Nella figura si vedono i cromosomi di un fibroblasto umano, colorati con specifiche sonde fluorescenti

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1 NUCLEO Il nucleo è la centrale operativa che controlla i vari processi che si svolgono dentro la cellula. Contiene il materiale genetico DNA e proteine. Quando la cellula è a riposo il DNA è sotto forma di CROMATINA. Quando la cellula sta per dividersi il DNA si condensa per formare CROMOSOMI.

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3 I territori dei cromosomi sono le posizioni ben definite che essi occupano nel nucleo della cellula e che può cambiare con la specializzazione della cellula Nella figura si vedono i cromosomi di un fibroblasto umano, colorati con specifiche sonde fluorescenti

4 Nel nucleo delle cellule eucariotiche i cromosomi interfasici occupano territori distinti; ben poco si sa sulla correlazione tra ordine strutturale della cromatina e funzionamento del genoma Studiando in modo tridimensionale il genoma umano e murino (cellule ES e cellule terminalmente differenziate), si è visto che il genoma dei mammiferi è suddiviso in specifici domini topologici (grandi megabasi) che sono una diffusa caratteristica strutturale dell organizzazione del genoma Analizzando 17 differenti tessuti di topo sono stati trovati presenti in tutti: piccoli domini con elevata espressione e regolazione genica, che contengono poche sequenze di ripetizioni di DNA e contengono anche geni housekeeping; - 29 grandi domini con bassa espressione e regolazione genica, che contengono molte sequenze ripetute di DNA e regioni prive o povere di geni Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions - Dixon et al. Nature, 485, , doi: /nature11082 Classification of topological domains based on gene expression and regulation - Genome Jul;56(7): Zhao J, Shi H, Ahituv N

5 I domini della cromatina sono regioni di genoma povere di eterocromatina, stabili nei diversi tipi di cellule e molto conservati tra le specie, costituiscono una proprietà intrinseca dei genomi dei mammiferi. I confini dei domini topologici sono ricchi di CTCF (proteina insulator che impedisce l interazione tra promotori ed enhancer), di geni housekeeping, di geni per trna, di retrotrasposoni e SINE, indicando che questi fattori hanno un ruolo nella strutturazione del genoma in domini topologici. La stabilità dei domini nei diversi tipi di cellule è sorprendente dato il funzionamento cellula-specifico della cromatina. La spiegazione è che l'organizzazione dei domini è stabile nei vari tipi di cellule, ma le regioni all'interno di ogni dominio sono dinamiche, per partecipare agli eventi regolatori specifici di ogni tipo di cellula. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions - Dixon et al. Nature, 485, , doi: /nature11082 Classification of topological domains based on gene expression and regulation - Genome Jul;56(7): Zhao J, Shi H, Ahituv N

6 La cellula è un sistema chimico di auto-organizzazione che utilizza dinamiche epigenetiche per regolare la funzione del genoma sulla base di una complessa regolazione per propagare la memoria del destino delle cellule L attività trascrizionale condiziona l avvolgimento tridimensionale della cromatina che si estende dai territori dei cromosomi Le regioni represse dei cromosomi tendono a stare vicine tra loro, mentre i domini attivi sono esposti al di fuori dei territori dei cromosomi, dando luogo a superdomini topologici composti da più domini funzionalmente simili La posizione dei territori è vincolata dalla loro associazione con la membrana nucleare, con gli hubs di trascrizione e con i cluster centromerici Functional implications of genome topology - Nat Struct Mol Biol Mar;20(3): doi: /nsmb Cavalli G, Misteli T.

7 Geni attivi nel nucleo per espressione e coregolazione genica. Questi geni sono nella eucromatina e si trovano in loop che si estendono al di fuori dei territori dei cromosomi. Colocalizzano sia in cis che in trans, sono riconosciuti dai fattori di trascrizione e trascritti dalla RNApol II.

8 Organizzazione del DNA in Cromatina

9 Organizzazione di Istoni e DNA nei Nucleosomi L ottamero di istoni è formato da due istoni H2A, due istoni H2B, due istoni H3 e due istoni H4. L istone H1 è il più grande e si trova sempre al di fuori del nucleosoma. la formazione dei nucleosomi è influenzata dalla sequenza del DNA; alterazioni del posizionamento dei nucleosomi portano a non funzionamento.

10 H1 Funzione Linker H2A H2B a-elica ISTONI: piccole proteine basiche, H3 variabile altamente H4 N conservata conservate

11 I nucleosomi variano nella composizione in istoni, possono incorporare istoni varianti e/o con modificazioni post-traduzionali delle catene laterali La struttura della cromatina non è così uniforme e regolare come era stato precedentemente ipotizzato Nelle cellule eucarioti il DNA genomico è impacchettato con una uguale massa di proteine per formare la cromatina Nucleosoma formato da un avvolgimento di DNA di ~ bp intorno ad un ottamero di istoni I nucleosomi formano lunghe sequenze che possono subire interazioni a corto raggio con nucleosomi vicini per formare le fibre di cromatina Successive interazioni fibra-fibra contribuiscono all elevato grado di compattazione osservato nei cromosomi New insights into nucleosome and chromatin structure: an ordered state or a disordered affair? - Luger et al. - Nature Reviews Molecular Cell Biology, 13, , doi: /nrm3382

12 La cromatina costituisce una barriera per i fattori di trascrizione e per tutte le proteine che possono legare DNA decompattazione complessi che rimodellano la cromatina compattazione

13 Gli istoni modificati legano specifiche proteine che hanno specifici domini: - bromodomini per legare gli istoni acetilati - cromodomini per legare i siti metilati - altri domini per legare i siti fosforilati, poli- ADP-ribosilati, ubiquitinati

14 L acetilazione degli istoni avviene sui gruppi R positivi delle lisine che si trovano nelle code degli istoni L acetilazione degli istoni allenta la struttura della cromatina e promuove l inizio della trascrizione Le istone acetiltrasferasi (HAT) catalizzano il trasferimento di un gruppo acetile dall acetil-coa alla coda dell istone, sia nei nucleosomi che nel citosol, per consentire l ingresso nel nucleo degli istoni di nuova sintesi Le istone deacetilasi (HDAC) catalizzano la deacetilazione ed inducono compattazione della cromatina e repressione della trascrizione

15 Le differenze tra i vari tipi di cellule di un organismo dipendono da differenze nell espressione di geni da un genoma identico I geni localizzati nell eterocromatina non sono espressi Le modificazioni degli istoni e del DNA influenzano sia la struttura della cromatina che l espressione genica

16 Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin - Nat Rev Neurosci Feb;14(2): doi: /nrn Gräff J, Tsai LH. Rappresentazione semplificata del rapporto tra cromatina aperta e chiusa. Nello stato trascrizionalmente permissivo la cromatina è caratterizzata da istoni iperacetilati e iperfosforilati ad opera di istoni acetil transferasi (HAT) e protein chinasi (PK). Queste modificazioni post-traduzionali creano una forza repulsiva tra istoni limitrofi e DNA che allenta la compattezza della cromatina per dare accesso al macchinario di trascrizione ed agli attivatori trascrizionali. La relazione tra metilazione degli istoni, catalizzata dalle istone metil transferasi (HMT) e le istone demetilasi (HDM) e la loro influenza sulla trascrizione genica è residuo-specifica. La metilazione del DNA (raffigurata a destra) si verifica su dinucleotidi CpG e la sua influenza sulla trascrizione del gene dipende dalla zona cromosomica in cui si verifica. Ac = acetil, Cr = crotonil, Me = metil, Me1 = monometil, Me2 = dimetil, Me3 = trimetil, P = fosfo, U = ubiquitil.

17 La posizione dei nucleosomi non è assoluta, ma soggetta a modifiche nel tempo attraverso il movimento spontaneo o attraverso l'azione di fattori di modellamento New insights into nucleosome and chromatin structure: an ordered state or a disordered affair? - Luger et al. - Nature Reviews Molecular Cell Biology, 13, , doi: /nrm3382

18 Il rimodellamento della cromatina può essere dovuto a modificazione chimica degli istoni oppure ad un effetto meccanico ATP-dipendente Modificazione degli istoni Modellatori ATP-dipendenti i ) ii ) iii ) iv )

19 I sistemi modellatori della cromatina ATP-dipendenti sono coinvolti in numerosi processi fondamentali come la trascrizione, la riparazione del DNA, la replicazione ed il mantenimento della struttura dei cromosomi Le loro funzioni sono regolate in una miriade di modi, tra cui modificazioni post-traduzionali e variazione della loro composizione in subunità proteiche The regulation of ATP-dependent nucleosome remodelling factors - Mutat Res May 1;618(1-2): Hogan C, Varga-Weisz P.

20 Modellatori della cromatina ATP-dipendenti scivolamento del nucleosoma

21 Modificazione della spaziatura tra nucleosomi

22 I complessi del poro nucleare (NPC) sono canali acquosi multiproteici che attraversano la membrana nucleare e collegano nucleo e citoplasma. Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissuespecific and developmental functions - Nat Rev Mol Cell Biol Nov;13(11): doi: /nrm Raices M, D'Angelo MA.

23 I complessi del poro nucleare (NPC) sono canali acquosi multiproteici che attraversano la membrana nucleare e collegano nucleo e citoplasma. Gli NPC, costituiti da copie multiple di circa 30 diverse proteine note come nucleoporine (NUPS), hanno una struttura complessiva che è conservata in tutte le cellule anche se nuove evidenze suggeriscono che la composizione proteica degli NPC varia nei diversi tipi di cellule e tessuti. Mutazioni delle nucleoporine possono causare malattie tessuto-specifiche. Gli NPC presentano eterogeneità di composizione/funzione dato che le cellule usano combinazioni delle nucleoporine per assemblare NPC con proprietà distinte e funzioni specializzate. Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue-specific and developmental functions - Nat Rev Mol Cell Biol Nov;13(11): doi: /nrm Raices M, D'Angelo MA.

24 Nei complessi del poro nucleare (NPC) le due membrane dell involucro nucleare sono fuse tra loro dall azione di proteine molto conservate, le nucleoporine (Nup), tra cui Nup53 che per le sue capacità deformanti le membrane è cruciale per il montaggio di NPC. Dimerization and direct membrane interaction of Nup53 contribute to nuclear pore complex assembly - Vollmer et al. - The EMBO Journal (2012) 31, doi: /emboj

25 NPC specializzati nel trasporto nucleare e nell'organizzazione del genoma. (a,b) schema dei nuclei di tre diversi tipi di cellule con NPC di composizione diversa, che trasportano cargo diversi o interagiscono con regioni cromosomiche diverse; (c) NPC con differenti composizioni possono coesistere nella stessa cellula. NPC con proprietà distinte possono essere utilizzati per specifiche funzioni cellulari ed avere un ruolo nell organizzazione tridimensionale del genoma. Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue specific and developmental functions - Nat Rev Mol Cell Biol Nov;13(11): doi: /nrm Raices M, D'Angelo MA.

26 Meccanismi di trasporto nucleare: (a) molecole più piccole di 40 kda (4-5 nm di diametro) passano attraverso il complesso del poro nucleare (NPC) per diffusione passiva senza riconoscimento specifico. Molecole più grandi (proteine ed alcuni mrna) si legano a recettori che riconoscono sequenze di localizzazione nucleare e sequenze di esporto dal nucleo; Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue-specific and developmental functions - Nat Rev Mol Cell Biol Nov;13(11): doi: /nrm Raices M, D'Angelo MA.

27 Meccanismi di trasporto nucleare: (b) ingresso nel nucleo: una volta legato il cargo nel citoplasma, le importine interagiscono con NPC, attraversano il canale di trasporto centrale. All'interno del nucleo legano una GTPasi (RAN GTP), induzione cambiamento conformazionale per il rilascio del cargo, il complesso importina/ran GTP trasloca nel citoplasma; Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue-specific and developmental functions - Nat Rev Mol Cell Biol Nov;13(11): doi: /nrm Raices M, D'Angelo MA.

28 Meccanismi di trasporto nucleare: (c) uscita dal nucleo: nel nucleo le esportine legano cargo e RAN GTP, e passano attraverso NPC per raggiungere il citoplasma. Nel passaggio, la proteina RANGAP induce RAN ad idrolizzare il GTP. Il risultante complesso RAN GDP interagisce nel citoplasma con il fattoredi trasporto nucleare NTF2 per traslocare di nuovo nel nucleo dove il fattore di scambio RCC1 media lo scambio tra GDP e GPT per riformare nuovamente RAN GTP. Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue-specific and developmental functions - Nat Rev Mol Cell Biol Nov;13(11): doi: /nrm Raices M, D'Angelo MA.

29 Interazione dinamica tra involucro nucleare e cromatina durante la riprogrammazione ed il differenziamento. Nelle cellule differenziate, l'involucro nucleare è regolare e rotondo. Le proteine della lamina nucleare, incluse le lamine A e B, sono strettamente disposte lungo la membrana nucleare interna. Di conseguenza, il genoma è organizzato in domini associati alla lamina (LAD) che costituiscono la maggioranza dell eterocromatina della periferia nucleare. La maggior parte dei geni associati al differenziamento sono localizzati tra i LAD lontano dalla membrana nucleare interna e rimangono trascrizionalmente attivi. Al contrario, le cellule staminali pluripotenti non esprimono le lamine A, e l'associazione delle lamine B con la cromatina è dinamico. Questo è associato con una morfologia nucleare deformata. Inoltre, lo spazio intermembrana dell'involucro nucleare è più ampio ed irregolare. Come risultato, il genoma è lassamente organizzato e raramente si osserva eterocromatina nella periferia nucleare. Inoltre, i geni specifici delle cellule staminali non sono localizzati nei LAD e sono attivati. Navigating the epigenetic landscape of pluripotent stem cells - Mo Li1 et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 13, , doi: /nrm3393

30 Le cellule di un organismo multicellulare pur avendo gli stessi geni, sono in grado di rispondere a segnali di differenziamento in modo variabile. Le cellule sono plastiche, sono in grado di eseguire la loro funzione specializzata pur mantenendo la capacità di adattarsi ai cambiamenti ambientali. Questo si realizza attraverso molteplici meccanismi che coinvolgono la regolazione diretta dello stato della cromatina in risposta a stimoli. E ancora poco conosciuto come le vie di trasduzione del segnale possano comunicare direttamente con cromatina per cambiare il paesaggio epigenetico, ma è sempre più evidente la possibilità che la cromatina agisca come sito di integrazione e di stoccaggio dei segnali. Nei mammiferi, le informazioni comunicate agli organi sensoriali sono trasmessi al sistema nervoso centrale, in cui l'informazione viene elaborata e convertita in una risposta fisiologica. A livello cellulare, le cascate di signalling trasmettono messaggi tramite proteine effettrici che raggiungono il nucleo, dove opportuni fattori di trascrizione attivano/inibiscono l espressione genica. Questo evento può essere di natura transitoria, ad esempio quando una cellula deve rispondere ad un evento acuto e poi tornare al suo precedente stato stazionario. Emerging roles for chromatin as a signal integration and storage platform - Nat Rev Mol Cell Biol Apr;14(4): doi: /nrm Badeaux AI, Shi Y.

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