2. Analisi dei segmenti a. Frammentare le subunità in peptidi

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1 1. Preliminari a. Biochimica delle proteine Prof. M. Bolognesi Denaturazione a.a. 2007/2008 delle proteine b. Riduzione e alchilazione dei ponti disolfuro c. Determinazione delle subunità 2. Analisi dei segmenti a. Frammentare le subunità in peptidi b. Edman degradation 3. Ricostruzione della sequenza a. Allineamento di sequenze b. Assegnazione disolfuri Eloise Mastrangelo

2 Spettrometria di massa Serve a misurare la massa delle molecole. Fornisce la massa molecolare, e anche la formula molecolare La molecola deve essere ionizzata, così da misurare il rapporto massa/carica (m/z) dello ione risultante. Sorgente Analizzatore Detector La sorgente serve a volatilizzare e ionizzare il campione L'analizzatore serve a misurare il rapporto m/z degli ioni prodotti Il detector serve a rivelare gli ioni che arrivano dall'analizzatore

3 I componenti dello spettrometro Sorgente Analizzatore Detector m/z Spettro Computer

4 Sorgente Analizzatore Sorgenti: Analizzatori: Sorgente EI (impatto Analizzatore magnetico elettronico) Analizzatore a quadrupolo Sorgente CI (ionizzazione Analizzatore a trappola chimica) ionica (ion-trap) Sorgente FAB (fast atom Analizzatore TOF (time of bombarment) flight tempo di volo) Sorgente electrospray Sorgente MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization).

5 Meccanismi i di ionizzazzionei i Espulsione di e - : M M +. + e - Protonazione: M + H + MH + Cationizzazione: M + Cat + MCat + Deprotonazione: MH M - + H +

6 ESI-MS (Electron Spray Ionization) Sorgente di ionizzazione che utilizza un gas inerte (di solito azoto) per provocare un processo di nebulizzazione. Questo processo avviene in soluzioni (metanolo e acqua), che vengono poi nebulizzate in una camera a cui è applicato un campo elettrico (ottenuto applicando una differenza di potenziale di 3-4 kv). La nebulizzazione comporta la formazione di piccole goccioline di solvente che contengono delle specie ionizzate ( li i l i i i i h i li l idi i ) Solvente polare e volatile (analita carico: le proteine vengono caricate positivamente mentre zuccheri o oligonucleotidi negativamente). Man mano che il solvente contenuto nelle goccioline evapora, queste si rimpiccioliscono fino a che la repulsione elettrica, aumentata a causa della forte densità elettrica, supera la tensione superficiale della goccia; a questo punto la gocciolina scoppia, creando una corrente di ioni i che vengono indirizzati i verso l analizzatore. li N kv Regione di vuoto intermedio

7 MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) MALDI usa un laser per rompere e ionizzare le molecole del campione che viene fissato ad una matrice chimica (acido picolinico, acido succinico, acido caffeico ecc), su un target 1) Irradiazione mediante laser delle molecole della miscela (matrice - analita). 2) Espulsione di un aggregato di analita solvatato dalle molecole di matrice. 3) Desolvatazione con conseguente trasferimento di un protone (reazione acido-base tra matrice e analita). In genere e e si ha il trasferimento e to di un protone dalla a matrice all analita a a ; nelle e tecniche c e MALDI e FAB il processo di osservazione in modo positivo è quello più frequente. Adatto per proteine. Pesi molecolari fino a 300 KDa

8 FAB (Fast Atom Bombardment) FAB usa un raggio di atomi veloci di Ar o Xe o di ioni i Cs + per rompere e ionizzare i le molecole l del campione che viene disciolto in un solvente poco volatile come il glicerolo. Adatto per peptidi e piccole proteine

9 Questo tipo di spettrometro separa gli ioni in base al tempo necessario per compiere un determinato t percorso. All uscita dal campo elettrico, gli ionii possiedono la stessa energia cinetica, ma una diversa velocità a seconda del rapporto m/z. Lasciandoli correre perciò in una regione libera da campi (un tubo sotto vuoto spinto) essi raggiungeranno g il rivelatore in tempi diversi. Il tempo di volo è proporzionale alla massa/carica.

10 L'analizzatore a quadrupolo consiste in un tubo rettilineo in cui è fatto il vuoto ed in cui sono presenti quattro barre parallele, disposte simmetricamente intorno all'asse del tubo, di sezione circolare oppure iperbolica. Lo ione entra nell'analizzatore l parallelamente l all'asse z, ed è spinto dai campi elettrici continuo e oscillante a seguire una traiettoria a spirale. Può essere considerato una variante dell'analizzatore a quadrupolo. Anzichè permettere agli ioni di attraversare il campo quadrupolare, la trappola ionica trattiene tutti gli ioni al suo interno. Lo spettro di massa è generato variando il potenziale elettrico in modo da espellere in sequenza dalla trappola verso il rivelatore gli ioni secondo un valore m/z crescente.

11 Gli ioni vengono quindi analizzati da metodi come Time of Flight (ToF), trappola ionica e Quadrupolo. Ognuno di questi metodi produce uno spettro di massa dove l asse x rappresenta il range di massa dell analizzatore e l asse y il numero degli ioni individuati. + m ( m + n( H )) Δt = = n( H ) 1 z leucine enkephalin TEST01 32 (1.679) Cm (3:34) 100 Platform II, BMB, The University of Leeds Oct :12:26 Scan ES+ 2.87e5 ESI-MS analysis of leucine enkephalin, YGGFL Calculated l MW Da Measured MW Da MH+ % m/z (M+Na) +

12 Lisozima hen egg lysozyme Platform II, BMB, The University of Leeds LYS01A 1 (1.392) Sm (SG, 2x1.00); Sb (10,10.00 ) 100 A9; A Jan :00:37 Scan ES+ 2.16e6 A: ±0.42 % A A A A A m z Mw+ nh = n m/z n+1 n Assunzione: 2 picchi successivi avranno numeri di ionizzazione successivi Prima si ricava n, poi si ricava Mw

13 Prima della spettrometria di massa bisogna separare le proteine presenti in una miscela complessa utilizzando ad esempio gel bidimensionali o metodi cromatografici. i spot 22 Two-dimensional Coomassie Blue-stained gel of human prostasomes (preparative run)

14 Le proteine intere sono più difficili da analizzare in uno spettrometro di massa, e la misura della massa di una proteina intera dà informazioni limitate. La maggior parte degli approcci in proteomica coinvolgono un processo di frammentazione delle proteine in piccoli pezzi che sono analizzati i per identificare ifi la proteina. Comunemente le proteine vengono digerite con degli enzimi, come la tripsina, in peptidi. I peptidi vengono analizzati per determinare la loro massa. L intero set di masse osservate generalmente appartiene ad una singola proteina. Ma ogni singola massa di un peptide può essere prodotta da differenti proteine. L identificazione delle proteine avviene mediante la combinazione delle masse osservate.

15 Il processo della misura di un set di masse di peptidi da una proteina e il matching contro un database, si chiama peptide mass fingerprinting. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting (PMF) Digestion Trypsin cleavage sites: Arg and Lys K K R R Protein... m3 Peptide mass fingerprinting by MALDI-TOF MS m1 m2 m4 Database searches m/z Da Protein Identification mr exper. mr theor. Diff. Residues Peptide sequence from the database m Da GLFIIDPK m Da EYFEAANK m Da HITINDLPVGR Riadattata da Lamond e Mann, 1997

16 Peptide Fingerprinting spectrum from spot 22 acquired with the ETTAN MALDI-ToF mass spectrometer from Amersham Biosciences (Uppsala, Sweden)

17 2-D separated protein spots Peptide Mass Fingerprinting (PMF) MALDI-TOF ID via Database Searching

18 L approccio più comune di un software è di utilizzare un database proteico e per ogni sequenza proteica calcolare tutti i peptidi che può produrre. Una volta che sono state trovate queste corrispondenze, molti programmi calcolano la probabilità che il match risultante sia o meno un falso-positivo. I programmi che fanno peptide mass fingerprinting sono Mascot, PeptIdent, Profound e Genome Fingerprint Scanning g( (GFS). Ad es. Mascot può fare ricerche basate su PMF, MS/MS o sequenze parziali di aa (sequence Query). Utilizza diversi database (SwissProt, NCBI, MSDB). N.B. non c è alcuna determinazione strutturale diretta della sequenza amminoacidica.

19 L identificazione viene raggiunta soltanto nel caso in cui una sequenza con un PMF corrispondente a quello sperimentalmente ottenuto sia nota. Questo metodo di identificazione è particolarmente efficiente quando il genoma dll dell organismo, e quindi idi le sequenze amminoacidiche delle proteine da esso derivanti, è conosciuto.

20 I dati archiviati nei database biologici riguardano la sequenza primaria delle proteine e i software di confronto tra dati di frammentazione sperimentali e teorici possono tenere conto soltanto di poche possibili modificazioni chimiche degli amminoacidi (h (chenealterano la massa)

21 2-D separated protein spots Peptide Mass Fingerprinting (PMF) MALDI-TOF ID via Database Searching No ID MS/MS ESI-Ion Trap ID via Database Searching

22 Tandem Mass Spectrometry (MS-MS) Utile per sequenziare le proteine Si usa uno spettrometro con più di un analizzatore La proteina viene digerita e i frammenti peptidici sono introdotti nello strumento I peptidi vengono separati nel primo stadio di MS Un pò di peptidi vengono selezionati per una seconda analisi in MS. Questi peptidi pp possono essere selezionati in base alla massa, all intensità del picco o altro Il singolo peptide viene frammentato mediante un processo di bombardamento con atomi, chiamato CID (collision-induced dissotiation). I frammenti sono analizzati b [N]+[M]-H y [C]+[M]+H [N]=molecular mass of neutral N-terminal group [C]= molecular mass of neutral C-ter group [M]= molecular mass of the neutral amino acid residues Gli ioni prodotti dalla rimozione dei residui al C terminale sono chiamati ioni b, quelli rimossi all N terminale ioni y

23 ESI-MS/MS Protein

24 b ions, sequence: ATAVVDGAFK AT A V V D G A F K MS-MS spectrum of peptide m/z from spot 36 corresponding to Peroxiredoxin2 (TSA protein) The spectrum was acquired with LCQDeca mass spectrometer (ThermoFinnigan, SanJose,CA)

25 Peptide mass fingerprinting i i Peptide p fragment ion search Comparazione delle masse dei frammenti generati da un certo peptide per ESI-MS con le masse teoriche dei frammenti generati in silico da tutti i peptidi con la stessa massa presenti in database Peptide sequence tag Sequenza aminoacidica ottenuta dall interpretazione dello spettro ESI-MS/MS di un certo peptide, pp ricerca nei database della proteina che contiene almeno un peptide con quella determinata massa e quella specifica sequenza

26 PMF: identification of conserved proteins MS/MS and db search: identification of conserved peptides in less conserved proteins

27 2-D separated protein spots Peptide Mass Fingerprinting (PMF) MALDI-TOF ID via Database Searching No ID MS/MS ESI-Ion Trap ID via Database Searching No ID De novo sequencing