Diagnostica di laboratorio della tubercolosi: le antiche certezze e le nuove frontiere Il laboratorio di Microbiologia. Paglia Maria Grazia

Transcript

1 Diagnostica di laboratorio della tubercolosi: le antiche certezze e le nuove frontiere Il laboratorio di Microbiologia Paglia Maria Grazia INMI-Lazzaro Spallanzani 26 novembre 2011 Co.Pr. CRI-Roma Roma

2 L analisi fenotipica (caratteri colturali e biochimici) e genotipica (regioni conservate) ci consente di identificare circa 130 specie nel genere Mycobacterium

3 Mycobacterium tuberculosis complex e Micobatteri non tubercolari (MNT)* patogenicità habitat contagiosità sensibilità ai chemioterapici *L acronimo MOTT (Mycobacteria other than tuberculosis) è meno usato

4 Identificazione dei Micobatteri RACCOMANDAZIONI GENERALI Ogni test e procedura relativa deve essere eseguita da personale adeguatamente formato Seguire le Standard Operating Procedures (SOPs) interne Svolgere i test in laboratori equipaggiati Partecipare a Controllo di Qualità nazionale ed internazionale

5 La tubercolosi è causata da Mycobacterium tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. caprae, M. pinnipedii, M. microti e M. canettii) Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium microti causano malattia occasionalmente La diagnosi microbiologica di tubercolosi o di micobatteriosi richiede un campione biologico in cui: rilevare la presenza di micobatteri isolarli ed identificarli determinarne la sensibilità agli antimicobatterici.

6 L attendibilità dei risultati dipende dalle modalità con cui i campioni sono stati raccolti, conservati e trasportati. Il laboratorio deve fornire istruzioni operative per la raccolta, la conservazione e il trasporto dei campioni.

7 Tipo di campione Requisiti Istruzioni speciali Campioni non idonei Aspirato gastrico Broncoaspirato, lavaggio bronco-alveolare, spazzolatura bronchiale, aspirato trans-tracheale Espettorato Espettorato indotto Feci Linfonodo Procedure operative per la raccolta dei campioni biologici (I) 5-10 ml raccolto al mattino, dopo almeno 8 ore di digiuno, per 3 giorni consecutivi 3 ml 5-10 ml raccolto al mattino da espettorazione profonda, per 2-3 giorni consecutivi 5-10 ml raccolto al mattino, per 3 giorni consecutivi almeno 1 g in contenitore senza conservanti linfonodo o porzione di esso in contenitore sterile, senza fissativi o conservanti neutralizzare (ph 7) con carbonato di sodio disinfettare accuratamente il broncoscopio istruire il paziente su come espettorare correttamente specificare chiaramente nella richiesta, e sul contenitore, che si tratta di espettorato indotto per la diagnosi di tubercolosi intestinale ricorrere al prelievo bioptico aggiungere una piccola quantità di fisiologica sterile campioni non neutralizzati saliva; pool di campioni campioni in formalina o altri fissativi; campioni inclusi in paraffina

8 Procedure operative per la raccolta dei campioni biologici (II) Tipo di campione Requisiti Istruzioni speciali Campioni non idonei Liquidi cavitari: pleurico, pericardico, peritoneale ecc. Liquor ml in provetta sterile (con eparina o citrato) ³ 2 ml per la diagnosi di pleurite tubercolare sono più indicati biopsia pleurica ed espettorato indotto Materiale da lesioni cutanee la massima quantità possibile utilizzare tamponi senza terreno di trasporto solo se non è possibile eseguire il prelievo con siringa o biopsia tamponi con terreno di trasporto Materiali necroticoascessuali la quantità massima possibile in siringa con copriago se non è possibile usare la siringa utilizzare più tamponi ed inserirli in un contenitore sterile con una piccola quantità di fisiologica sterile Midollo emopoietico la massima quantità possibile, direttamente nel flacone da emocoltura, o in provetta con eparina, o in provetta Isolator campione coagulato; campione in provetta con EDTA

9 Procedure operative per la raccolta dei campioni biologici (III) Tipo di campione Requisiti Istruzioni speciali Campioni non idonei Prelievi tissutali e biopsie almeno 1 g di tessuto in contenitore senza fissativi o conservanti Sangue mestruale alcuni ml, raccolti al 2-3 giorno del flusso mestruale, in provetta con eparina Sangue periferico direttamente nel flacone da emocoltura, o in provetta con eparina od in provetta Isolator Urine la prima urina del mattino ottenuta anche mediante cateterizzazione (almeno 50 ml) aggiungere una piccola quantità di fisiologica sterile un campione in 3 giorni consecutivi; il mitto intermedio è sconsigliato campioni in formalina o altri fissativi; campioni inclusi in paraffina sangue coagulato sangue coagulato; sangue in provetta con EDTA urine delle 24 ore; urine da sacca; volumi inferiori a 50 ml Conservazione e trasporto dei campioni biologici: conservare il campione a 4 C, non congelare spedire secondo le modalità previste dalla Circolare del Ministero della Sanità N 16 del 20/07/1994.

10 MICROSCOPIA Pos Rapido Poco costoso Specificità > 95% Ottimo test per il controllo della TB in Paesi ad alta incidenza Neg Non permette l identificazione di specie Non fornisce informazioni sulla vitalità dei micobatteri Sensibilità 25-65% Anche dopo tecniche di concentrazione del campione biologico la soglia di positività rimane alta ( batteri/ml) La sensibilità aumenta con il numero dei campioni esaminati 1 diretto AAR 80-82% 2 diretto AAR 10-14% 3 diretto AAR 5-8%

11 Definizione di caso (Microscopia) Secondo OMS (2007): Soggetto con almeno 1 vetrino positivo (1 bacillo è sufficiente) su un totale di due esaminati. Tale definizione è applicabile a Paesi assistiti da un buon sistema di controllo qualità.

12 COLTURA: IL GOLD-STANDARD Pos E il test di riferimento Richiede micobatteri vivi Comporta un aumento dei casi di TB rilevati (30-50%) Diagnosi definitiva di TB Punto di partenza per i saggi di sensibilità ai farmaci Neg Tempi lunghi di risposta (6-8 settimane se negativo) Alto livello di bio-sicurezza: per colture da campione BSL2, per antibiogrammi BSL3

13 Gli attuali standard internazionali raccomandano l uso di due terreni (terreno liquido e terreno solido) per l isolamento dei micobatteri da campioni biologici. Terreni all uovo: Löwenstein-Jensen Contengono uova fresche, fecola di patate, sali e glicerolo, preparati a becco di clarino, in provette con tappo a vite, e fatti solidificare per coagulazione al calore. Contengono come inibitore della flora residente verde di malachite (0,025%). Terreni liquidi: Mycobacterial Growth Indicator Tube (MGIT) Consentono un rilevamento più sensibile e precoce della crescita rispetto ai terreni solidi. Abbreviano sensibilmente i tempi della coltura (15-20 giorni).

14

15 Test Immunocromatografici per l identificazione di M.tuberculosis complex Semplici da eseguire e rapida risposta (15 minuti) Rilevano l antigene MPB64 specifico per TB complex Antigene trattenuto da un anticorpo monoclonale anti-mpb64 Non richiedono strumentazioni particolari Sensibilità del 100% (da coltura)

16 Metodi Molecolari (Nucleic acid Amplification test, NAAT) per la ricerca e l identificazione dei Micobatteri (campione biologico e coltura) Identificazione attraverso test commerciali: - Ibridazione in fase liquida Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test (MTD), Gen-Probe - Ibridazione in fase solida InnoLipa, Innogenetics GenoType Mycobacterium, Hain Diagnostika - PCR Cobas Amplicor, Roche - Strand Displacement Amplification (SDA) BD ProbeTec ET assay (Becton Dickinson) - Real Time Identificazione attraverso test in-house Identificazione attraverso analisi di restrizione (PRA) Identificazione per sequenziamento Tutti i metodi molecolari necessitano di DNA estratto

17

18 PCR real time Vantaggi: Rapidità Ampio range di quantificazione del target Riduzione della contaminazione Alta sensibilità intesa come piu basso limite di detection

19 American Thoracic Society. Am.J.Respir.Crit.Care Med.2000 Campioni di materiale respiratorio con batterioscopico positivo SENSIBILITA 95% SPECIFICITA 98% Campioni di materiale respiratorio con batterioscopico negativo SENSIBILITA 48-53% SPECIFICITA 95%

20 Amplificazione genica, alternativa all esame: Microscopico? Colturale? Vantaggi -Sensibilità superiore -Specificità di specie Svantaggi -Esecuzione complessa -Costo elevato Vantaggi -Molto più rapida -Positiva rende superflua l identificazione -Contaminazione indipendente Svantaggi -Non altrettanto sensibile -Non rivela i MNT -False negatività/positività -Costo elevato/esecuzione complessa -Non DST

21 M. tuberculosis: le resistenze Dovute esclusivamente a mutazioni cromosomiche Mutazioni responsabili di resistenze si verificano spontaneamente con frequenza variabile, a seconda dei farmaci, fra 1/10 6 e 1/10 8 La resistenza è il risultato della selezione dei mutanti resistenti, a seguito di mono-terapie o per difetto di compliance L uso di almeno due farmaci abbassa la probabilità di comparsa di resistenze a livelli inferiori al numero di bacilli normalmente presenti in una singola lesione ( UFC) Una resistenza si definisce primaria quando è già presente nel ceppo responsabile dell infezione Una resistenza si definisce secondaria quando insorge durante la terapia

22 Un ceppo di M. tuberculosis viene comunemente definito multidrug-resistant (MDR) quando è resistente ad almeno isoniazide e rifampicina Un ceppo di M. tuberculosis viene definito XDR (extensively drug-resistant) quando è resistente ad isoniazide e rifampicina + un fluorochinolone ed almeno un farmaco di seconda linea iniettabile

23 Metodi fenotipici: valutazione della crescita in coltura in terreni con e senza farmaco Bilancio costo-efficacia buono Facili da eseguire ma poco standardizzabili Risultati disponibili in settimane/mesi Metodi molecolari: (identificazione delle mutazioni responsabili di resistenza) Generalmente costosi Non richiedono ceppi vivi Disponibilità di risultati entro ore Più complicati da eseguire, e con relativamente pochi farmaci testabili

24

25

26 LINE PROBE ASSAY (LIPA) TEST DI IBRIDAZIONE INVERSA su un supporto di nitrocellulosa sono immobilizzati oligo-probes una miscela di primers marcati con biotina amplificano target di DNA l ibridazione tra amplificato e probe è evidenziato da un segnale visibile Vengono identificate le più comuni mutazioni che conferiscono resistenza a farmaci di I e II linea Permette di definire casi di MDR ed XDR Semplice da eseguire MA Numero limitato di sonde Possibilità di errore nell interpretazione Richiesto laboratorio BSL2

27 Genotype MTBDRplus (Hain Lifescience) farmaci I LINEA (rifampicina, isoniazide)

28 Genotype MTBDRsl (Hain Lifescience) farmaci II LINEA (fluorochinolonici, kana/amikacina, etambutolo)

29 Gene-Xpert System (Cepheid) Real-Time PCR per la diagnosi di M. tuberculosis complex e sensibilità alla rifampicina Resistenza alla Rifampicina = gold target Key-drug per il regime di trattamento la resistenza alla RIF è il marcatore surrogato per TB-MDR, 80-95% of ceppi RIF-resistenti sono anche INH-resistenti le mutazioni sono concentrate in una regione di 81 paia di basi hotspot del gene rpob Candidato ottimale per la diagnosi molecolare di resistenza al farmaco

30 Closed reaction tube Use proprietary dried reagent technology Utilize dedicated of cartridges Proprietary filter capture/lysis technology, purification resins, integrated ultrasonics Total internal control of reagent system Automated data reduction and results interpretation sputum and other samples simple 1-step external sample prep. procedure time-to-result < 2 h no need for biosafety cabinet integrated controls specific for MTB sensitivity similar to culture detection of rif-resistance via rpob gene ~1 day technician training for nonmycobacteriologists

31 GeneXpert system Automated sample processor and quantitative thermal cycler Single-use, disposable cartridges

32 Boheme at al, NJM 2010

33 Xpert MTB Quality Controls Sample-processing processing control (SPC) Ensures the sample was correctly processed. Internal control (IC) Verifies the performance of the PCR reagents and assesses the presence of sample inhibitors. SPC and IC should be positive in a negative sample and can be negative in a high-positive sample. Probe check Before the start of the PCR reaction System measures the fluorescence signal from the probes to monitor bead re-hydration, reaction-tube filling, probe integrity and dye stability.

34 Xpert MTB/RIF Analytical Studies Analytical Sensitivity of approximately approx 150 cfu/ml (Smear 10,000 cfu/ml) Specificity tested with high concentrations of MOTT (Mycobacteria Other ThanTuberculosis) No evidence of amplicon cross-contamination Perfect score on QCMD TB Proficiency Panel Mutation detection capability confirmed with isolate DNA and artificial targets having a global frequency reported at > 0.005

35 Recommended use of Xpert MTB/RIF The Xpert MTB/RIF Assay is intended for rapid detection of M. tuberculosis complex and rifampicin resistance in adult patients in respiratory specimens with clinical suspicion of tuberculosis The assay can be use on smear-positive and smear-negative samples The assay is a semi-quantitative in-vitro diagnostic test The Xpert MTB/RIF assay is not intended for use in treatment monitoring

36 Amplification plot TB positive/rif sensitive Amplification plot TB not detected

37 Xpert MTB/RIF Identificazione di M. tuberculosis complex (A) e sensibilità alla Rifampicina (B) in campioni respiratori A Colture positive Colture negative B Colture positive Colture negative Xpert MTB presente 22 2 Xpert RIF sensibile 18 2 Xpert MTB assente 0 5 Xpert RIF resistente 4 0 Identificazione di M. tuberculosis complex (A) e sensibilità alla Rifampicina (B) in campioni non respiratori A Colture positive Colture negative B Colture positive Colture negative Xpert MTB presente 2 2 Xpert RIF sensibile 2 2 Xpert MTB assente 0 3 Xpert RIF resistente 0 0

38 Identificazione di M. tuberculosis complex (A) e sensibilitàalla Rifampicina (B) di colture in terreno solido LJ (7 campioni) e liquido MGIT (5 campioni) A Colture positive Colture negative B Colture positive Colture negative Xpert MTB presente 11 0 Xpert RIF sensibile 11 0 Xpert MTB assente 1 0 Xpert RIF resistente 0 0

39 AnyplexTM plus MTB/NTM Detection (Seegene) AnyplexTM plus MDR-TB Detection (Seegene) Real-time detection of MTB, NTM and DR-TB (DR-TB; INH-R, RIF-R) Simultaneous screening of 6 mutation sites (INH-R) and 15 mutation sites (RIF-R) Various specimen (Sputum, Culture, Fresh tissue)

40