I RISULTATI DELL ATTIVITÀ DEL LABORATORIO DI RIFERIMENTO REGIONALE. Anna Barbui S.C. Microbiologia AOU San Giovanni Battista di Torino

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1 I RISULTATI DELL ATTIVITÀ DEL LABORATORIO DI RIFERIMENTO REGIONALE Anna Barbui S.C. Microbiologia AOU San Giovanni Battista di Torino

2 Sorveglianza delle malattie batteriche invasive Diagnosi di laboratorio delle meningiti Risultati dell attività dal 2005

3 Obiettivi della sorveglianza delle malattie batteriche invasive Dal Protocollo operativo luglio 2008 Obiettivi generali: Stimare la quota dei casi prevenibili e valutare l impatto delle strategie intraprese Attivare a livello nazionale la sorveglianza di tutte le malattie batteriche invasive causate da meningococco, pneumococco ed emofilo garantendo la sierotipizzazione della maggior parte degli isolamenti Obiettivi specifici: Monitorare l andamento temporale e geografico dei casi Descrivere la frequenza dei casi per agente patogeno, regione e fascia di età Descrivere la distribuzione dei sierogruppi/sierotipi circolanti Stimare la quota di queste infezioni invasive prevenibili da vaccino Indagare i casi di fallimento vaccinale, studiandone i fattori di rischio

4 Il ruolo del laboratorio di microbiologia nel contesto della sorveglianza delle meningiti batteriche Laboratorio ospedaliero: sospetta meningite: esame chimico- fisico del liquor conferma eziologica: esame microscopico ricerca antigeni esame colturale del liquor emocoltura Per un ottimale attuazione del sistema di sorveglianza è cruciale potenziare le capacità di laboratorio in sede periferica Laboratorio di riferimento Regionale: Sierotipizzazione ceppi batterici isolati Indagini molecolari per ricerca agenti eziologici Dal Protocollo operativo luglio 2008 Laboratorio di riferimento Nazionale: Tipizzazione ceppi batterici Studi epidemiologici su vasta scala

5 Diagnosi di laboratorio delle meningiti E. Carbonelle, MEDMAL feb 2009 Non si può escludere una eziologia batterica in assenza dei criteri tipici Fondamentale procedere con tutti i metodi diagnostici microbiologici

6 Diagnosi di laboratorio delle meningiti: Il punto cruciale Prelievo del liquor (LCR) prima dell inizio della terapia antibiotica Prelievo di sangue per emocoltura Invio tempestivo in laboratorio LCR è ipotonico: lisi dei neutrofili (- 32% dopo 1 ora) NM, SP e HI sono batteri fastidious e possono non sopravvivere a variazioni di temperatura Gli antigeni polisaccaridici possono degradarsi rapidamente a temperatura >25 C

7 Diagnosi microbiologica delle meningiti Esame microscopico con colorazione di Gram Trattamento antibiotico sensibilità NO 60-97% SI 40-60% La sensibilità dipende dalla carica microbica: 10 5 batteri/ml: 97% batteri/ml: 60-97% <10 3 batteri/ml: 25% L uso della tecnica del citocentrifugato aumenta di un fattore 100 la possibilità di osservare batteri È più facile osservare i pneumococchi che la listeria S pneumoniae 90% H influenzae 86% N meningitidis 75% Listeria 50%

8 Diagnosi microbiologica delle meningiti Ricerca antigeni batterici Meningococcal disease: methods and protocols Di Andrew J. Pollard, Martin C. J. Maiden. Humana Press, 2001 La sensibilità per NM può dipendere dal sierogruppo E. Carbonelle, MEDMAL feb 2009

9 Diagnosi microbiologica delle meningiti Ricerca antigeni di pneumococco nel liquor e nelle urine negativo positivo invalido E. Carbonelle, MEDMAL feb 2009

10 AGGLUTINAZIONE per ANTIGENI BATTERICI RICERCA DNA BATTERI in PCR 26 campioni di LCR con test per Ag + per batterici: 20 risultati concordanti con PCR (83%) 6 risultati discordanti Antigeni + PCR + PCR- S.pneumoniae N.meningitidis S.agalactiae H.influenzae 1-1 (N.meningitidis) NB. Nelle schede di segnalazione viene indicato genericamente agente eziologico non identificato e non sono esplicitati i test effettuati. Non è quindi possibile effettuare un confronto PCR + e Antigeni -.

11 Diagnosi microbiologica delle meningiti Esame colturale del liquor E. Carbonelle, MEDMAL feb 2009 Trattamento antibiotico sensibilità NO 36-94% SI <10% EMOCOLTURA + pre trattamento % post trattamento < 5 %

12 LA PCR NELLA DIAGNOSI DELLE MENINGITI BATTERICHE VANTAGGI Rapidità (tempi diagnostici ridotti) Elevata specificità Elevata sensibilità Buona riproducibilità E. Carbonelle, MEDMAL feb 2009

13 LA PCR E DIAGNOSI DI MENINGITE BATTERICA Real time PCR VANTAGGI Meno dipendente dalla terapia Chiba et all 2009, I Infect Chem PCR pre ATB: 88.7%, post ATB: 58.1% Coltura pre ATB: 69.8%, post ATB: 29%

14 LA PCR NELLA DIAGNOSTICA CLINICA CRITICITA Costi Formazione del personale Organizzazione del laboratorio Identificare pochi centri dove effettuare questo tipo di indagini

15 Diagnosi di laboratorio delle meningiti: I punti FONDAMENTALI corretta raccolta dei campioni clinici non esiste un esame di laboratorio con affidabilità, rapidità,sensibilità, specificità ottimali UTILIZZARE SEMPRE TUTTI I TEST DI LABORATORIO DISPONIBILI: Esame chimico- fisico Esame microscopico Esame colturale (liquor e sangue) Ricerca antigeni (liquor e urina) PCR (in laboratori adeguatamente attrezzati) tutte le metodiche in PCR per target batterici devono essere considerate di impiego eclusivamente epidemiologico mancandone l adeguata validazione clinica. (PDM AMCLI 2008)

16 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO S.C. Microbiologia A.S.O.U. San Giovanni Battista Laboratorio ospedaliero Liquor con agente eziologico non identificato Ceppi di SP 0-14 anni Ceppi meningococco Ricerca mediante PCR agenti batterici di meningite su Liquor Sierotipizzazione ceppi di Streptococcus pneumoniae Microbiologia Molinette Tipizzazione molecolare di Neisseria meningitidis Stoccaggio e spedizione ceppi SeREMI ASL AL ISS

17 Ricerca del DNA batterico con PCR: Kit Real time PCR multiplex Sistema EuSepScreen = 2 kit in REAL TIME PCR EuSepScreen EuSepScreen lattanti N. meningiditis (ctra-fam) S. pneumoniae (lyta-joe) Mix 1 ROSSA E. coli (uidb-joe) K. pneumoniae (phoe- FAM) Mix 1 BLU H. influenzae (bexa-joe) Adenovirus (L4 - FAM) Mix 2 VERDE S. agalactiae (sip-fam) L. monocytogenes (iap-joe) Mix 2 GIALLA Beta globina (puc57-fam) Beta globina (puc57-fam) Mix 3 BIANCA Mix 3 BIANCA

18 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO S.C. Microbiologia A.S.O.U. San Giovanni Battista Da gennaio 2005 a novembre 2011:235 campioni di liquor

19 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO S.C. Microbiologia A.S.O.U. San Giovanni Battista Da gennaio 2005 a dicembre 2009: 180 campioni di liquor 126 liquor negativi con tutti i test microbiologici convenzionali 54 LCR con diagnosi eziologica presuntiva: Gram, Ag, Emocoltura con PCR: Diagnosi/Conferma nel 44%

20 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO S.C. Microbiologia A.S.O.U. San Giovanni Battista Da gennaio 2010 a novembre 2011: 55 campioni di liquor 47 liquor negativi con tutti i test microbiologici convenzionali 8 LCR con diagnosi eziologica presuntiva: Gram, Ag, Emocoltura con PCR: Diagnosi/Conferma nel 41.8%

21 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO S.C. Microbiologia A.S.O.U. San Giovanni Battista Ricerca DNA batterico su campioni di liquor Quantità di campione Ideale 1 ml Minimo 200 ul Conservazione del campione Conservazione del campione Conservare a 4 C Non congelare Mantenere le condizioni di sterilità Se si centrifuga il campione: non inviare il surnatante Compilare l allegato 2 Se si desidera un referto ufficiale inviare la richiesta per la prestazione

22 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO S.C. Microbiologia A.S.O.U. San Giovanni Battista Tipizzazione molecolare di Neisseria meningitidis Identificazione/conferma di N. meningitidis gene crga Identificazione dei sierogruppi A gene orf-2 B, C, Y, W-135 gene siad PCR multiplex da campione o da ceppo Si allestiscono 3 reazioni di PCR per ciascun campione Gli amplificati vengono distinti in base al peso molecolare

23 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO S.C. Microbiologia A.S.O.U. San Giovanni Battista Tipizzazione molecolare di Neisseria meningitidis Mix 1 Gene crga: 230 bp s.gr W-135: bp Mix 2 s.gr A: 400 bp s.gr Y: 120 bp Mix 3 s.gr B: 450 bp s.gr C: 250 bp 230 bp crga 450 bp s.gr B 250 bp s.gr C

24 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO S.C. Microbiologia A.S.O.U. San Giovanni Battista Tipizzazione molecolare di Neisseria meningitidis Da gennaio 2009: 53 Tipizzazioni Ceppi NM 38 Liquor con PCR

25 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO S.C. Microbiologia A.S.O.U. San Giovanni Battista Tipizzazione molecolare di Neisseria meningitidis Da gennaio 2009: 53 Tipizzazioni Ceppi NM 38 Liquor con PCR % 70% B C W-135 Y A 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

26 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO S.C. Microbiologia A.S.O.U. San Giovanni Battista Sierotipizzazione ceppi di Streptococcus pneumoniae La capsula è il principale fattore di virulenza Di distinguono circa 90 antigeni capsulari Circa un quarto sono frequentemente causa di malattia invasiva Si utilizzano: Pool di antisieri (n.12): checkerboard Antisieri di gruppo (n. 21) Antisieri di tipo (n. 25) Antisieri fattoriali (n.64)

27 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO S.C. Microbiologia A.S.O.U. San Giovanni Battista Sierotipizzazione ceppi di Streptococcus pneumoniae Sierotipizzazione di ceppi di S. pneumoniae isolati da sangue o liquor in pazienti da 0 a 14 anni di età 29 Laboratori ospedalieri 75 ceppi isolati nel periodo novembre 2007 novembre

28 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO S.C. Microbiologia A.S.O.U. San Giovanni Battista Sierotipizzazione ceppi di Streptococcus pneumoniae Sangue 67 Liquor 5 Altro 3 Infezioni invasive da S. pneumoniae

29 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO S.C. Microbiologia A.S.O.U. San Giovanni Battista Ceppi di Streptococcus pneumoniae identificati Da novembre 2007 a novembre 2011 NT 3% 9V 3% Altri (n.1) 16% 1 31% 23F 3% 22F 3% 19F 3% 6B 4% 7F 7% 19A 8% 14 16% 3 3%

30 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO S.C. Microbiologia A.S.O.U. San Giovanni Battista 25 Ceppi di Streptococcus pneumoniae identificati Da novembre 2007 a novembre Presente solo nel vaccino 7V Ceppi non vaccinali A 7F 6B 3 19F 22F 23F 9V NT A ltri (n.1) * *Altri: 1 solo isolamento per i sierogruppi: 5, 6A, 8, 7B/C, 15A, B e C, 18F, 19F, 23A e B, 33D e F

31 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO S.C. Microbiologia A.S.O.U. San Giovanni Battista Ceppi di Streptococcus pneumoniae Suddivisi per fasce di età <1 anno 1-5 anni >5 anni A 7F 6B 3 9V 22F 23F 19F

32 Confronto dei sierotipi regionali con i sierotipi nazionali SIEROTIPI % Isolati Piemonte % Isolati Italia A F F F A V 5 1 ALTRI 28 25

33 ATTIVITA DEL LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO S.C. Microbiologia A.S.O.U. San Giovanni Battista Stoccaggio e spedizione ceppi ricevuti dai laboratori della Regione all Istituto Superiore Sanità N. meningitidis S. pneumoniae Tipizzazione: Tipo e sottotipo MLST Studi di antibiotico-resistenza H. influenzae

34 Criticita e Conclusioni CLINICI DIALOGO ISTITUZIONI LABORATORI OSPEDALIERI LABORATORI DI RIFERIMENTO Corretta raccolta dei campioni clinici Rafforzare il ruolo dei laboratori nella diagnosi eziologica Corretta gestione dei campioni da inviare per analisi successive

35 Criticita e Conclusioni LABORATORIO REGIONALE DI RIFERIMENTO S.C. Microbiologia A.S.O.U. San Giovanni Battista DISPONIBILITA Rispondere alle esigenze dei clinici e dei laboratoristi Valutazione delle problematiche della sorveglianza epidemiologica MIGLIORAMENTO PCR su liquor: passaggio da un servizio di supporto epidemiologico ad un supporto di tipo diagnostico con TAT di 24 ore con test molecolari validati Identificazione mediante tecniche molecolari da ceppo o da campione di altri patogeni Diagnosi rapida di sepsi: ricerca DNA da sangue

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