Colture cellulari Modelli in vitro applicati alla nutrizione

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1 Colture cellulari Modelli in vitro applicati alla nutrizione

2 ESEMPI: Valutazione dell attività biologica di fattori coinvolti nella regolazione della proliferazione cellulare e differenziazione cellulare Micronutrienti ed azione protettiva da danno citotossico da micotossine Caratterizzazione dell attività probiotica di ceppi di lattobacilli

3 Retinoidi Famiglia di composti naturali e sintetici con omologia con la vitamina A Modulatori della proliferazione e differenziazione cellulare Pathway intracellulari multipli (IGF-I, TGF-b ) mediati o no da recettori Mammary epithelial cell line BME-UV1 (bovine mammary gland, University of Vermont) Bar: 10 µm

4 BME-UV1: effetto di diversi retinoidi sulla proliferazione cellulare -FBCS + FBCS Cheli et al., 2003

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6 Acido retinoico e u-pa?

7 Acido retinoico e u-pa?

8 Acido retinoico e u-pa?

9 Conclusioni I retinoidi inibiscono la proliferazione delle cellule BME-UV1 L inibizione non è correlata a cambiamenti dell attività ed espressione dell u-pa

10 Iron absorption Antibacterial activity Antiviral activity Regulation IGF system Organ morphogenesis Lactoferrin Anti-inflammatory activity Protease Ribonuclease Immunomodulation Anticarcinogenic activity Protease inhibitory action Transcription factor Prebiotic action (Ward et al., 2005)

11 In vitro models: cell lines Intestinal epithelial cell line Mammary epithelial cell line INT407 (human embryonic intestinal tissue) BME-UV1 (bovine mammary gland, University of Vermont) Bar: 10 µm Bar: 10 µm F. Cheli 8 th ASAS/EAAP International Workshop on the Biology of Lactation in Farm Animals Session 3

12 INT407 % MTT test results without serum 24 h 48 h % ,25 12, Lf, µg/ml 0 6,25 12, Lf, µg/ml % h 0 6,25 12, Lf, µg/ml F. Cheli 8 th ASAS/EAAP International Workshop on the Biology of Lactation in Farm Animals Session 3

13 INT407 MTT test results with serum % h 48 h * * * * 100 * % ,25 12, Lf, µg/ml 0 6,25 12, Lf, µg/ml * P<0.05 % h 0 6,25 12, Lf, µg/ml F. Cheli 8 th ASAS/EAAP International Workshop on the Biology of Lactation in Farm Animals Session 3

14 BME-UV1 MTT test results without serum % h 0 6,25 12, % Lf, µg/ml h b b ab ab a c 0 6,25 12, Lf, µg/ml a,b,c P<0.05 % h a b b b a c 0 6,25 12, Lf, µg/ml F. Cheli 8 th ASAS/EAAP International Workshop on the Biology of Lactation in Farm Animals Session 3

15 BME-UV1 MTT test results with serum % h 0 6,25 12, % Lf, µg/ml h 0 6,25 12, Lf, µg/ml % h 0 6,25 12, Lf, µg/ml F. Cheli 8 th ASAS/EAAP International Workshop on the Biology of Lactation in Farm Animals Session 3

16 Conclusioni Lattoferrina è differentemente coinvolta nella regolazione della crescita di cellule epiteliali di origine intestinale e mammaria Presenza di specifici recettori (Rejman et al., 1992; Talukder et al., 2003; Roiron et al., 1989; Mikogami et al., 1995; Ashida et al., 2004). Interazione con altre molecole di segnale e/o fattori presenti nel medium (Baumrucker, 2005, Baumrucker et al., 2006). Caratteristiche del modello in vitro

17 OCRATOSSINA A Micotossine MECCANISMO D AZIONE: E correlato alla perossidazione lipidica e all inibizione della sintesi proteica competendo con la fenilalanina. L OTA chela gli ioni Fe +3 e il complesso che si forma OTA- Fe +2 reagisce con l ossigeno, producendo l anione superossido. Ipotesi supportata dal fatto che la SOD e la catalasi possono prevenire gli effetti nefrotossici indotti da OTA (De Groene et al., 1996).

18 INTERAZIONE AFLATOSSINA E OCRATOSSINA Abilità di OTA di aumentare l effetto mutagenico di AFB 1 potrebbe essere legato al fatto che entrambe intervengono a livello di sintesi proteica. OTA induce la formazione di radicali liberi genotossici che interagiscono con DNA, RNA e proteine e questo porta all inibizione della loro sintesi.

19 Valutazione della citotossicità indotta da micotossine (Ocratossina A) Valutazione dell effetto protettivo di antiossidanti (αtocoferolo, all-trans retinolo) Produzione di specie reattive all ossigeno (ROS) in seguito a trattamento delle colture con micotossine e dopo trattamento simultaneo con antiossidanti e micotossine

20 OTA: tossicità SK-N-MC MDCK AML-12 LLC-PK1 BME-UV1 LC 50 (ug/ml) 24h 48h > < dl Baldi et al., 2004

21 EFFECTS OF α-tocopherol ON OTA INDUCED CYTOTOXICITY ON BME-UV1 CELL LINE % Inhibition ,3 0, P<0.05 Toc 10-5 Toc 10-9 OTA ΟΤΑ μg/ml (Baldi et al., 2002)

22 MTT test % Inibizione ,25 2, Linea cellulare: MDCK Micotossina: OTA Antiossidante: all-trans retinolo 10-5 M + OTA 10-9 M + OTA OTA t incubazione: 48 h OTA µg/ml P<0.05

23 Baldi et al., 2004

24 Baldi et al., 2004

25 Produzione delle sostanze reattive all ossigeno (ROS) in presenza di differenti concentrazioni di OTA effetto dose-dipendente in tutte le linee testate La linea cellulare AML-12 non mostra sensibilità al trattamento con OTA, nella valutazione del danno ossidativo Nella linea BME-UV1 la produzione di ROS risulta essere particolarmente elevata rispetto a tutte le altre linee testate Sia l all-trans retinolo sia l a-tocoferolo sono in grado di proteggere le cellule delle linee BME-UV1 e MDCK dai danni ossidativi, indotti da OTA, con un effetto dosedipendente

26 Caratterizzazione dell attività probiotica: Test di adesione in vitro Test di resistenza al succo gastrico ed alla bile Determinazione degli acidi organici e di etanolo

27 Test di adesione Chamber slide INT-407 monolayer Giemsa stain CEPPI ISOLATI CEPPI DA COLLEZIONE: -L. casei casei ATCC 393 -L. acidophilus ATCC L. delbrueckii ATCC L. acidophilus ATCC 314 Cellular magnification 100x oil immersion

28 LATTOBACILLI L. acidophilus ATCC4356 L. sakei L. rhamnosus L. hamsteri ADESIONE SU INT ± ± ± ±8.67 Immagini acquisite con software Image Vision (Media Cybernetics) Ingrandimento 100X ad immersione

29 Pannello dei parametri valutati Resistenza a ph e bile Produzione di acidi organici Adesione su Int-407 L. casei L. paracasei L. sakei L. rhamnosus L. hamsteri aggregati + aggregati

30 Considerazioni finali L applicazione di un pannello di parametri risulta un valido strumento di screening al fine di valutare l attività probiotica di lattobacilli isolati L utilizzo di metodologie scientificamente controllate che diano risultati statisticamente significativi e riproducibili rimane un primo step per la selezione di nuovi candidati probiotici

31 .in order to study a problem you have to identify the right and appropriate model I modelli in vitro vanno scelti e valutati in base alle caratteristiche specifiche di ognuno, in relazione all obiettivo che si vuole perseguire