Consideriamo un dispositivo costituito da un recipiente contenente un certo numero di cellule viventi in un ambiente costituito da un terreno

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1 Consideriamo un dispositivo costituito da un recipiente contenente un certo numero di cellule viventi in un ambiente costituito da un terreno nutritizio liquido:

2 Modello Procariote

3 Differenti Tipi di Coltura di Cellule in Vitro Coltura Primaria Coltura Secondaria

4 Coltura Primaria Coltura a Breve Termine Coltura a Lungo Termine < 10 duplicazioni 50/60 duplicazioni

5 Coltura Secondaria Linea Cellulare Continua >150/200 duplicazioni

6 Linea Cellulare Continua E capace di crescere indipendentemente dall organismo originale da cui è derivata Crescita ininterrotta per oltre 1 anno Immortale

7 Linea Cellulare Continua Subclone derivata dalla linea cellulare parentale, ma con caratteristiche divergenti/uniche Linee sorelle simultanee stabilizzate da differenti siti dello stesso organismo il campione primario è stato suddiviso in più aliquote prima della semina Linee sorelle seriali stabilizzate dallo stesso organismo, ma in differenti momenti (ad esempio alla diagnosi ed alla recidiva)

8 Stabilizzazione di Nuove Linee Cellulari Estremamente Difficile Rari Successi e Non Prevedibili Importanza delle Aberrazioni Cromosomiche e/o Mutazioni Genetiche Diagnosi vs Ricaduta: diverse percentuali di successo

9 Scarsa riproducibilità della metodica nei vari laboratori The leukemia-lymphoma Cell Line FactsBook di H.G. Drexler, 2000.

10 IN VIVO La pressione parziale di ossigeno nei normali fluidi corporei è significativamente più bassa di quella dell aria Nel midollo osseo umano è di circa il 2-5%. EX VIVO Incubatore La pressione parziale di ossigeno negli incubatori al 5% di CO2 è di circa 15-20%!!! In alcuni casi è utile ridurre la fase gassosa di ossigeno tra 1-10% Alcune cell lines crescono al 5% di ossigeno ed il 6% di anidride carbonica

11 Deterioramento della Coltura Possibili ragioni Le cellule neoplastiche cessano di proliferare Overgrowth di fibroblasti o macrofagi Overgrowth di cellule linfoblastoidi EBV+ B B B B

12 LA STABILIZZAZIONE DI UNA NUOVA LINEA CELLULARE: PUNTI CRITICI Medium di coltura: RPMI 1640, IMDM, McCoy s, Alpha MEM e DMEM Fattori di crescita: EPO, G-CSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-6, SCF, PHA e CM Supporto colturale (plastica) Concentrazione cellulare Superamento della crisi di stabilizzazione

13 MEDIA Il terreno di coltura è una soluzione salina tamponata che contiene: Aminoacidi solubili Carboidrati Vitamine Minerali Cofattori Indicatori di ph (facoltativo) Aminoacidi non essenziali (facoltativo)

14 SIERO Il terreno di coltura richiede l aggiunta del 5-20% di siero che contiene: Fattori di crescita Proteine con funzioni di trasporto Ormoni Metalli (in tracce) Lipidi

15 Medium di Coltura Ioni Inorganici Ioni Inorganici Cloruro di calcio anidro Solfato di magnesio anidro Cloruro di potassio Nitrato di potassio Cloruro di sodio Fosfato di sodio bibasico Bicarbonato di Sodio

16 Medium di Coltura Aminoacidi-Isomeri L Alanina Arginina Asparagina Acido Aspartico Cisteina Glutamina Acido Glutamico Glicina Istidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Prolina Serina Treonina Triptofano Tirosina Valina

17 Medium di Coltura Vitamine Biotina Pantotenato Acido Folico Inositolo Nicotinamide Piridossina Riboflavina Tiamina Vitamina B12

18 Medium di Coltura Altri Componenti Glucosio Hepes Rosso fenolo Sodio - Piruvato Siero fetale bovino (10 oppure 20%) Aminoacidi non-essenziali

19 Sistema Tampone Metaboliti Alterazione del ph Rallentamento della crescita Morte cellulare E essenziale che il ph sia controllato attraverso un Sistema Tampone BICARBONATO-ANIDRIDE CARBONICA

20 BICARBONATO-ANIDRIDE CARBONICA Il sistema è costituito dal bicarbonato di sodio (oppure di potassio), presente in qualità di nutriente del medium, e dall anidride carbonica presente nell atmosfera degli incubatori a CO2. H2O+CO2 H2CO3 H+ + HCO3 NaHCO3 Na+ + HCO3 ph alcalino del medium: viene corretto dalla formazione di ioni carbonato (che si formano a seguito della ionizzazione dell acido carbonico derivato a sua volta dalla dissoluzione in acqua della CO2) ph acido del medium: viene corretto dalla formazione di bicarbonato di sodio (che deriva dall eccesso di carbonato) L equilibrio tra carbonato e bicarbonato di sodio è mantenuto nel medium di coltura grazie alla presenza della CO2 Il ph è mantenuto tra 7 e 7.4 nel medium di coltura

21 Medium di Coltura Altri Componenti Glucosio Hepes Rosso fenolo Sodio - Piruvato Siero fetale bovino (10 oppure 20%) Aminoacidi non-essenziali

22 Supporto Colturale E noto che alcuni tipi cellulari necessitano di supporti specifici. Ne è un esempio la coltura di cellule staminali embrionali murine: Piatre Petri da 35,60 e 100 mm: Falcon Fiasche e Multiwell: Nunc Methods in Molecular Biology, Vol. 185, Casa Editrice Humana Press

23 Vari Tipi di Supporto Colturale Piastre Diametro (mm) Superficie (cm 2 ) Volume (ml)

24 Vari Tipi di Supporto Colturale Multiwell Multiwell 96 Superficie (cm 2 ) 0.32 Volume (ml)

25 Vari Tipi di Supporto Colturale Fiasche Fiasche T-25 Superficie (cm 2 ) 25 Volume (ml) 5-10 T T T T

26 Concentrazione Cellulare

27 Le Cellule Schneider-2

28 Le Cellule Schneider-2 Tali cellule derivano dal piccolo dittero drosofilide che nello stato larvale vive nella frutta in fermentazione La specie Drosophila Melanogaster è largamente impiegata per studi fondamentali di genetica a causa dell alta incidenza di mutazioni spontanee che intervengono Gli esiti fenotipici che derivano da mutazioni sperimentalmente indotte possono essere verificati e studiati in tempi molto brevi

29 Protocollo di Tripsinizzazione per Cellule Aderenti La tripsina è un enzima proteolitico derivato dal pancreas porcino. Punti Salienti Lavare con PBS w/o Ca e Mg Incubare con Tripsina pre-riscaldata a 37 C Utilizzare un adeguato volume di Tripsina Incubare per almeno 5 min a 37 C Inattivare con medium completo di FBS

30 Camera di Burker Punti Salienti Due aree rettangolari e quindi due reticoli di conta Ogni reticolo di conta è costituito da 9 quadrati delimitati da linee triple Ciascuno dei 9 quadrati è costituito da 16 quadrati minori separati da doppie linee Si contano almeno 3 quadrati delimitati da linee triple ed ogni quadrato corrisponde ad 1/10mm3 ossia ad 1/10µl (1mm3=1µl) Si effettua una media aritmetica delle cellule contate nei tre quadrati delimitati da linee triple Si moltiplica il numero corrispondente alla media aritmetica per il fattore di diluizione che in questo caso è (0.1µl=0.0001ml)

31 Distinzione Morfologica Colturale di Vari Tipi Cellulari Cellule Aderenti; Cellule Semi-Aderenti; Cellule in Sospensione.

32 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures Dept. Human and Animal Cell Cultures Cell Line: PC-12 Cell Type: rat adrenal pheochromocytoma Origin: established from a transplantable rat adrenal pheochromocytoma in 1976; cells were described to synthesize catecholamines (dopamine, norepinephrine); in response to nerve growth factor (NGF) a neuronal phenotype could be induced reversibly DSMZ Cell Culture Data: Morphology: small cells growing in clumps in suspension, adhering poorly to plastic Medium: 85% RPMI % horse serum + 5% FBS Subculture: split saturated culture 1:2 to 1:3 every 3-4 days; cells grow in suspension without collagen; using collagen (Collagen S- Roche at 30 microg/ml) cells grow adherent, faster and to a higher density; the adherent cells may be detached mechanically without trypsin, for single cells the suspension should be passed several times through a syringe with a 22-gauge needle; seed out at ca x 106 cells/25 cm2 Incubation: at 37 /C with 5% CO2 Doubling Time: doubling time of ca hours Harvest: about 1-2 x 106 cells/ml or 30 x 106 cells/80 cm2 Storage: frozen with 70% medium, 20% FBS, 10% DMSO at about 5 x 106 cells/ampoule DSMZ Scientific Data: Mycoplasma: negative in DAPI, microbiological culture, RNA hybridization, PCR assays Species: confirmed as rat with IEF of AST, MDH, NP, PEP B Cytogenetics: rat hypodiploid karyotype with 20% polyploidy; 39(38-40)<2n> Viruses: ELISA: reverse transcriptase negative

33 Il Caso delle PC-12

34 Crisi di Stabilizzazione Le fasi iniziali di attiva crescita precedono il fenomeno definito Crisis Period i cui tempi sono variabili, ma durante il quale soltanto una piccola quota di cellule neoplastiche continua a proliferare attivamente e proprio da essa può derivare una linea cellulare continua.

35 CAMPI DI APPLICAZIONE CONCERNENTI LE LINEE CELLULARI LINFOBLASTOIDI B EBV + Rilevazioni di particolari mutazioni somatiche di interesse diagnostico Studio dell Ipertermia Maligna; Studio di particolari Alleli del Sistema HLA.

36 EBV EBV EBV EBV Immortalizzazione di B Linfociti Linfocita B B95-8 EBV Umano EBV EBV EBV Linea linfoblastoide Linea linfoblastoide

37 Accorgimenti Tecnici per lmmortalizzare B-Linfociti Seminare le cellule B95-8 alla concentrazione cellulare di cell/ml ed incubare a 33 C per 2-3 settimane senza operare alcun cambio di terreno colturale Il sovranatante raccolto deve essere sottoposto a filtrazione mediante l utilizzo di filtri con diametro di 0.22 µm All atto dell infezione la concentrazione cellulare di cellule mononucleate deve essere di 2X10 6 /ml in un terreno colturale costituito dal 50% di sovranatante EBV positivo

38 B95-8

39 Linfociti B Umani EBV+ stabilizzati

40 HVS HVS Procedura per infettare le cellule OMK HVS HVS HVS Le cellule OMK diventano un serbatoio per infettare i T linfociti OMK

41 Accorgimenti tecnici per infettare le cellule OMK Seminare le cellule OMK alla concentrazione di cellule/ml Utilizzare 1ml di sovranatante HVS, strain C- 488 al titolo di 10 6 di unità formanti placche Incubare a 37 C per un periodo di giorni Filtrare il sovranatante utilizzando i filtri da 0.22µm

42 HVS HVS HVS Immortalizzazione di T Linfociti Linfocita T OMK HVS Umano HVS HVS HVS Linea linfoblastoide Linea linfoblastoide

43 CRIOBIOLOGIA STUDIO DELLA VITA A BASSE TEMPERATURE