l Aspergillus dominante sul materiale librario non ha una dispersione conidica (di spore) molto elevata o perlomeno costante nel 7

8 tempo (al contrario di altri aspergilli più invasivi). E infatti probabile che, anche per quanto riguarda questo aspetto, la diffusione di questo aspergillo avvenga sporadicamente, dopo periodi di quiescenza, quando sussistono condizioni termo-igrometriche ottimali. La non trascurabile presenza di batteri sulle superfici delle coperte e il superamento delle 500 UFC/m 3 microbiche riscontrato a livello aereo nella prima sala, indicano a livello microbiologico una mediocre qualità dell aria e probabilmente parametri igrometrici non ottimali per la conservazione del materiale librario. I batteri, infatti, prosperano soprattutto in presenza di condizioni igrometriche elevate. Ciò potrebbe indicare fenomeni di condensa nell ambiente, provocati da sbalzi termo-igrometrici giornalieri. Nell immediato si consiglia: Rimozione dei volumi che presentano evidenti segni di contaminazione e volumi limitrofi per una loro disinfezione e spolveratura. Controllo del contenuto idrico dei volumi, in particolare di quelli contaminati. Se elevato procedere con la deumidificazione degli stessi. Controllo in continuo con data logger dei parametri termo-igrometrici dell ambiente. Disinfezione e pulitura degli ambienti: pavimenti, scaffalature e termoconvettori da parte di personale qualificato (in particolare si ribadisce quanto detto a voce durante il sopralluogo, vale a dire la pulitura dei filtri dei termoconvettori all esterno dei locali) Monitoraggio aereo complessivo per verificare la presenza di Aspergillus fumigatus. Identificazione definitiva mediante analisi del DNA del fungo indicato come A. fumigatus e del morfotipo batterico dominante nell aria. Per un approccio preventivo a lungo termine, nel caso si rilevassero valori termo-igrometrici non ottimali (supermento, anche intermittente, del valore di 60% UR, in presenza di temperature non inferiori a C), si consiglia di intervenire strutturalmente con la sostituzione degli infissi esterni ivi presenti, con infissi più moderni ad alta coibentazione e con l allestimento di un impianto di climatizzazione e ventilazione idoneo per la conservazione del materiale librario. Bologna, lì 23 Dicembre 2010 Il biologo Dr. Matteo Montanari 8

9 RISULTATI DELL ANALISI DEL DNA PER IL RICONOSCIMENTO SPECIFICO DI ISOLATI FUNGINI E BATTERICI DOMINANTI Al fine di riconoscere a livello tassonomico specifico alcuni isolati microbici ottenuti dalle analisi colturali effettuate sui campioni aerei e superficiali (vedi relazione precedente), si è ricorso all analisi del DNA. Più specificamente, si è analizzata una porzione del DNA ribosomiale, la regione ITS per i funghi e la 16S per i batteri, le cui sequenze nucleotidiche, date le loro caratteristiche di variabilità interspecifiche, sono utili per il riconoscimento tassonomico. Come già anticipato nelle conclusioni della precedente relazione, l analisi è stata compiuta per confermare la presenza di Aspergillus fumigatus nei campioni aerei e di superficie e per identificare due ceppi batterici dominanti nei prelievi aerei, soprattutto nella prima sala del deposito. METODI Per quanto riguarda i ceppi fungini, la porzione ITS è stata amplificata mediante primers ITS1f e IT4 (White et al., 1990; Gardes e Bruns, 1993). Per i ceppi batterici si è amplificata una porzione del gene 16S del rdna mediante primers 63F e 1387R (Marchesi et al., 1997). Gli amplificati sono stati purificati e sottoposti a sequenziamento presso Macrogen Inc. Europe. Le sequenze ottenute sono state confrontate sul data base GenBank (http// per il riconoscimento tassonomico. RISULTATI: Isolati microbici analizzati Codice Identificazione tramite Identificazione tramite I.S. ID caratteri morfologici allineamento delle sequenze (%) T10F4Z.004 Aspergillus fumigatus KAXYU06W011 Aspergillus fumigatus 100 T10F4Z.005 Aspergillus fumigatus KDBB840A01N Aspergillus fumigatus 99 T10F4Z.006 Aspergillus fumigatus KDBYNXVG01S Aspergillus fumigatus BZAA000 Batterio eterotrofo tipo1 KVAASBHH016 Staphylococcus cohnii BZAA001 Batterio eterotrofo tipo 2a KV8BMVSA011 Micrococcus luteus BZAA002 Batterio eterotrofo tipo 2b KV9EAUK4011 Micrococcus luteus 100 ID: riferimento per il link ai risultati sul sito I risultati completi, comprensivi di sequenza e analisi statistica, ottenuti dalla ricerca sul data base GenBank sono su file allegati (allegato A). I file sono nominati per codice. CONCLUSIONI I risultati confermano la presenza sia a livello aereo, sia superficiale di Aspergillus fumigatus. Sulla potenziale pericolosità di questo organismo si è già detto nella relazione precedente. A tal riguardo si allega anche il documento areobiologia_salute in allegato B. I batteri isolati e analizzati non sono invece considerati patogeni umani e fanno parte della microflora batterica del derma umano. La loro abbondanza indica, al più, una mediocre qualità dell aria. Per informazione relative ai suddetti organismi batterici vedi: Alla luce delle sudette conclusioni, restano dunque validi i suggerimenti elencati nella relazione precedente. 9

10 BIBLIOGRAFIA CITATA Gardes M., Bruns T. D. (1993). ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes -application to the identification of mycorrhizae and rusts. Molecular Ecology, 2, Marchesi J.R., Sato T., Weightman A.J.,1 Martin T.A., Fry J.C., Hiom S.J., Wade W.G. (1998). Design and Evaluation of Useful Bacterium-Specific PCR Primers That Amplify Genes Coding for Bacterial 16S rrna. Applied and Environmental Microbiology, 64, 2, White T.J., Bruns T., Lee S., Taylor J. (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis M.A., Gelfand D.H., Shinsky J.J., White T.J., eds.), Academic Press, San Diego, USA, Bologna, lì 25 Gennaio 2011 Il biologo Dr. Matteo Montanari 10