FUNZIONE CELLULARE E TRAFFICO INTRACELLULARE

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1 FUNZIONE CELLULARE E TRAFFICO INTRACELLULARE

2 Come comunica la cellula con l esterno? Carboidrati proteine Glicolipide Regione ad α-elica di proteina transmembrana Acido grasso Doppio strato Lipidico 5-8 nm Proteina integrale di membrana Proteina periferica di membrana MODELLO A MOSAICO FLUIDO Singer e Nicolson, 1972

3 In che modo vengono smistate le proteine all interno della cellula?

4 Che cosa media il riconoscimento tra le cellule nell organizzazione tissutale?

5 Diffusione semplice, facilitata, trasporto attivo

6 Diffusione facilitata implica un cambiamento di conformazione della proteina carrier

7 Le proteine canale coinvolte nella diffusione facilitata di ioni presentano una struttura tale da consentire il passaggio degli ioni

8 Contro un gradiente di concentrazione o elettrochimico Trasporto attivo Uso di ATP La concentrazione del sodio è 143 mm all'esterno della membrana cellulare e 14 mm all'interno, mentre la concentrazione del potassio è dalle 10 alle 14 volte maggiore all'interno. Questo processo contribuisce ad evitare che vengano dissipati i gradienti ionici esistenti tra esterno e interno he stanno alla base della differenza di potenziale esistente tra ambiente intracellulare ed ambiente extracellulare

9 Destino di una cellula viene deciso in base a stimoli esterni (segnali) che interagiscono con molecole proteiche chiamate recettori

10 I «segnali» sono chiamati ligandi dei recettori

11 Esempio di segnalazione dipendente da contatto : i recettori Notch

12 Notch scoperto in Drosophila

13 Funzioni di Notch Survival (anti- Apoptosis) Proliferation It decides cell fate! Stemness Cell identity B or T cells

14 Esempio di segnalazione paracrina

15 Esempio di segnalazione paracrina L ossido nitrico innesca il rilassamento della muscolatura liscia nella parete dei vasi sanguigni

16 Esempio di segnalazione autocrina: citochina interleuchina-1 nei monociti. Quando viene prodotta in risposta ad uno stimolo esterno, si può legare ai recettori sulla superficie cellulare della stessa cellula che li ha prodotti. Esempio di segnalazione endocrina: estrogeni prodotti dalle ovaie hanno la ghiandola mammaria come target

17 I ligandi possono essere di natura idrofilica o idrofobica Idrofilici: citochina interleuchina-1 ormone peptidico glucagone idrofobici: ormoni steroidei

18 Recettori intracellulari legano il DNA

19 70 % dei tumori della mammella presenta il recettore estrogenico

20 Il tamossifene blocca l attività trascrizionale del recettore

21 I recettori di membrana trasducono un segnale all interno della cellula Il più delle volte la trasduzione del segnale utilizza reazioni di fosforilazione!!!

22 3 Tipi di recettori di superficie

23 b) Recettori legati a proteine G

24 Esempio : Attivazione proteina chinasi A (PKA) e i suoi substrati La proteina chinasi A (PKA) viene attivata da AMP ciclico

25 Recettori che attivano le proteine G: Attivazione proteina chinasi A (PKA) Tra le varie attività della PKA c è la fosforilazione di enzimi che porta al rilascio di glucosio (glucagone) o la fosforilazione della proteina CREB che attiva la trascrizione di geni target (ormone luteinizzante e sintesi di progesterone

26 Recettori che attivano le proteine G: Attivazione della proteina chinasi C (PKC) attivata da ormoni e neurotrasmettitori come acetilcolina, vasopressina ossitocina.

27 c) Recettori di membrana collegati ad enzimi

28 Recettori legati a enzimi

29 Il VEGF stimola l angiogenesi (ad esempio riparo tessutale) ma promuove la crescita di vasi all interno del tumore

30 Alcuni tumori al polmone hanno alti livelli di EGFR e possono essere bloccati con ligandi che bloccano il recettore

31 IGF-1 è implicato nell aumentato rischio di cancro in quanto induce la proliferazione cellulare Bowers Front. Endocrinol., 15 May 2015

32 Esempio: Recettori di membrana collegati ad enzimi- recettori che attivano la proteina ras

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34 a) Recettori che attivano canali ionici

35 Smistamento delle proteine nei compartimenti cellulari, esocitosi endocitosi Le vie principali

36 Folding e misfolding delle proteine (A) Una forma del globulo fuso del citocromo b 562 è più aperta e meno ordinata della forma finale ripiegata della proteina, mostrata in (B). Esperimenti hanno dimostrato che una volta che il dominio proteico di una proteina multidominio emerge dal ribosoma, forma nel giro di pochi secondi una struttura compatta che contiene la maggior parte della struttura secondaria finale (α eliche e foglietti β) allineata più o meno nel modo giusto. Per molti domini proteici, questa struttura insolitamente aperta e flessibile, che è chiamata globulo fuso, è il punto di partenza per un processo relativamente lento in cui avvengono molti aggiustamenti di catene laterali che alla fine formano la struttura terziaria corretta. Nonostante ciò, poiché ci vogliono alcuni minuti per sintetizzare una proteina di dimensioni medie, buona parte del processo di ripiegamento è completata quando il ribosoma rilascia l estremità C-terminale di una proteina.

37 Una visione corretta del ripiegamento delle proteine. Ciascun dominio di una proteina appena sintetizzata raggiunge rapidamente uno stato di globulo fuso. Il ripiegamento successivo avviene più lentamente e per vie multiple, comportando spesso l aiuto da parte di una proteina chaperone molecolare. Alcune molecole possono comunque non riuscire a ripiegarsi correttamente; queste sono riconosciute e degradate da proteasi specifiche. Chaperone molecolari aiutano a guidare il ripiegamento di molte proteine Le chaperoni molecolari sono state identificate per la prima volta nei batteri quando vennero studiati mutanti di E. coli che non permettevano al fago lambda di replicarsi al loro interno. Questi mutanti producono versioni leggermente alterate del macchinario chaperone e come risultato sono difettosi in passaggi specifici dell assemblaggio delle proteine virali.

38 Le chaperone molecolari sono incluse fra le proteine dello shock da calore (heat-shock proteins, di cui la loro designazione come hsp), perché sono sintetizzate in quantità enormemente maggiore dopo una breve esposizione delle cellule ad una temperatura elevata (per esempio, 42 C per cellule che normalmente vivono a 37 C). Ciò riflette l operazione di un sistema feedback che risponde a qualunque aumento di proteine ripiegate male (come quelle prodotte da temperature elevate) aumentando la sintesi delle proteine chaperone che aiutano queste proteine a ripiegarsi. Le cellule eucariotiche hanno almeno due famiglie principali di chaperone molecolari hsp60 e hsp70. Membri diversi della famiglia svolgono la loro funzione in organelli diversi. Così i mitocondri contengono le loro molecole hsp60 e hsp70 che sono distinte da quelle che agiscono nel citosol e una hsp70 speciale (chiamata BIP) aiuta a ripiegare correttamente le proteine nel reticolo endoplasmatico rugoso.. Il macchinario hsp70 agisce precocemente nella vita di molte proteine, legandosi ad una fila di circa 7 amminoacidi idrofobici prima che la proteina lasci il ribosoma.

39 Chaperone molecolari aiutano a guidare il ripiegamento di molte proteine Le proteine del tipo hsp60 formano una struttura a forma di botte che agisce più tardi nella vita di una proteina, dopo che è stata completamente sintetizzata. Questo tipo di chaperone forma una camera di isolamento in cui entrano proteine ripiegate non correttamente, impedendone l aggregazione e fornendo loro un ambiente favorevole in cui tentare di ripiegarsi.

40 Regioni idrofobiche esposte forniscono segnali cruciali per il controllo qualità delle proteine. Circa il 20% delle proteine vengono aiutate dalla hsp70 e il 10% dalle hsp60. In che modo queste proteine vengono scelte per questo ripiegamento catalizzato da ATP? Una proteina che ha un ampia zona di amminoacidi idrofobici esposta sulla superficie è in genere anormale: o non è riuscita a ripiegarsi correttamente dopo aver lasciato il ribosoma, o ha subito un incidente che l ha svolta parzialmente in un tempo successivo, o non è riuscita a trovare la subunità partner normale in un complesso proteico più grande. Una tale proteina non è semplicemente inutile per la cellula, può essere pericolosa. Molte proteine con una regione idrofobica esposta anormalmente possono formare aggregati, precipitando fuori dalla soluzione. In rari casi, questi aggregati possono provocare malattie molto gravi.

41 Folding e misfolding delle proteine

42 Quando tutti i controlli di qualità di una proteina falliscono, grossi aggregati proteici tendono ad accumularsi nella cellula colpita. Gli aggregati possono, adsorbendo su di essi macromolecole cruciali, danneggiare gravemente le cellula e causarne anche morte. Gli aggregati proteici rilasciati da cellule morte tendono ad accumularsi nella matrice extracellulare e, in casi estremi, possono anche danneggiare i tessuti. Il cervello, poiché è composto da un insieme altamente organizzato di cellule nervose, è altamente vulnerabile. Aggregati proteici nel cervello causano principalmente neurodegenerazione (malattia di Huntington e la degenerazione di Alzheimer causa di demenza correlata all età e colpisce più di 20 milioni di persone nel mondo d oggi. Molti aggregati proteici che causano problemi formano fibrille costituite da una serie di catene polipeptidiche che sono stratificate l una sull altra come pile continue di foglietti β (filamento cross-beta resistente alla proteolisi). Questa struttura si osserva in tanti disordini neurologici in cui produce depositi colorati in modo anormale noti come amiloide. Le proteine ripiegate in modo anormalo possono aggregarsi causando malattie umane distruttive. Una varietà particolare di questa malattia ha raggiunto una particolare notorietà: le malattie da prioni. A differenza delle malattie di Huntington e di Alzheimer, quella da prioni si può diffondere da un organismo all altro, purché il secondo organismo mangi un tessuto contenente l aggregato proteico. Una serie di malattie chiamate scrapie nella pecora, malattie di Creutzfeldt-Jacob (CJD) nell uomo e encefalopatia spongiforme bovina (BSE) nei bovini (morbo della mucca pazza) è causata da una forma male ripiegata e aggregata di una proteina chiamata PrP (proteina prionica). La PrP si trova normalmente sulla superficie esterna della membrana plasmatica, soprattutto nei neuroni. La sua funzione normale è sconosciuta ma ha la sfortunata proprietà di essere convertibile in una conformazione anormale molto speciale. Questa conformazione non soltanto forma filamenti cross beta resistenti alla proteolisi ma è anche infettiva perché converte molecole di PrP ripiegate normalmente nella stessa forma (da PrP a PrP*).

43 Nel nucleo e dal nucleo: sequenza di localizzazione, trasportatore e consumo di energia

44 Mitocondri

45 Dal citosol ai mitocondri-translocator Outer (Inner) Membrane TOM/TIM

46 Dal citosol al RER

47 Dal citosol al RER

48 Dal citosol al RER

49 Dal citosol al RER

50 Orientamento delle glicoproteine nelle membrane biologiche

51 Dal citosol al RER

52 NUCLEO MITOCONDRI CITOSOL PEROSSISOMA PLASTIDI RETICOLO ENDOPLASMATICO LISOSOMI ENDOSOMA GOLGI SUPERFICIE CELLULARE VESCICOLE SECRETORIE involucro nucleare TRAFFICO VESCICOLARE NELLE VIE SECRETORIE ED ENDOCITICHE La via secretoria (o esocitosi) maestra, diretta verso l esterno, arriva alla superficie cellulare via RER-Golgi. In alternativa si arriva ai lisosomi passando per gli endosomi. lisosoma RE endosoma tardivo endosoma precoce membrana plasmatica CITOSOL Molti dei polisaccaridi delle cellule sono prodotti dall apparato di Golgi come pure i glicosamminoglicani della matrice extracellulare reticolo cis pile reticolo trans apparato di Golgi vescicola secretoria VIA SECRETORIA VIA ENDOCITICA VIA DI RECUPERO

53 Lo smistamento ai vari organuli avviene tramite la formazione e trasferimento di vescicole indotte da proteine specifiche

54 Proteine coinvolte nella formazione delle vescicole Nel primo tratto della via secretoria COPII dal RE COPI dal GOLGI Successivamente CLATRINA dalla MEMBRANA PLASMATICA e tra ENDOSOMI e GOLGI

55 Le proteine SNARE e le Rab sulle vescicole e mediano il riconoscimento e la fusione delle vescicole alle membrane

56 Ruolo della clatrina nella formazione e smistamento delle vescicole

57 I lisosomi si formano a partire da vescicole che originano dal Golgi :ruolo del mannosio 6 fosfato

58 Esocitosi è il processo implicato nel trasporto dal Golgi alla membrana plasmatica e che porta alla secrezione di sostanze nello spazio extracellulare miscela di proteine smistamento SMISTAMENTO AI LISOSOMI MEDIATO DA SEGNALE recettore del mannosio 6 fosfato SECREZIONE COSTITUTIVA flusso verso la superficie Segnale come ormone o neurotrasmettitore Golgi VIA SECRETORIA REGOLATA Es: un accumulo di glucosio ematico segnala alle cellule pancreatiche di secernere ormone insulina.

59 TRAFFICO VESCICOLARE NELLE VIE ENDOCITICHE: pinocitosi e fagocitosi batterio fagosoma fagocitosi membrana cellulare Endosoma precoce endocitosi ENDOSOMA TARDIVO LISOSOMA R. E. mitocondrio autofagosoma autofagia

60 La clatrina è implicata anche nell endocitosi, il processo di trasferimento di materiale all interno della cellula attraverso un invaginazione della membrana plasmatica: esempio del colesterolo (pinocitosi)

61 Ingresso del colesterolo: Endocitosi mediata da recettori

62 Meccanismi di adesione cellulare Adesione fra cellule

63 Adesione fra cellule e fra cellule e matrice extracellulare è stabilizzata da giunzioni cellulari specializzate Giunzioni strette- sigillano e materiale non può passare attraverso spazio tra le cellule Giunzioni aderenti- collegate all actina- funzione meccanica Giunzioni comunicanti- consentono il passaggio di alcune molecole

64 Matrice extracellulare Matrice extracellulare è l ancoraggio delle cellule di un tessuto and un substrato comune 1) funzione di sostegno, mantenimento forma e mobilità cellulare (epitelio poggia sulla lamina basale) 2)costituita da proteine strutturali (collagene, elastina) o adesiva (fibronectina) immerse in una rete di proteine altamente idratate i (proteoglicani) 1) nell osso (sali insolubili di calcio)-connettivo-cartilagine la matrice cellulare è caratterizzata da una particolare rigidità.

65 Proteine della matrice extracellulare Collagene funzione strutturale- resistente non elastico Elastina- conferisce elasticità alla parete dei vasi Proteoglicani proteine legate a glucosammine altamente idratate funzione da «cuscinetto Fibronectina ancora le cellule alla matrice cellulare

66 Le integrine collegano le cellule alla matrice extracellulare e sono collegate al citoscheletro

67 Le integrine attivano anche geni che inducono proliferazione cellulare