Metodi di laboratorio nel controllo microbiologico degli alimenti: classici ed innovativi

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1 Metodi di laboratorio nel controllo microbiologico degli alimenti: classici ed innovativi Torino, Giugno 2013 S.S. Laboratorio Controllo Alimenti 1

2 Aspetti normativi Cosa tratteremo Metodi normati Metodi alternativi Aspetti pratici Per il laboratorio Per l utenza 2

3 REGOLAMENTO (CE) N. 882/2004 DEL PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO del 29 aprile 2004 relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformità alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali 3

4 ART. 11 Metodi di campionamento e di analisi I metodi di campionamento e di analisi utilizzati nel contesto dei controlli ufficiali sono conformi alle pertinenti norme comunitarie oppure... se tali norme non esistono, a norme o protocolli riconosciuti internazionalmente, ad esempio quelli accettati dal Comitato europeo di normalizzazione (CEN) o quelli accettati dalla legislazione nazionale; oppure... in assenza, ad altri metodi utili al raggiungimento degli obiettivi o sviluppati conformemente a protocolli scientifici. 4

5 Reg. CE 882/04 art. 11 I metodi di campionamento e di analisi utilizzati nel contesto dei controlli ufficiali sono conformi alle pertinenti norme comunitarie REGOLAMENTO (CE) n. 2073/2005 DELLA COMMISSIONE del 15 novembre 2005 sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari Articolo 5 - Norme specifiche per le analisi e il campionamento I metodi di analisi, i piani e metodi di campionamento di cui all allegato I sono applicati come metodi di riferimento.... 5

6 Metodiche classiche Metodi qualitativi Metodi quantitativi: conteggio ufc/g o ufc/ml Metodi semiquantitativi: MPN 6

7 Metodi qualitativi tradizionali(iso)... Pesata del campione Prearricchimento Arricchimento Isolamento Conferma: biochimica e sierologica 7

8 ...Metodi qualitativi tradizionali(iso)... Pesta del campione Prearricchimento Arricchimento Isolamento Conferma: biochimica e sierologica 8

9 ...Metodi qualitativi tradizionali(iso)... Pesta del campione Prearricchimento Arricchimento Isolamento Conferma: biochimica e sierologica 9

10 ...Metodi qualitativi tradizionali(iso)... Pesta del campione Prearricchimento Arricchimento Isolamento Conferma: biochimica e sierologica 10

11 Salmonella spp. ISO 6579 Se negativo: esito in 72 ore 11

12 Metodiquantitativi: Conteggio ufc/g o ml Pesata Diluizione in base 10 Semina diretta in piastra (per inclusione o spatolamento) Conteggio colonie Prove di conferma, se richieste Batteri patogeni ed indicatori igiene conteggiati: Listeria monocytogenes, carica batterica totale, enterobatteri, E. coli ß glucuronidasi +, stafilococchi coagulasi positivi 12

13 10 g o 10 ml di campione in 90 ml di brodo BPW Preparazione diluizione decimali successive in acqua peptonata Numerazione Stafilococchi coagulasi positivi Conteggio colonie ISO Semina su terreno BP-RPF Incubazione in aerobiosi a 37 C Valutazione dopo ore Conteggio colonie tipiche Assenza di colonie sospette Esito come < 10 ufc/g o <100 ufc/g Emissione RdP N = C V x ( n n2 ) x d Emissione RdP C = sommatoria colonie di due diluizione successive V = volume di inoculo in ogni piastre (ml) n1 = numero di piastre della prima diluizione n2 =numero di piastre della seconda diluzione d = fattore di diluzione della prima diluizione considrerata 13

14 10 g o 10 ml di campione in 90 ml di brodo BPW Numerazione Bacillus cereus Conteggio colonie IS O 7932 Preparazione diluizione decimali successive in acqua peptonata Semina su terreno MYP Incubazione in aerobiosi a 30 C Valutazione dopo 48 ore Conteggio colonie tipiche Assenza di colonie sospette Esito come < 10 ufc/g o <100 ufc/g Emissione RdP Presenza di colonie sospette Prove di conferma b a = x C A a = numero di microrganismi identificati b = n. colonie confermate C =n. di colonie conteggiate A = n. colonie usate per la conferma 14

15 Metodisemi-quantitativi: Most probable number(mpn) Pesata Diluizione in base 10 Semina diretta in brodo Se tubi +, semina in piastra Prove di conferma Batteri patogeni ed indicatori igiene conteggiati: Listeriamonocytogenes, E. colißglucuronidasi+, 15

16 ART. 5 Norme specifiche per le analisi e il campionamento L impiego di metodi d analisi alternativi è accettabile quando tali metodi sono validati in base al metodo di riferimento di cui all allegato I e se è utilizzato un metodo proprietario certificato da una terza parte in base al protocollo definito nella norma EN/ISO o ad altri protocolli analoghi accettati a livello internazionale. 16

17 I metodi alternativi Metodiche immunoenzimatiche ELFA (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, E.coli O157, ) (AFNOR ) Automatizzati o semiautomatici MPN in card -sistema TEMPO (AFNOR ) Metodiche biomolecolari Real Time (Salmonellaspp, Listeriamonocytogenes, VTEC, ) (ISO, AFNOR ) End-point (Salmonella, stafilococchi enterotossigeni, ) (Centro di Referimento Nazionale, EU-RL, ) PFGE (Salmonella, Listeria, S. aureus) (Centro direferimentonazionale, EU-RL, ) 17

18 Immunoenzimatici Metodiche ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay ) Rilevamentodellapresenzadel target attraverso la detection di antigeni specifici. Utilizza un sistema automatizzato(vidas) Kit pronto all uso 18

19 Salmonella spp. ELFA Se negativo: esito in 48 ore 19

20 Automatizzati o semiautomatici Sistema TEMPO Il campione è inoculato in card e l analisi viene letta in maniera automatica dopo incubazione. È un sistema chiuso che rende il risultato in ufc/g o ml 20

21 Metodiche Real-Time PCR PCR: amplificazione della sequenza target di DNA grazie a primer specifici Nella PCR tradizionale l amplificazione viene visualizzata dopo corsa elettroforetica e colorazione del gel di corsa Nella RealTime PCR il DNA amplificato viene rilevato in tempo reale dallo strumento e non è quindi prevista nessuna manipolazione postamplificazione 21

22 Il protocollo R-Ti PCR Pesatadel campione(25 g), arricchimento e prima incubazione (18-24 ore) Estrazione, amplificazione Risultato(PRESENZA/ASSENZA DI DNA) DNA dabatteriovivo e vitale 22

23 Salmonella spp. R-Ti PCR Se negativo: esito in 24 ore 23

24 Perchè un metodo alternativo? Piùrapido Ridotto impiego di personale Ridotto uso di reagenti Migliore performance Multitarget Patogeni emergenti Intervento in emergenze sanitarie 24

25 Come si procede? Individuare il metodo più adatto Applicarlo in laboratorio Validare il metodo Accreditare la prova Renderlo applicabile sui campioni ufficiali 25

26 Individuare il metodo più adatto: -Aggiornamento bibliografico relativamente alle principali tecniche rapide d indagine, biochimiche e biomolecolari, in grado di individuare il target prescelto. -Valuazione della possibilità di utilizzare kit pronti presenti in commercio o metodi in-house 26

27 Applicarlo in laboratorio 1. Stesura Procedura Operativa 2. Allestimento e ottimizzazione in laboratorio dei metodi individuati. 3. Vincere la iniziale diffidenza del personale 27

28 I risultati concreti in laboratorio POS 10CA073 e 10CA074 28

29 Validare il metodo 1. Se il metodo ha una validazione commerciale, effettuare la verifica delle performance in laboratorio 2. Le metodiche alternative e rapide verranno validate secondo quanto previsto dalla norma ISO contro il metodo gold standard (es. ISO) o procedure equivalenti(pgs condivisa tra II.ZZ.SS.) 29

30 Un esempio AFNOR BRD (07/10-04/05) L. monocytogenes Accuratezza Sensibilità Specificità 98,30% 97,50% 98,90% 30

31 Accreditare la prova - Reg CE 882/04 (art. 12) L'autorità competente designa i laboratori che possono eseguire l'analisi dei campioni prelevati durante i controlli ufficiali. Le autorità competenti, tuttavia, possono designare soltanto i laboratori che operano, sono valutati e accreditati conformemente alle seguenti norme europee: EN ISO/IEC EN EN

32 I risultati concreti con ACCREDIA due esempi POS 10CA073 e 10CA074 accreditate dal dicembre

33 Applicazioni pratiche Oggi tutti i campioni di alimenti prelevati per la determinazione di di Listeria monocytogenes e Salmonella sp vengono processati con metodo Real- Time PCR RegCE 2073/2005 e s.m.i. PRISA PIF UVAC MTA 33

34 Punti di forza metodi in Real Time PCR Tempi dirispostamigliorati(campioninegativiin 30 h) Buona parte della procedura è automatizzata (minor errore umano) Letturaautomatica(minor erroreumano) Kit prontiall uso(miglioregestionereagentia magazzino) Sistema miniaturizzato riduce i rifiuti speciali in laboratorio 34

35 Criticità dei metodi in Real Time PCR I positivi devono essere confermati con metodi tradizionali 35

36 Criticità dei metodi in Real Time PCR Iniziale difficoltà interpretativa del RdP 36

37 Un cenno sulla PFGE Metodo per la separazione di frammenti di DNA e successivo confronto profili ottenuti Separazione di grossi frammenti di DNA prodotti tramite enzimi di restrizione Si ricorre ad una lisi in situ (in un piccolo cubetto di agarosio) il DNA immobilizzato nell agarosiopreserva la sua integrità 37

38 Tappe principali della PFGE Incorporazione dei batteri in agarosio Lisi in situ delle cellule batteriche Rimozione dei detriti cellulari Restrizione del DNA mediante endonucleasi Separazione dei frammenti (gel 1%) Visualizzazione con transilluminatore Stoccaggio immagine del profilo di bande Analisi e interpretazione dei profili 38

39 I risultati 39

40 Interpretazione In alcuni casi è possibile distinguere ad occhio la presenza di profili identici o differenti per una o piùbande. Per profili con piùdi 10 bande: Nessuna banda di differenza = indistinguibili 2-3 bande di differenza = strettamente correlati 7 o piùbande di differenza = non correlati Nel caso di molti campioni in esame è necessario ricorrere all utilizzo di software per l analisi dei dati 40

41 Elaborazione dei dati L elaborazione dei dati mediante l utilizzo di programmi informatici specifici consente di calcolare i coefficienti di similitudine 41

42 Applicazione della PFGE Confronto di isolati epidemiologicamente correlati Studio di episodi MTA 42

43 Applicazione di PFGE nel Laboratorio Controllo Alimenti IZS PLV

44 Grazie per l attenzione! 44

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