Folding e misfolding di proteine: concetti generali e applicazioni con tecniche di singola-molecola

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1 Folding e misfolding di proteine: concetti generali e applicazioni con tecniche di singola-molecola Andrea Raspadori raspador@sissa.it

2 Schema generale Concetti generali sulla fisiologia correlata a misfolding di proteine: funzioni fisiologiche, malattie neurodegenerative Concetti generali di folding delle proteine: meccanismi di folding, modello funnel energetico (imbuto), modello zipping eand assembly, folding in vivo, oligomerizzazione e aggregazione Applicazioni di tecniche di singola-molecola: optical-tweezers, singlemolecule FRET Applicazione dell AFM in spettroscopia di forza

3 Misfolding e funzioni patologiche: malattie neurodegenerative Accumulo intra/extracellulare di aggregati Stress ossidativo Malattie neurodegenerative Disomeostasi dei metalli Eccitotossicità

4 La maggior parte delle malattie neurodegenerative conosciute ad oggi condividono un fenomeno in comune: il misfolding di proteine. Patologia proteina tipologia Misfolding = processo stocastico, possibilmente guidato da fattori ambientali (stress ossidativo, funzione fisiolgica) e/o genetici (mutazioni), tale per cui una proteina acquisisce una conformazione più o meno stabile, che precede la formazione di stati aggregati più stabili dello stato nativo di partenza. SNC Parkison α-sinucleina Sporadica, genetica Alzheimer Aβ 1-42 Sporadica, genetica Corea di Hungtinton Malattie prioniche Hungtintina (polyq) PrP C genetica Sporadica, genetica, transmissibile SNP SLA SOD1 Sporadica, genetica Metal binding proteins IDP Proteine classiche

5 Funzioni fisiologiche: prioni di S. cerevisiae Nel 1994 Wickner propose che gli elementi [URE3] ed [PSI + ] di lievito, caratterizzati da una trasmissione di un fenotipo di natura non-mendeliana, fossero in realtà prioni derivanti dalle proteine Ure2 e Sup35. Con questa ipotesi fu possibile dimostrare come: 1. I fenotipi [URE3] e [PSI+] corrispondessero a LOF dei geni Ure2 e Sup35 2. I due fenotipi si ereditavano a livello citoplasmatico (gemmazione) 3. Necessaria la presenza delle due proteine (assenza -> no seeding) 4. Overespressione delle proteine portava alla comparsa dei fenotipi Sup35 - Prd ricombinante da E.coli

6 Contrariamente ai prioni/amiloidi degli organismi più complessi, i prioni di lieviti svolgono apparentemente una importante funzione fisiologica evolutiva: Sup35 Proteina di 233 aa, composta da 3 domini. Il dominio C funge da repressore della traduzione genotipi [PSI+] oltre ad avere un diverso fenotipo, possono contribuire a diversi fenomeni di adattamento a diverse condizioni ambientali Ure2 Proteina di 354 aa, è coinvolta nel metabolismo azotato (repressore catabolismo Gln) regolando GLN3; svolge anche una funzione di risposta allo stress ossidativo genotipi [URE3] compaiono in seguito a condizioni selettive di crescita

7 Esperimento di Anfinsen Ribonucleasi A Saggio attività: idrolisi di acidi nucleici estratti da lievito (Abs 260nm) 1. Denaturata con urea 8M e ridotto i ponti S-S con ME; togliendo in sequenza urea e ME la proteina riguadagnava l attività enzimatica Le informazioni per la struttura nativa sono contenute nella sola sequenza primaria 2. Dentaurata e rimosso solo il ME, la proteina non possedeva attività enzimatica 3. Rimossa l urea ancora non possedeva attività (S-S casuali) 4. Aggiungendo traccie di ME riguadagnava l attività: La proteina tende alla conformazione termodinamicamente più stabile

8 Struttura della mioglobina Nel 1958 fu pubblicata la prima struttura di una proteina (mioglobina) con una risoluzione di 6Å: la caratteristica che colpì maggiormente fu l assenza di una simmetria. Questi dati, insieme agli esperimenti effettuati da Anfinsen portarono a formulare tre domande principali: 1.Come il folding (ripiegamento) 3D è codificato solamente dalla struttura primaria e quindi dalle sue proprietà chimico-fisiche? 2.Qual è il meccanismo di folding? (paradosso di Levinthal) 3.E possibile predire la struttura di una proteina a partire dalla sola sequenza?

9 Come la sequenza e le sue proprietà chimico-fisiche codificano per la struttura terziaria/quaternaria? Le seguenti interazioni constribuiscono a tale scopo: 1. Legami idrogeno: particolarmente importanti fra i gruppi NH e COOH del backbone, sono i principali responsabili del mantenimento delle α-eliche e dei β-strand/sheets 1. Interazioni di Van der Waals: in una proteina foldata molti residui sono tra lor impaccati 2. Angoli preferenziali backbone: come altre macromolecole polimeriche, solo alcuni vincoli spaziali per certi angoli sono concessi. Aluni aminoacidi possono imporre forti vincoli spaziali (prolina) 3. Interazioni elettrostatiche: residui con catene laterali cariche tenderanno ad attrarsi o respingersi 4. Interazioni idrofobiche: in una proteina foldata i residui con catene laterali idrofobiche ( H ) tenderanno a nascondersi dal solvente in regioni interne della proteina stessa mentre quelli polari ( P ) saranno esposti all esterno. Considerando una proteina dotata di entrambe di questi tipi residui, il numero di conformazioni in cui tutti i residui H sono localizzati all interno della struttura sono limitate. 5. Entropia della catena: durante il folding si ha una forte diminuzione dell entropia della catena polipeptidica (il numero di microstati diminuisce dal momento che sono maggiormente vincolati)

10 Nonostante le forze guida, le interazioni che inducono il ripiegamento delle proteine siano note, come effettivamente una proteina si ripieghi nella sua forma nativa ancora non è completamente chiaro. Nel 1968, Cyrsu Levinthal espose un paradosso circa il problema: Ipotizzando che un legame peptidico possa assumere 3 diverse conformazioni Una proteina di 101 aminoacidi ha 100 legami peptidici (N-1) = 5 x conformazioni Ipotizzando che la proteina cerchi casualmente la conformazione corretta e che sia in grado di esplorare conformazioni ogni secondo, il tempo stimato per trovare la conformazione nativa sarebbe anni! La situazione di complica ulteriormente se si considera la presenza di diversi ponti disolfuro in alcune proteine Alcune proteine impiegano pochi microsecondi per foldarsi, il che suggerisce che la ricerca non può essere completamente casuale. Possibile la presenza di intermedi durante il processo di folding che guidano in maniera più guidata la molecola verso lo stato a bassa energia libera

11 Panorama energetico e modello Entropia funnel Il modello a imbuto (funnel) è il modello più comunemente usato per indicare il panorama energetico di una proteina; esso può essere molto diverso a seconda della proteina presa in questione. Esso è derivato sa una serie di osservazioni sperimentali, supportate da simulazioni in silico: 1. lo stato nativo è quello situato a più bassa energia (oppure meno la struttura è stabile, maggiore è l entropia); 2. Gli stati a più bassa energia sono minori rispetto a quelli ad alta energia 3. Inoltre più l energia diminuisce, più rapida è la caduta nel minimo di energia 4. Esistono diverse strade per giungere alla struttura nativa, ognuna sarà diversamente popolata 5. A seconda delle condizioni di folding (ph, forza ionica, ecc ) una strada sarà preferita maggiormente di un altra F(φ,ψ,X) Coordinata di reazione Dove φ,ψ sono i gradi di libertà intramolecolari e X l effetto del solvente

12 Contrariamente ai modelli macroscopici (a) che tentano di spiegare il percorso di folding in diversi macrostati, il modello a imbuto (b) prova a mostrare come diversi percorsi siano possibili: alcuni sono preceduti sempre da un preciso stato (in serie) per es BDE; citocromo, lisozima T4 altri invece possono essere preceduti da diversi stati (in parallelo) per es BCD; citocromo C, lisozima HEW Reazione chimica Transizione biologica D -> I -> N X -> D -> N

13 Il modello a imbuto è in grado di spiegare il comportamento anomalo di alcune proteine (ultrafast folders), ossia il riscaldamento rallenta il processo di folding contrariamente a proteine comuni. Questo fenomeno deriva dal fatto che l imbuto è molto stretto in fase discendente ma ha una superficie maggiore (maggior numero di conformazioni) ad alta energia: la proteina deve quindi perder più tempo a cercare la conformazione corretta di partenza. Il modello inoltre spiega come le alfa eliche siano più rapide a formarsi rispetto ai beta-sheet: le prime infatti possono nucleare da diversi punti della loro lunghezza e quindi un numero maggiore di passaggi paralleli.

14 Modello zipping and assembly Se il modello funnel mostra l eterogeneità del panorama energetico e spiega come sia possibile il folding da un punto di vista termodinamico e cinetico, il modello zipping and assembly (ZAM) spiega come fisicamente avviene il fenomeno di ripiegamento e come eludere il paradosso di Levinthal. Sebbene il processo di ricerca di conformazioni stabili sia stocastico, il modello ZA prevede: a) Step iniziali (pico- nanosecondi): differenti frammenti peptidici della sequenza proteica cercano strutture metastabili (piccoli loop, β-turn e helical turns); la ricerca avviene in parallelo fra diversi frammenti b) Step finali (microsecondi): le strutture che erano sufficientemente stabili dello step precedente crescono ( zipping ) fino a strutture sepre più grandi e stabili; alla fine i vari domini si associeranno tra loro Il modello ZA si basa sul modello funnel, quindi diversi percorsi possono essere presenti per giungere alla struttura nativa

15 Folding in vivo e misfolding Sebbene il processo di folding sia altamente favorito, spesso le proteine possono cadere in conformazioni (misfolding) prone all aggregazione. In laboratorio, per rifoldare una proteina denaturata, solitamente la si diluisce il più possibile (0,1 0,01 mg/ml) per evitare potenziali fenomeni di aggregazione; tuttavia nelle cellule (citoplasma) la concentrazione media di proteine e altre macromolecole è di circa mg/ml. Spesso la catena polipeptidica proteina deve essere completamente prodotta prima di iniziare il processo di folding Ribosoma 50S Canale uscita: 100 x 20Å (40-60 aa) Velocità traduzione: ~15-75 s per 300 aa 100Å Le catene uscenti non sono sufficientemente protette dalle interazioni aspecifiche con altre molecole 20Å E necessaria la presenza di chaperon che indirizzino verso il folding corretto e che controllino la qualità di quelle normalmente presenti nella cellula

16 Chaperon: una proteina (o altre molecole) che interagisce, stabilizza o guida una proteina non-nativa ad acquisire la sua conformazione nativa, ma che non risulterà presente nella struttura funzionale finale. de novo folding Assistenza proteasoma Refolding proteine denaturate stress Assemblaggio oligomeri Trasporto proteine intracellulari Le chaperonine non agiscono modificando l informazione sterica durante il processo di folding, piuttosto ottimizzano l efficienza del processo medesimo!!! Per es le tubuline e l actina pare abbiano un panorama energetico ad alta energia, ricco di diversi intermedi stabili (trappole cinetiche) prima di giungere allo stato nativo: le chaperonine forniscono l energia necessaria o abbassano la barriera energetica richiesta per saltare nello stato a più bassa energia

17 Le chaperon della famiglia Hsp (heat shock protein) sono le più studiate e meglio caratterizzate. Esistono diverse famiglie (40, 60, 70, 90 e 100) a seconda del peso molecolare. Hsp 100 Hsp 100 (funghi) Hsp 40-70: legano ribosoma e catena uscente, in particolare sulle regioni idrofobiche di proteine spesso destinate al citosol Hsp70 o Hsc70: non legano ribosoma ma catena uscente; ATPasi co-traduzionali che levigano il panorama energetico e impediscono contatto interdomini (eucarioti) in concomitanza con una traduzione 5 volte più lenta Hsp100: dissociano in maniera attiva aggregati per successivo refolding/degradazione

18 Per proteine dal folding molto complesso (per es α/β domini o (β/α) 8 TIM barrel) caratterizzate dalla presenza di molte interazioni lungo raggio, chaperonine molto più grandi e complesse sono necessarie come GroEL-ES. La proteina entra nella gabbia (GroEL) dopo aver contattato una patch idrofobica dell anello esterno, in seguito a idrolisi di ATP il tappo (GroES) blocca l uscita e la proteina viene spinta nell anello interno Le subunità dell anello interno di GroEL (7-9) espongono all interno della gabbia un ambiente ricco di cariche positive e pori che consentono l entrata di acqua. Ogni subunità idrolizza in ~1s una molecola di ATP. Una volta idrolizzate tutte le molecole di ATP (~10-15s) la proteina può essere nativa ed esce, altrimenti rimane ancorata a GroES e può ripartire il ciclo

19 Qualora una proteina uscisse dal controllo qualità cellulare allora diversi fenomeni di aggregazione possono aver luogo. In generale si possono distinguere due diversi stati di aggregazione di proteine: Aggregati disordinati 1.Aggregati amorfi: privi di una struttura precisa ma relativamente rapidi a formarsi (da pochi secondi ad alcuni minuti); possono anche includere proteine diverse L aggregazione è un processo irreversibile (rare eccezioni). Il modello più comune per descrivere il fenomeno è quello di Lumry-Eyring: Aggregati ordinati 1.Oligomeri: gli oligomeri sono multipli della proteina singola (2 mer fino a 80mer); la loro dimensione relativamente ridotta e la capacità di creare interazioni aspecifiche li rendono estremamente tossici 2.Fibrille: spesso rappresentano lo stato a più bassa energia; si generano dall assemblaggio fra oligomeri. N I m k a D k m K a << k m, k d k d A

20 Oligomeri e fibrille La formazione di oligomeri (nucleazione) è un processo bifasico: 1. Fase rapida endotermica di formazione di un intermedio (molten-globule), solitamente parzialmente reversibile; spesso questo stato è inteso come il classico stato misfolded 2. Fase lenta esotermica dove avviene la nucleazione In parallelo alla nucleazione, nelle prime fasi di fibrillazione, si hanno altri due fenomeni definiti elongazione in cui più nuclei/oligomeri si assemblano tra loro e un altro definito nucleazione secondaria/ frammentazione in cui i polimeri derivanti dalla prima elongazione si assemblano tra loro ma parallelamente possono dissociarsi E importante ricordare come i meccanismi di formazione di strutture oligomeriche e il loro successivo folding siano fortemente dipendenti dalla concentrazione di monomero libero

21 Ma qual è la struttura di un oligomero o di una fibrilla? Con tecniche di cristallografia a raggi X, in parallelo a dati ottenuti tramite microscopia SEM e AFM si dispone ora di qualche struttura nota. Beta eliche Le caratteristiche generali delle fibrille sono: a) Il monomero ha subito forti riarrangiamenti conformazionali rispetto alla struttura nativa b) Le strutture sono ricche in β-sheets tra loro strettamente impaccati c) La topologia può essere estremamente diversa a seconda della proteina o a volte dalle condizioni di fibrillazione (diversi misfolded states) Beta sandwich d) Interazioni fra i residui idrofobici localizzati all interno della struttura, esattamente come l interazione con il solvente sono essenziali per la stabilità di queste strutture

22 Energy Il misfolding non è altro che un aspetto particolare del panorama energetico totale di una proteina; si tratta di un fenomeno termodinamico essenzialmente raro (pressione evolutiva) e transiente (barriera energetica) Possono esistere più stati misfoldati, i quali possono essere i precursori di diversi minimi energetici strettamente correlati ai fenomeni di aggregazione Unfolded Misfolded states Misfolded n native Misfolded 1 Native Structure Oligomers and amyloids Aggregate 1 Aggregate n Reaction coordinate

23 Direct observation of multiple misfolding pathways in a single prion protein molecule Hao Yu, Xia Liu, Krishna Neupane, Amar Nath Gupta, Angela M. Brigley, Allison Solanki, Iveta Sosova, and Michael T. Woodside PNAS 2012

24 sh SS Hs cys cys SS sh Hs unfolded native misfolded

25 Optical trapping with high forces reveals unexpected behaviors of prion fibrils Jijun Dong, Carlos E Castro, Mary C Boyce, Matthew J Lang & Susan Lindquist Nature Structure and Molecular Biology, 2010

26 - Gnd + Gnd

27 Analysis of the conformational space of the murine PrP: an amyloidogenic protein involved in neurodegenerative disorders. Raspadori Andrea, Daniel Aioanei, Valentina Vignali, Prof. Giampaolo Zuccheri, Prof. Bruno Samorì, Prof. Giuseppe Legname

28 GB1 domain as mechanical fingerprint On the left: GB1 domain structure, from PDB file 2j52. On the right: force-extension curves of (GB1) 8 polyprotein.

29 Monomeric truncated MoPrP: unfolding experiments Force (pn) Buffer Tris 20 mm/ PO 4-20 mm ph 7.0 NaOAc 20 mm ph 5.5 NaOAc 20 mm ph 4.0 Pulling speed Spring constant 2.18 µm/s 0.06 < x < (N/m) F c L Extension (nm) No clear distribution of unfolding events of the native alfa-helical conformer was identified. Possible strong beta-sheet like transient structures?

30 Multiple MoPrP construct: design To study how multiple PrP molecules assemble together to form oligomers we designed a new construct carrying multiple copies of the prion protein Four copies of MoPrP were placed in tandem with head-to-tail topology, and flanked by two GB1 domains; to simplify the purification an His-tag on the C- terminus was added Constructs were synthesized by GenScript and codon were optimized for E.coli heterologous expression GB1 GB1 MoPrP MoPrP MoPrP MoPrP GB1 GB1 HisTag

31 Multiple MoPrP construct: Monomeric MoPrP or MoPrP flanked by GB1 x4 unfolding experiments Buffer Tris 20 mm/ PO 4-20 mm ph 7.4 NaOAc 20 mm ph 5.5 Pulling speed 7.81µm/s; 2.18 µm/s; 500 nm/s Spring constant 0.06 < x < (N/m) Hump type Peak type MoPrP TR x4 ph 7.4 MoPrP TR x4 ph 5.5

32 Multiple MoPrP construct: unfolding experiments GB1 cl= 18 ± 2.5 nm therefore every peak longer than 30 nm is very unlikely related to a GB1 unfolding event. Considering also that TR x4 is 150 nm long, the peaks cannot be longer than this lenght. GB1 unfolding PrP peaks MoPrP TR x4 ph 7.4 MoPrP TR x4 ph 5.5

33 Conclusion The monomeric construct showed rarely a strong mechanical behaviour from the PrP molecule, suggesting that a misfolding transition in rare event. In the multimeric construct with simple unfolding experiments we were able to see mechanical signals different from GB1 unfolding events; these signals were very heterogeneous with different lenghts and different forces. In particular: Since the monomer didn t show significant signals (suggesting that its alfa helical structure is not mechanically strong enough), the multimer signals can be associated to beta sheet structures. The lenght of some peaks was 50nm, 70nm or even 110nm long can be associated only to the association of two PrP domains up to four nm nm nm With double-pulse PrP experiments we managed to see again those signals, although the percentage of null curves was increased, suggesting that 50ms maybe is not sufficient for refolding some of the structures.