Nuovi strumenti della genomica per il controllo delle malattie degli ovini: risultati del programma di ricerca
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- Rachele Monti
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1 Nuovi strumenti della genomica per il controllo delle malattie degli ovini: risultati del programma di ricerca A. CARTA, S. CASU, J.J. ARRANZ, G. BANOS, S. BISHOP, L. BODIN, N. COCKETT, B. DALRYMPLE, G. FTHENAKIS, O. KEANE, E. MARTYNIUK, C. MORENO, R. RUPP, A. STELLA, S.H. ZHAO, H. JONES
2 Nuove esigenze Consumatori: prodotti biologici e salubri Produttori: riduzione dei costi di produzione resistenza alle malattie Mastiti sub-cliniche (CCS) Strongili gastro-intestinali Paratubercolosi Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili attitudine alla mungitura meccanica e longevità funzionale apparato mammario Morfologia mammaria e cinetica mungitura Valore nutrizionale del latte Contenuto in acidi grassi (CLA) del latte
3 Ovini: approccio classico (modello genetico infinitesimale) caratteri quantitativi (variabilitàcontinua; genotipo + ambiente) variabilità genetica: poligenica additiva numero elevato di geni diffusi in tutto il genoma, ciascuno con effetto infinitesimale
4 Ovini: limiti approccio classico Processo cieco : nessuna conoscenza geni, alleli, frequenze, effetti e localizzazione e dunque nessuna possibilitàdi monitorare e conservare la variabilità genetica Numero elevato di misure individuali
5 Introduzione Anni 90 : Disponibilitàdi informazioni provenienti dallo studio del genoma anche per specie di interesse zootecnico Mappe di marcatori molecolari Possibilitàdi sfruttare tali informazioni nell ambito del miglioramento genetico attraverso Selezione Assistita da Marcatori (MAS) o Geni (GAS)
6 Introduzione Mappe di marcatori In prevalenza microsatelliti Distanza media tra marcatori di ~10-20 cm (mappe sparse) Distribuzione non sempre omogenea sul genoma Numerosi protocolli per l identificazione di regioni del genoma associate a caratteri di interesse (QTL)(genome scan)
7 Introduzione MAS e GAS (mappe sparse) Risultati: Numerosi QTL individuati QTL caratterizzati da ampi intervalli di confidenza non direttamente utilizzabili in programmi di MAS Ampio range di geni candidati per posizione Difficoltànel identificazione delle mutazioni causali da utilizzare in programmi di GAS
8 Introduzione Fine anni 90 : Sequenziamento del genoma di specie di interesse zootecnico Single Nucleotide Polymorphism (SNP): AAGTCCTAGGCTATTACAGATAAATTGCC AAGTCCTAGGCTACTACAGATAAATTGCC Marcatori biallelici; Molto numerosi;distribuiti su tutto il Genoma
9 Introduzione SNP array: Permettono di tipizzare decine di migliaia di SNP contemporaneamente Costi ragionevoli per attivitàricerca.da valutare per applicazioni Di un particolare tipo di SNP array, BeadChip (ILLUMINA), sono disponibili le versioni per diverse specie di interesse zootecnico (Bovini, Suini, Equini, Ovini)
10 Ovine BeadChip Ovine SNP50 BeadChip: Sviluppato con la collaborazione del International Sheep Genomics Consortium (ISGC) Gli SNP sono stati ottenuti attraverso il (re)sequenziamento con diversi metodi di 75 ovini Sono stati individuati un totale di circa SNP
11 Ovine BeadChip SNP sono stati selezionati a costituire il BeadChip in quanto: Compatibili con la metodica di tipizzazione dei BeadChip Distribuiti uniformemente sul Genoma Frequenze alleliche sufficientemente bilanciate
12 Ovine BeadChip Micro Biglie specifiche x SNP Sonde, con sequenze adiacenti SNP 12 compartimenti 1 x individuo
13 Ovine BeadChip INFINIUM II
14 Ovine BeadChip Potenzialità(fine-mapping): Densificazione mappa genetica Piùprecisa localizzazione dei QTL (Fine-mapping) Individuazione di marcatori in forte LDcol gene di interesse (LD_MAS) Riduzione del numero dei geni candidati (GAS) Possibilitàdi identificare QTL attraverso LD-analisi
15 Ovine BeadChip fine-mapping Intervallo di confidenza Probabilitàdi localizzazione del QTL SNP M M Q M M M
16 3SR è un progetto finanziato dalla Commissione Europa ( euro) nell ambito del 7 FP che coinvolge un consorzio internazionale di 14 partners per contribuire, attraverso le informazioni genomiche sugli ovini e caprini, alla comprensione delle basi genetiche dei caratteri che stanno alla base di una produzione sostenibile e della sanità degli animali e dei prodotti da essi derivati e fornire strumenti per il loro miglioramento.
17 Collaborazioni con progetti internazionali
18 Partners italiani AGRIS : popolazione sperimentale e analisi genetiche IZS Sardegna: misure paratubercolosi (Dott. Ligios, Dott.ssa Ponti) UNISS, Dipartimento di Medicina Veterinaria: nematodi gastrointestinali (Prof. Scala) Parco Tecnologico Padano: bioinformatica
19 Obiettivo finale identificare dei marcatori genetici che possano essere utilizzati nella selezione al fine di migliorare la sanitàe il benessere animale concorrendo a incrementare la competitivitàdelle filiere produttive dei piccoli ruminanti in Europa. Impiego di: tecnologie di genomica high-throughput la genomica comparata e quella funzionale sequenziamento del genoma Obiettivo sviluppare strumenti e risorse per le future ricerche di genomica nei piccoli ruminanti.
20 I caratteri oggetto di studio sono: la suscettibilità/resistenza alle mastiti la suscettibilità/resistenza ai nematodi la suscettibilità/resistenza alla paratubercolosi
21
22 Una delle difficoltàmaggiori per gli studi di genetica èla disponibilitàdi un fenotipo individuale accurato. Per quasi tutti i caratteri di resistenza alle patologie esiste un problema di costo e/o precisione del fenotipo. resistenza alle mastiti cellule somatiche del latte resistenza ai nematodi gastrointestinali Conta delle uova nelle feci resistenza alla paratubercolosi analisi sierologica (ELISA)
23 Overview del progetto Primo Anno Secondo Anno Terzo Anno Task1.Individuazione QTL per la resistenza utilizzando ovine beadchip 50K Task2.Fine mapping attraverso sequenziamento Task3.Creare e analizzare I dati di espressione genica negli ovini e nei caprini Task4.Verifica di associazioni significative di SNP in popolazioni independenti
24 Identificazione di regioni cromosomiche 29 popolazioni ovine e più di animali analisi genotipo con l Ilumina Ovine 50SNP BeadChip. resistenza alle mastiti pecore popolazione AGRIS, pecore di razza Churra (CH), arieti e 334 pecore Lacaune (L). resistenza ai nematodi gastrointestinali pecore da incroci di ritorno razza Sarda su backcross SardaxLacaune (S), 752 ovini Blackface (BF) agnelli Martinique Blackbelly x Romane. carattere comune: conta in uova nelle feci (FEC), (ematocrito, concentrazione di pepsinogeno, conta di eosinofili,livelli di IgA). resistenza alla paratubercolosi pecore popolazione AGRIS
25 AGRIS: popolazione sperimentale 26/06/2013 XX Congresso Nazionale S.I.P.A.O.C. - Siracusa, 26/29 settembre 2012 Settore: Genetica e Biotecnologie
26 Lista dei fenotipi registrati
27 Task1. Identificazione di regioni cromosiche che controllano la resistenza alle mastiti negli ovini (INRA, AGRIS, ULE) Popolazioni e QTL per SCC # Razza Populazione N geno+pheno N QTL 1 Churra (ULE) Daughter Design (16 families) 2 Sarda*Lacaune (AGRIS) Phenotype: Somatic cell count (YD) + udder type traits + milk emission(2) + paratb (2) BC design (10 F1 + G1+G2) 3 Lacaune (INRA) GDD design (33 families) Divergent lines 334 1
28 Task1. Identificazione di regioni cromosiche che controllano la resistenza alle mastiti negli ovini (INRA, AGRIS, ULE) Un totale di 30 QTL in Lacaune, Churra e Sarda BC (D2.1) Pochi QTL in comune (<5Mb distanza) OAR3 : Lacaune GDD (130,1 Mb); Sarda BC (127,4 Mb) OAR8: Churra (89,7Mb) e Lacaune GDD (84,9 Mb) OAR14: Churra (40,4 Mb) e Lacaune GDD (37,8Mb) OAR20: Sarda BC (26,3Mb) e Churra (21,4Mb) OAR16 :Churra (26,9-43,0 Mb) e Lacaune GDD (36,2 Mb) QTL per SCC sono stati riportati sui cromosomi OAR5 e OAR10 in diverse popolazioni ma le posizioni più probabili erano distanti
29 Task1. Identificazione di regioni cromosiche che controllano la resistenza alle mastiti negli ovini (INRA, AGRIS, ULE) Pop. Lacaune (INRA): conferma di OAR3 QTL su OAR3 (LA, LDLA, LD) Contrasto degli effetti degli aplotipi
30 Task1. Identificazione di regioni cromosiche che controllano la resistenza alle mastiti negli ovini (INRA, AGRIS, ULE) Trio sequencing: scelta su aplotipi di 4-SNP 1 padre segregante 2 discendenza Padre -/+ Index SCS= -0,9 (Cd=0,97) Padre -/- Padre +/+ Index SCS= -1,65 Index SCS= 0,0 (CD=0,91) (CD=0,75)
31 Risultati pop. AGRIS Cellule somatiche Chromosome Wise significance -lo g 1 0 (P -v a lu e ) pos (Mb)
32 Task 1. Genome Scans per la resistenza ai Nematodi negli ovini Popolazioni: Razza Popolazione N geno+pheno Blackface Sarda*Lacaune (AGRIS) Blackbelly*Romaine (INRA) Half sib families in complex ped. BC design (10 F1+G1+G2) BC 1000 Fenotipi: FEC
33 Task 1. Genome Scans per la resistenza agli strongili gastrointestinali Identificati diversi QTL significativi 20 AGRIS 7 in UEDIN 7 in INRA QTL prevalentemente specifici della popolazione la struttura della popolazione influenza: definizione del fenotipo Tecniche statistiche appropriate
34 Risultati pop. AGRIS Strongili G.I. Chromosome Wise significance lo g 1 0 (P -v a lu e ) pos (Mb)
35 Paratubercolosi Sire model al posto di Animal model Trasmissione verticale madre-figli trasmissione in utero trasmissione oro-fecale Al fine di ridurre la confusione tra l effetto l genetico materno e l effetto stato materno MAP Pedigree file: MGS 40 padri 18 padri di padre 28 nonni materni
36 Risultati Ereditabilitàdi MAP statusuguale a 0.28 ±0.10 Ulteriori risultati su misure lineari (media Densità Ottica) utilizzando un modello lineare 0.35 ± 0.057
37 Carrer 4 Paratuberculosis CW significance LDLA lo g 1 0 (P -v a lu e ) B3 -lo g 1 0 (P -v a lu e ) pos (Mb) pos (Mb)
38 MY 4 Milk CW significance 10 -log10(p-value) PC pos (Mb) -log10(p-value) FC -log10(p-value) pos (Mb) pos (Mb) 13
39 TP 4 Udder Morphology CW significance 9 -lo g 1 0 (P -v a lu e ) US pos (Mb) 4 1 -lo g 1 0 (P -v a lu e ) pos (Mb)
40 CLA/Vaccenic CW significance lo g 1 0 (P -v a lu e ) pos (Mb)
41 Mappatura fine del genoma nelle zone identificate Identificazione di tre animali che sulla base delle analisi genetiche hanno elevate probabilità di essere rispettivamente : omozigote favorevole; omozigote sfavorevole e eterozigote a una mutazione associata (causale) Sequenziamento a alta risoluzione dell intero genoma al fine di identificare i polimorfismi nella zona che presentano lo status descritto Analisi dei polimorfismi evidenziati
42 α frq(sires) frq(offsprings) k = nclust l= 1 H+ H- IBD(+-)=0.0; IBD(++) & IBD(--)>0.8 z kl β sire haplotypes H- l α TRIOS NO = p(h+)>0.9; p(h-)>0.9 = p(h+)=1.0; p(h-)=0.0 = p(h+)=0.0; p(h-)=1.0 YES -- Significant QTL LDLA (SA) H+ NO frq(sires) > (2/76) Max (α H+ -α H- ) IBDp (H+,H-)= offspring YES y Sequencing ++
43 Trios TRAIT OAR LOC. Mb P-value CW P-value GW Frq(sires) Frq(offspring) IBD Contrast H+ H- H+ H FEC SCS
44 Trios (Agris funds) TRAIT OAR LOC. Mb P-value CW P-value GW Frq(sires) Frq(offspring) IBD Contrast H+ H- H+ H FEC PTBC < < C/V < < TP < < PC < < MY < FC < < US < C/V <
45 Sommario risultati Ricerca di regioni cromosomiche (QTL) resistenza alle mastiti identificate piùdi 30 regioni cromosomiche associate con la variabilitàdel CCS nelle diverse popolazioni delle quali 3 (OAR3, 14 e 20) comuni. resistenza ai nematodi gastrointestinali identificate (con diversi caratteri e metodi) 36, 14 e 37 associazioni significative nella popolazione S, MBR e BF rispettivamente. In particolare risulta significativa e ben localizzata quella su OAR12 in MBR. resistenza alla paratubercolosi identificati numerosi QTL in 17 cromosomi, i piùsignificativi dei quali su OAR20.
46 CONCLUSIONI A livello europeo si sta investendo molto per valutare concretamente la possibilitàdi applicare piani di selezione per la resistenza alle malattie. Problematiche: 1)Fenotipi non sempre idonei 2)OVINE beadchips non abbastanza densi, assembly genoma ovino non ultimato, numerosità fenotipi e banche DNA
47 Grazie per l attenzione
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