Il supporto del Laboratorio Regionale nelle Emergenze Microbiologiche (CRREM)

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1 II Corso Nazionale Teorico Pratico Emergenze in Infettivologia Ferrara, 30 Settembre 2009 Il supporto del Laboratorio Regionale nelle Emergenze Microbiologiche (CRREM) Vittorio Sambri Laboratorio CRREM U.O. Microbiologia Azienda Ospedaliera Universitaria S.Orsola-Malpighi Bologna

2 Perché il CRREM? Patologie Infettive Emergenti/Ri-emergenti Bacillus anthracis SARS H5N1 Chikungunya H1N1 WNV What s next?

3 Velocità dei viaggi in relazione alla crescita della popolazione Speed of Global Travel in Relation to Days to Circum navigate ( ) the Globe World Population Growth Year From: Murphy and Nathanson. Semin. Virol. 5, 87, World Population in billions ( )

4 Come è fatto il CRREM? Inquadrato nell ambito di una U.O. Microbiologia Universitaria/Ospedaliera Personale dedicato 1 P.A./Direigente Medico 2 Biotecnologi 2 Biologi 4(6) TSLB Struttura autonoma (!)

5 Come è fatto il CRREM? Circa 250 m 2 di Laboratorio Biotech Sistemi automatici per indagini molecolari/naats Sistemi automatici per indagini sierologiche Colture cellulari per isolamento virale Laboratorio BSL3 Colture batteriche e virali Sistema anaerobio DPI

6 CRREM (Laboratorio BSL3)

7 CRREM

8 Inter-relazioni del CRREM Sanità Pubblica (RER/Locale) CRREM Aziende Ospedaliere ISS/INMI/eCDC

9 Attività CRREM Diagnosi Formazione Ricerca Networking

10 Attività Diagnostica CRREM Diagnosi Carbonchio SARS H5N1 CHIKV Dengue H1N1 WNV Sepsi CCHF TBE TosV JEV..

11 Metodi sierologici WNV EIA IgM (siero, plasma) EIA IgG (siero, plasma) IFA IgG (siero, liquor) IFA IgM (siero, liquor) Avidità IgG (siero) Mosaico Flavivirus (TBE, WNV, JE) IFA

12 Identificazione Virale Plasma, siero, CSF Isolamento colturale (differenti linee) RT-PCR (real time, in house) RT-PCR (real time,roche AppliedScience) Plasma TMA (Chiron)

13 Sicurezza UET/Donazioni Plasma TMA (Chiron: da giovedi 16/10 in automazione TIGRIS - fino a 1000 campioni/14 ore) Costi organizzazione

14 Campioni biologici Il materiale patologico ottimale ècostituito da ASPIRATO NASOFARINGEO/TAMPONE NASOFARINGEO. Sono comunque accettabili anche: Lavaggio nasale Tampone faringeo Tampone congiuntivale (sempre in associazione ad un altro campione) Materiali profondi (BAL, Aspirato trans-tracheale, etc..) Tutti i materiali devono essere raccolti durante la fase acuta entro 3 giorni dall inizio dei sintomi

15 Diagnosi di Laboratorio E possibile determinare tipo, sottotipo e ceppo circolante I metodi utilizzati: Isolamento virale (cellule o uova embrionate) Identificazione del genoma virale (Real Time PCR) Identificazione dell antigene virale - Sierologia

16 Identificazione del genoma virale Real Time RT-PCR (Real Time PCR preceduta da trascrizione inversa) Per fare diagnosi di influenza A o B i primers utilizzati sono diretti verso regioni altamente conservate delle proteine virali interne tipo-specifiche (NP o M1) Per la sottotipizzazione vengono utilizzati primers specifici per le proteine virali di superficie sottotipo-specifiche (HA), primers specifici per i geni H1, N1, H5, N1, N3. Ricerca degli antigeni virali Effettuata nelle secrezioni faringo-bronchiali mediante reazioni di immunofluorescenza o immunoenzimatiche. Immunofluorescenza diretta sulle cellule presenti nel campione con utilizzo di anticorpi monoclonali marcati

17 Influenza A/H1N1: Diagnosi di laboratorio Ricerca del genoma virale A/H1N1 su Tampone naso-faringeo e/o nasale Caso sospetto Caso probabile RT-PCR; NASBA Caso presumibilmente positivo CDC realtime RT-PCR protocol(versione 2009)

18 rrt-pcr Swine Flu Panel CDC Real-Time RT-PCR protocol for detection and characterization of Swine Influenza (Version 2009) Set primers e sonde: InfA: influenza A SwInfA: influenza A di origine suina (gene NP) SwH1: influenza A di origine suina, subtype H1 (gene HA) RNaseP: RNaseP umana controllo estrazione acidi nucleici Test Positivo per rrt-pcr Swine FluPanel paziente presumibilmente infetto da virus A/H1N1 di origine suina L identificazione definitiva di infezione da virus A/H1N1 di origine suina richiede ulteriori indagini di laboratorio, valutazioni cliniche ed epidemiologiche

19 Metodi rapidi di ricerca dell antigene Attualmente, in letteratura sono pubblicati pochi dati riguardo la comparazione di sensibilità tra i test rapidi e i test molecolari per l identificazione del nuovo virus pandemico A/H1N1. Studi analitici recenti hanno indicato che test rapidi commerciali sono reattivi nei confronti della nucleoproteina del virus pandemico A/H1N1 ma i dati di letteratura riguardo la comparazione di sensibilità tra i test rapidi e i test molecolari per l identificazione del nuovo virus pandemico A/H1N1 in campioni clinici sono molto limitati. In generale, la sensibilità dei test rapidi rispetto ai test molecolari, per la rilevazione del nuovo virus pandemico A/H1N1 ècompresa tra il 10% ed il 70%, pertanto un risultato negativo al test rapido non esclude la presenza di infezione da nuovo virus pandemico A/H1N1. Inoltre, la sensibilità dei test rapidi nel rilevare il nuovo virus pandemico A/H1N1 è considerata da paragonabile a più bassa rispetto alla sensibilità degli stessi test nel rilevare i virus influenzali stagionali

20 SIEROLOGIA Al momento NON sono stati validati metodi sierologici con riconosciuta efficienza diagnostica per il nuovo virus A H1N1 swine. L applicazione dei test classici (basati su virus A epidemici ) mette in evidenza, in pazienti affetti da A H1N1, risposte anticorpali molto basse e quindi non utili al fine di valutare la pregressa immunità o lo stato attivo di infezione.

21 La fortuna favorisce solo le menti preparate Louis Pasteur ( )