PROCEDURA AUTOMATIZZATA DEL ROBOT MAGNA PURE LC ROCHE PER ESTRAZIONE DI ACIDO NUCLEICO

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1 METODO NAZIONALE STDARD PROCEDURA AUTOMATIZZATA DEL ROBOT MAGNA PURE LC ROCHE PER ESTRAZIONE DI ACIDO NUCLEICO VSOP 36 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections PROCEDURA AUTOMATIZZATA DEL ROBOT MAGNA PURE LC ROCHE PER ESTRAZIONE ACIDO NUCLEICO Revisione no: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina no: 1 di 17 VSOP 36i2

2 STATO DEI METODI NAZIONALI STDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS), algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite all indirizzo standards@hpa.org.uk. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo standards@hpa.org.uk. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2006). Operation of the Roche MagNA Pure LC automated nucleic acid extraction robot. National Standard Method VSOP 36 Emissione 2. Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 2 di 17

3 INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STDARD... 2 INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA... 4 SCOPO DEL DOCUMENTO... 5 INTRODUZIONE CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA PRELIEVO DEL CAMPIONE TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE PROCEDURA SUL CAMPIONE RACCOLTA DEL CAMPIONE TEMPO OTTIMALE PER IL PRELIEVO DEL CAMPIONE TIPO DI CAMPIONE E METODO APPROPRIATO DI PRELIEVO QUTITA E NUMERO APPROPRIATO DI CAMPIONI TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA ALITICA ACCORGIMENTI PARTICOLARI PER RIDURRE IL DETERIORAMENTO STUMENTAZIONE E REAGENTI STRUMENTO REAGENTI PROCERDURE PROVA DI SELEZIONE COLTURE E RICERCHE IDENTIFICAZIONE ASSICURAZIONE DI QUALITA LIMITI REFERTAZIONE DEI RISULTATI REFERTI TEMPO DI REFERTAZIONE SEGNALAZIONE ALLA HPA (LOCALE E SERVIZI REGIONALI ED AL CDSC CENTER FOR INFECTIONS) RINGRAZIAMENTI E CONTATTI ALLEGATO 1: PRE-TRATTAMENTO DEI CAMPIONI CLINICI ALLEGATO 2: RIASSUNTO DELLE RACCOMDAZIONI DELLE VALUTAZIONI ALLEGATO 3: CONSERVAZIONE DEGLI ESTRATTI BIBLIOGRAFIA Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 3 di 17

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato VSOP 36 Procedura automatizzata del robot Magna NA Pure LC Roche per estrazione degli acidi nucleici Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio. Modifica Numero/ Data 2/ Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. Pagina Sessione(i) interessate Modifica Procedura Revisionata ed aggiornata Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 4 di 17

5 PROCEDURA AUTOMATIZZATA DEL ROBOT MAGNA PURE LC ROCHE PER ESTRAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI Tipi di campione: Sangue Siero Plasma Tessuto Le procedure e le confezioni commerciali utilizzate per l estrazione dipendono dalla tipologia dei campioni clinici e dall acido nucleico da estrarre. Per alcuni campioni clinici può essere richiesto un pre-trattamento. SCOPO DEL DOCUMENTO Questa POS descrive la procedura automatizzata del robot MagNa Pure LC Roche per l estrazione degli acidi nucleici. INTRODUZIONE Generalità Il MagNa Pure LC Roche è uno strumento in grado di eseguire in modo automatizzato l estrazione degli acidi nucleici e la preparazione della reazione polimerasica a catena (PCR, polymerase chain reaction). L estrazione si avvale di una tecnologia consolidata con biglie magnetiche che consente di ottenere acidi nucleici di elevata qualità, privi di contaminazione crociata. Per l isolamento del DNA e del RNA sono utilizzate particolari particelle di vetro magnetizzate. L isolamento del mrna è eseguito con particelle magnetizzate rivestite con oligo-(dt) marcati con biotina e streptavidina. Lo strumento può processare in circa un ora fino a 32 campioni per seduta analitica, richiedendo un limitato tempo di preparazione. Tutti i reattivi richiesti sono pronti all uso e sono forniti come confezioni MagNA Pure LC per l isolamento dell acido nucleico con protocolli presenti nel sistema gestionale. Le confezioni consentono di processare diversi tipi di campioni inclusi sangue, siero, plasma e tessuto. Il rischio di contaminazione è minimo perché sono state eliminate filtrazione, centrifugazione e qualsiasi altra operazione manuale, e pure pompe a vuoto o condutture. Lo strumento può essere pulito con DNA Zap TM (sono in fase di studio presso la Roche reagenti anti nucleasi alternativi) e decontaminato con lampada UV incorporata. I reagenti sono inseriti in vaschette a perdere prive di nucleasi ed i campioni sono caricati in cartucce dedicate. La sequenza dei campioni ed altri dettagli del lotto sono inseriti in una tabella predefinita nella schermata sample order. I volumi dei reagenti ed il numero dei puntali richiesti per seduta sono calcolati dal sistema gestionale e le operazioni manuali sono puntualmente controllate e verificate dal programma. Tutte le fasi successive sono eseguite in modo automatico con puntali monouso privi di nucleasi, specificamente progettati per: trasferimento dei campioni, provette di reazione per la separazione degli acidi nucleici con biglie magnetizzate, fasi di lavaggio, eluizione degli acidi nucleici dalle biglie magnetizzate all interno di una cartuccia porta campione raffreddata. I puntali utilizzati per le reazioni sono automaticamente scartati in un raccoglitore di rifiuti da autoclavare ed alla fine di ogni seduta analitica il liquido è trasferito in un apposito contenitore. Lo strumento è stato progettato per compiere una procedura di estrazione continua e per la preparazione della PCR e della real time PCR, interfacciandosi al Roche LightCycler TM, sul quale si possono predisporre direttamente le miscele di reazione della PCR nei capillari predisposti nel carosello del LightCycler TM. E particolarmente versatile per altri strumenti per PCR o per procedure successive all estrazione e può essere completamente adattato dall utilizzatore per la preparazione della maggior parte delle PCR in provetta o in piastre a 96 pozzetti. La scelta della confezione per l estrazione dipende dal microrganismo, dal tipo di campione e dal processo che segue l estrazione. Fare riferimento, per eventuali consigli, alle Note Guida del Magna Pure LC ed alle Valutazioni Finali. Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 5 di 17

6 1.0 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA PRELIEVO DEL CAMPIONE Appropriati contrassegni di rischio in accordo con le direttive locali. 1.2 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE E essenziale l adeguamento alle regolamentazioni attuali della posta e del trasporto. 1.3 PROCEDURA SUL CAMPIONE Fare riferimento alle attuali linee guida per il gruppo(i) a Rischio dei potenziali patogeni che possono essere presenti in ogni campione Fare riferimento alle linee guida attuali sulla manipolazione sicura dei microrganismi patogeni Non toccare la superficie dei blocchi termici per il rischio di una probabile ustione immediata Manipolazione chimica Quando si utilizza il DNA Zap TM calzare guanti di nitrile, occhiali di sicurezza e manipolare sotto cappa chimica. I rifiuti delle miscele di cloridrato di guanidio/etanolo del MagNA Pure devono essere raccolti in contenitori contrassegnati e conservati in condizioni di sicurezza per l allontanamento dei rifiuti. Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con la valutazione del rischio. 2 RACCOLTA DEL CAMPIONE 2.1 TEMPO OTTIMALE PER IL PRELIEVO DEL CAMPIONE I campioni devono essere prelevati secondo le normali procedure di laboratorio 2.2 TIPO DI CAMPIONE E METODO APPROPRIATO DI PRELIEVO ND 2.3 QUTITA E NUMERO APPROPRIATO DI CAMPIONI ND 3 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE 3.1 TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA ALITICA ND 3.2 ACCORGIMENTI PARTICOLARI PER RIDURRE IL DETERIORAMENTO Devono essere inviati campioni appropriati in terreno di trasporto. Se la procedura è ritardata, i campioni devono essere refrigerati o conservati a -70 C se il ritardo è superiore a 24 ore. Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 6 di 17

7 4 STRUMENTO E REAGENTI 4.1 STRUMENTO Sistema MagNA Pure LC Roche Supporto per reattivi MagNA Pure LC Roche Blocco di raffreddamento Pinze Plastiche Roche per MagNA Pure LC Small reagent tubs Medium reagent tubs (20) per protocolli di confezioni che richiedono fino a 20 ml di reagente Medium reagent tubs (30), per protocolli di confezioni che richiedono fino a 30 ml di reagente e procedure per estrazione di grandi volumi Large reagent tubs Small, medium, large tub lids Tub lid seals/dropcatchers Large reaction filter tips Small reaction filter tips Sample cartridges Cartridge seals Processing cartridges Tips stands Waste bottle and lids Waste bag Laboratorio Pipette e puntali con filtro per volumi da 50 µl a 100 µl Bidone per gli scarti, rifiuti Cappa chimica 4.2 REAGENTI Confezioni Roche per Magna Pure Confezione MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit, e Lysis Binding Buffer Refill Confezione MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Large Volume Isolation Confezione I MagNa Pure LC DNA Isolation Confezione II MagNa Pure LC DNA Isolation Confezione III MagNa Pure LC DNA Isolation Confezione I MagNa Pure LC RNA Isolation Confezione II MagNa Pure LC RNA Isolation Confezione I MagNa Pure LC mrna Isolation Confezione II MagNa Pure LC mrna Isolation, e RNA Isolation Tissue Lysis Binding Buffer Refill, ecc Poiché questa lista si modifica di volta in volta, si consiglia di consultare sul sito web della Roche il listino completo delle confezioni disponibili per il MagNA Pure Laboratorio DNA Zap TM *Reagenti anti-nucleasi alternativi sono in fase di studio presso la Roche Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 7 di 17

8 5 PROCEDURE 5.1 PROVA DI SELEZIONE ND 5.2 COLTURA E RICERCA PRIMA SEDUTA ALITICA DEL GIORNO Accendere il robot MagNA Pure LC premendo l interruttore nero nell angolo posteriore sulla parte sinistra dello strumento. Accendere il computer per lanciare Window NT. Premere Ctrl Alt Delete per accedere al programma del MagNa Pure LC tramite il sistema di controllo. Premere su Change Dropcatcher. Questo comando fa muovere il braccio robotico dalla posizione di riposo dalla parte posteriore del lato destro alla posizione centrale della parte anteriore dello strumento. Aprire il robot inserendo saldamente le due mani sulla maniglia della porta, e sollevare il coperchio. Preparare il DNA Zap TM per la pulizia del MagNA Pure LC e dell area circostante. Solo per ambienti contenenti cappe chimiche o maschere antigas: Eseguire questa procedura sotto cappa chimica, o indossare una maschera antigas; calzare guanti di nitrile ed occhiali di protezione. Attivare il DNA Zap TM spruzzando lo spray DNA Zap 1 per 5 volte su una garza priva di tessuto. Spruzzare un uguale volume di DNA Zap 2 sopra il DNA Zap 1. Accertarsi che la garza sia inumidita con la preparazione DNA Zap TM. Non spruzzare mai direttamente lo spray DNA Zap TM sullo strumento MagNA Pure LC. Se non si dispone di una cappa chimica o di una maschera antigas, non spruzzare nessuno dei due reagenti spray DNA Zap TM : Versare un volume di DNA Zap 1 su una garza priva di tessuto e poi un uguale volume di DNA Zap 2. Accertarsi che la garza si sia inumidita con la preparazione DNA Zap TM. Utilizzare il Zap TM per pulire la piastra magnetica, ponendo particolare attenzione alle scanalature. Posizionare un dropcatcher sul magnete. Se richiesto, possono essere inserite nel catturagocce un paio di pinze smussate pulite con DNA Zap TM. Applicare una piccola quantità di lubrificante sugli O-ring. Mentre il braccio robotico è nella parte anteriore, preparare più garze con il DNA Zap TM. Pulire la parte interna del pavimento, includendo l area lasciata libera dal braccio robotizzato, quella per l eluizione, conservazione dell eluato e post eluizione. Scartare le garze nel recipiente dei rifiuti clinici. Selezionare Home, per consentire al braccio robotico di tornare alla posizione di riposo in alto sul lato destro. Preparare una quantità di DNA Zap TM maggiore, come prima indicato, e strofinare il pavimento dell area di lavoro dello strumento includendo la parte lasciata libera dal braccio robotizzato, l area di lavoro e la parte posteriore. Scartare le garze nel recipiente dei rifiuti clinici. Preparare una quantità di DNA Zap TM maggiore, come prima indicato, e strofinare l area blu e quella gialla dei porta puntali. Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 8 di 17

9 Scartare le garze nel recipiente dei rifiuti clinici. Preparare una quantità di DNA Zap TM maggiore, come prima indicato, e strofinare l area che ospita il vassoio dei reagenti ed i campioni. Scartare le garze nel recipiente dei rifiuti clinici. Preparare una quantità di DNA Zap TM maggiore, come prima indicato, e detergere l area circostante il Robot MagNA Pure LC. Scartare le garze nel recipiente dei rifiuti clinici. Predisporre un sacchetto di plastica per i rifiuti al termine dello scivolo di uscita assicurandolo con il magnete. Le guarnizioni O sulle testate degli 8 canali di trasferimento devono essere cambiate almeno una volta il mese o più frequentemente in funzione dell utilizzo. Eseguire la procedura per la tenuta dei puntali almeno una volta il mese per evitare potenziali problemi di contaminazione PROCEDURA DI AVVIAMENTO Preparare la proteasi K da utilizzare secondo le indicazioni della confezione. Se i reagenti sono pronti all uso prelevarli dalla conservazione a +4 C e, prima dell utilizzo, lasciarli stazionare a temperatura ambiente in modo che si possano sciogliere i cristalli formati in precedenza. Premere su Sample Ordering per preparare la lista di lavoro della seduta, ordinare la strategia di estrazione, i campioni ed i volumi di eluizione. Seguire le istruzioni del robot MagNa Pure LC per la scelta della confezione di estrazione. Selezionare Sample Protocol, e dal Sample Protocol Menu evidenziato, selezionare il protocollo appropriato per l estrazione della seduta analitica. Selezionare un appropriato volume di campione per la seduta analitica (volume di eluizione determinato a 100 µl se non è stato selezionato Variable Elution Protocol). Inserire il numero di lotto della confezione utilizzata e la data di scadenza. Inserire manualmente il campione nella lista di lavoro, o tramite lettore di codice a barre posizionato sul lato destro del computer. Inserire nel campo Sample Name il nome del campione corrispondente o tipizzarlo con un codice predefinito premendo in seguito return oppure utilizzare il lettore del codice a barre presente sul campione premendo poi return. La lista di lavoro dei campioni può essere salvata premendo Save Sample Order. Quando i campioni sono aggiunti alla lista di lavoro, i pozzetti del Sample Cartridge Graphic, posti in alto a destra dello schermo, mutano di colore da verde a giallo. Premere su Liquid Waste Discard per attivare il dispositivo di lavaggio al termine della seduta. Al termine, selezionare Start Batch. Il menu Start Batch selezionerà categoria, quantità e posizione dei dispositivi di plastica, vaschette contenenti reagenti e campioni, secondo le indicazioni inserite relative alla dimensione del lotto da analizzare ed al protocollo di purificazione. Selezionare l icona che rappresenta i dispositivi di plastica, contenitori dei reagenti e campioni, secondo la loro disposizione; ciò include l inserimento del sacco dei rifiuti per i puntali utilizzati (rifiuti solidi) e il sigillo per coperchio della vaschetta sul dispositivo catturagocce. (Se richiesto, è possibile stampare la schermata). Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 9 di 17

10 Verificare che le spie delle due aree di raffreddamento ed il blocco dell area di riscaldamento siano verdi, e che la condizione di stato segnali PASS (la procedura non parte se non quando la temperatura di raffreddamento nelle aree 1 e 2 non è a +4 C ed il blocco di riscaldamento per il processo di eluizione non è a +80 C). Il tasto OK comparirà sullo Start Information Screen quando tutti i pulsanti sono stati selezionati. Verificare che non siano presenti i sigilli per coperchio sulle vaschette dei reagenti e che il Dispo Lockbar sia abbassato. Selezionare activate, e chiudere la porta. Selezionare il tasto OK. La procedura avrà inizio. E possibile interrompere manualmente la seduta analitica selezionando il tasto Stop Batch. Non sarà più possibile proseguire la seduta dopo aver selezionato questo comando. Valutazione dell Esito dell Estrazione sullo Schermo dei Risultati: Al termine della seduta i risultati compaiono automaticamente sullo schermo. Il risultato compare accanto ad ogni campione e può essere presentato come: Pass (verde), indica un estrazione corretta o Fail (rosso) segnala un errore verificatosi durante la procedura. Gli errori sono codificati con numeri e possono essere verificati/stampati premendo il tasto Print Error. Selezionare Print Results per stampare i risultati presenti sullo schermo. Salvare i risultati selezionando Save Results. Selezionare Close per tornare al menu principale. Lo strumento si apre. Aprire lo strumento e rimuovere l acido nucleico estratto. Conservare i reagenti non utilizzati a +4 C. La soluzione di proteasi K può essere conservata a +4 C per 30 giorni ed a -20 C per 12 mesi. Rimuovere i dispositivi di plastica da scartare FINE DELLE PROCEDURE GIORNALIERE Verificare che tutti i rifiuti dei dispositivi di plastica/reagenti siano stati rimossi dallo strumento, incluso il dropcatcher ed il flacone dei liquidi di rifiuto. Selezionare Change DropCatcher. Questo comando induce il movimento del braccio robotizzato dalla posizione di stazionamento nella parte posteriore del lato destro, ad una centrale, sulla parte anteriore dello strumento. Rimuovere il dropcatcher. Preparare alcune garze con DNA Zap TM come prima indicato, e pulire la piastra magnetica, ponendo una particolare attenzione alle scanalature. Per prestazioni analitiche consistenti, vuotare il flacone dei rifiuti nel contenitore per rifiuti tossici opportunamente contrassegnato, e scartare il flacone nel bidone per rifiuti. Per quantità ridotte, nel caso in cui il flacone dei rifiuti non sia riempito quotidianamente, verificare che sia presente un volume sufficiente per i liquidi di scarto, in caso contrario sostituirlo. Detergere qualsiasi versamento dal flacone dei rifiuti con DNA Zap TM. Detergere l interno del Tip Slide con DNA Zap TM per rimuovere la contaminazione dai puntali scartati. Chiudere il MagNA Pure LC e selezionare il tasto Lock Door. Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 10 di 17

11 Sul menu principale, selezionare il tasto Decontamination. Lasciare agire la decontaminazione almeno 12 ore. Premere Activate, tasto Start Decontamination per iniziare la decontaminazione UV. Verificare che la luce UV sia visibile PROCEDURE SETTIMALI Devono essere eseguite esclusivamente da personale addestrato. Spegnere lo strumento. Pulire tutte le superfici interne con DNA Zap TM. Muovere il braccio robotizzato in modo che possano essere pulite tutte le superfici. Registrare la data della procedura sul modulo dello strumento. Immergere l imbuto dello scarico in candeggina 5 ppm PROCEDURE MENSILI Devono essere eseguite esclusivamente da personale addestrato. Cambiare le guarnizioni O dello strumento. Eseguire il Leak Test. Registrare sul modulo dello strumento la data della procedura, indicando il risultato della prova. Se la verifica fallisce, ripetere. Se fallisce di nuovo, cambiare le guarnizioni O e ripetere la prova. Se si verifica un ulteriore inadeguatezza, porre un avviso sullo strumento spiegando l impossibilità all uso, avvisare gli utilizzatori registrati nello strumento e contattare la Roche. 5.3 IDENTIFICAZIONE ND 6 ASSICURAZIONE DI QUALITA Deve essere istituito un sistema di qualità per assicurare il mantenimento di un appropriata qualità interna ed esterna ed il controllo delle procedure della qualità E essenziale che i laboratori dispongano della registrazione di un adeguata validazione dei metodi, degli strumenti e delle procedure analitiche commerciali e proprie che evidenzi l idoneità allo scopo LIMITI L esito favorevole dell estrazione e del rilevamento degli acidi nucleici richiede che prelievo, trasporto, conservazione e procedura analitica del campione sono stati adeguati come pure la disponibilità di sufficiente/appropriata documentazione clinica. La procedura di questo documento ha lo scopo di descrivere un buon metodo microbiologico standardizzato per l estrazione degli acidi nucleici. Possono essere richieste altre procedure ed è indispensabile l interpretazione dei risultati da parte di un gruppo professionale qualificato. Per cortesia, prendere nota che le conoscenze delle malattie infettive cambiano continuamente, e Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 11 di 17

12 nonostante questo Metodo Nazionale Standard sia riveduto regolarmente, potrebbe non includere alcuni patogeni emergenti. 8 PROCEDURE DI REFERTAZIONE 8.1 REFERTI ND 8.2 TEMPO DI REFERTAZIONE ND 9 SEGNALAZIONE ALL HPA 18 (SERVIZI LOCALI O REGIONALI ED AL CDSC CENTER FOR INFECTIONS) ND 10 RINGRAZIAMENTI E CONTATTI Questo Metodo Nazionale Standard è stato proposto e sviluppato dal Virology Working Group on Standards and Quality ( Desideriamo ringraziare Carol Sadler del Virus Reference Department per l importante collaborazione. I numerosi operatori dei laboratori di virologia e le organizzazioni specialistiche che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento, ed infine il Redattore Medico. I National Standard Methods sono emessi dalla Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, Centre for Infections, Health Protection Agency London. Per altre informazioni prendere contatti con: Standards Unit Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections Health Protection Agency Colindale London NW9 5EQ standards@hpa.org.uk Revisione numero: 2 Data di revisione: Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 12 di 17

13 ALLEGATO 1: PRE-TRATTAMENTO DEI CAMPIONI CLINICI Plasma da sangue intero, siero, LCR, liquido da coltura di tessuto: Nessun pre-trattamento richiesto. Urine per CMV, poliomavirus ecc, lavaggio bronchiale, F (Aspirato Naso Faringeo): Cellule pellettate da 1mL di campione. Rimuovere il sopranatante. Risospendere il sedimento in PBS. Feci per norovirus, adenovirus ecc: Pretrattamento con tampone STAR (Roche). Estrarre il sopranatante. Campione Tessuto/Biopsia: Omogeneizzare il tessuto in PBS con miscelazione con vortex e palline di vetro. Estrarre il sopranatante. Coltura Batterica: I campioni sono dapprima lisati con uno speciale Tampone di Lisi Batterica e Proteinasi K. Per inattivare i microrganismi, i campioni sono portati ad ebollizione (95 C per 10 min) prima del loro trasferimento allo Stumento MagNA Pure LC. Lisi Esterna: Può essere richiesta per alcuni campioni/bersaglio quali quelli sospettati per influenza H5. Un riassunto delle recomandazioni sulle valutazioni è specificato nella tabella di seguito riportata. PROCEDURA AUTOMATIZZATA DEL ROBOT MAGNA PURE LC ROCHE PER ESTRAZIONE DI ACIDO NUCLEICO Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina no: 13 di 17 VSOP 36i2

14 ALLEGATO 2: RIASSUNTO DELLE RACCOMDAZIONI DALLE VALUTAZIONI Target CMV Enterovirus EBV Parechovirus (E22, E23) HCV MagNA Pure Kit Input Vol. Output Vol. Tipo di campione 200µL 100µL Sangue EDTA, siero, urina, BAL 200µL 50µL LCR 200µL 50µL Siero 200µL 50µL LCR 200µL 50µL Siero HPV 100µL 50µL Liquido citologico, tessuto & tampone rettale HPV DNA II 90µL 200µL Tessuto HSV 200µL 50µL LCR, biopsia, tamponi NLV STAR+ NA 200µL 100µL Campione fecale VZV 200µL 100µL LCR Mycobacterium tuberculosis DNA II 100µL 100µL Respiratorio, tessuto, LCR, pus Streptococcus pneumoniae 200µL 100µL Sangue EDTA, LCR Streptococcus pneumoniae DNA III 100µL 100µL Effusione pleutica, pus, spot Guthrie Neisseria meningitidis Clostridium perfringens Listeria monocytogenes DNA III 100µL 50µL LCR, sangue EDTA, siero coltura pura coltura pura PROCEDURA AUTOMATIZZATA DEL ROBOT MAGNA PURE LC CROCHE PER ESTRAZIONE DI ACIDO NUCLEICO Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina no: 14 di 17 VSOP 36i2 y

15 Campylobacter species DNA III coltura pura Helicobacter pylori DNA III coltura pura PROCEDURA AUTOMATIZZATA DEL ROBOT MAGNA PURE LC ROCHE PER ESTRAZIONE DI ACIDO NUCLEICO Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina no: 15 di 17 VSOP 36i2

16 ALLAGATO 3: CONSERVAZIONE DEGLI ESTRATTI Gli estratti possono essere conservati nel vassoio parta campione, ricoperti con chiusura a tenuta con film/parafilm o trasferiti in singoli contenitori Temperatura di conservazione: +4 C per utilizzo nello stesso giorno -20 C per conservazione dii breve durata (settimane) Per conservazione prolungata, conservare il DNA da -15 a -25 C -70 C per conservazione protratta (mesi) / conservazione dell'rna Se l'estatto è richiesto per analisi multiple come per un controllo positivo, conservare in piccole aliquote per ridurre ripetti congenlamenti e scongelamenti. PROCEDURA AUTOMATIZZATA DEL ROBOT MAGNA PURE LC ROCHE PER ESTRAZIONE DI ACIDO NUCLEICOT Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina no: 16 di 17 VSOP 36i2

17 REFERENCES 1. Department of Health NHS Executive: The Caldicott Committee. Report on the review of patientidentifiable information. London. December Roche. Molecular Biochemicals MagNA Pure LC Operator's Manual, Version Advisory Committee on Dangerous Pathogens Approved List of Biological Agents. p Public Health Laboratory Service Standing Advisory Committee on Laboratory Safety. Safety Precautions: Notes for Guidance. 4 th ed. London: Public Health Laboratory Service (PHLS); Control of Substances Hazardous to Health Regulations General COSHH. Approved Code of Practice and Guidance, L5. Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. 5 steps to risk assessment: a step by step guide to a safer and healthier workplace, IND (G) 163 (REVL). Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. A guide to risk assessment requirements: common provisions in health and safety law, IND (G) 218 (L). Suffolk: HSE Books; Health Services Advisory Committee. Safety in Health Service Laboratories. Safe working and the prevention of infection in clinical laboratories and similar facilities. 2 nd ed. Suffolk: HSE Books; NHS Estates. Health Building Note 15. Facilities for pathology services. 2nd ed. London: Her Majesty's Stationary Office (HMSO); BS EN 12469: Biotechnology - performance criteria for microbiological safety cabinets. London: British Standards Institution (BSI); BS 5726: Microbiological safety cabinets. Part 2. Recommendations for information to be exchanged between purchaser, vendor and installer and recommendations for installation. London: British Standards Institution (BSI); BS 5726: Microbiological safety cabinets. Part 4. Recommendations for selection, use and maintenance. London: British Standards Institution (BSI); Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The management, design and operation of microbiological containment laboratories. Suffolk: HSE Books; Health Protection Agency. QSOP 27 - Quality assurance in the diagnostic virology and serology laboratory. London: Health Protection Agency; Snell JJS, Brown D F J, Roberts C, editors. Quality Assurance Principles and Practice in the Microbiology Laboratory. London: Public Health Laboratory Service; p Health Protection Agency. QSOP 38 - Good laboratory practice when performing molecular amplification assays. London: Health Protection Agency; Clinical Pathology Accreditation (UK) Ltd. Standards for the Medical Laboratory. Sheffield p PHLS, CDSC. Reporting to the PHLS Communicable Disease Surveillance Centre: a reference for laboratories. May PROCEDURA AUTOMATIZZATA DEL ROBOT MAGNA PURE LC ROCHE PER ESTRAZIONE DI ACIDO NUCLEICO Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina no: 17 di 17 VSOP 36i2