RETE REGIONALE DELL EMILIA-ROMAGNA DI MONITORAGGIO DELLA MUTAGENICITA DEL PARTICOLATO ATMOSFERICO URBANO: RIMINI ( )

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1 Monitoraggio della mutagenicità del particolato atmosferico urbano Rimini (-1): Sezione Provinciale di Parma Via Spalato, Parma Tel. 21/ Fax 21/ sez@pr.arpa.emr.it Il Dipartimento Tecnico della Sezione Provinciale di Parma è accreditato SINAL per l'esecuzione di prove con n 2 Specializzazione Mutagenesi Ambientale ed Occupazionale Tel.21/ Fax 21/ RETE REGIONALE DELL EMILIA-ROMAGNA DI MONITORAGGIO DELLA MUTAGENICITA DEL PARTICOLATO ATMOSFERICO URBANO: RIMINI (-1) I INTRODUZIONE Nel 1 è proseguito a Rimini il monitoraggio della mutagenicità del particolato atmosferico urbano, frazione PM 2,, iniziato nell agosto. La stazione di campionamento di tale frazione è situata in via Abete (zona a media intensità di traffico veicolare). MATERIALI E METODI Campionamento ed estrazione particolato atmosferico Il prelievo viene effettuato ad una altezza di circa 3 metri da terra.

2 Per il campionamento di particolato con diametro aerodinamico inferiore a 2. µm (PM 2.. ) si utilizza un campionatore giornaliero dotato di testa di prelievo per PM e impattore per PM 2, costruiti secondo norme EPA. Il particolato utilizzato per i test di mutagenesi è raccolto su filtri in borosilicato senza leganti organici; il campionamento è continuo per tutte le 24 ore. Il flusso di aspirazione è di circa l/min. Il campione mensile è dato dall'insieme dei filtri giornalieri. Ogni campione viene estratto, tramite apparato Soxhlet, in acetone (Acetone RS per pesticidi, Carlo Erba Milano). Il solvente viene evaporato mediante rotavapor ed il residuo secco è risospeso in dimetil-solfossido (DMSO RPE-ACS, Carlo Erba Milano) per ottenere un rapporto costante ( m 3 /ml) tra il volume dell'aria e il volume dell'estratto nel periodo in esame. Test di mutagenesi Gli estratti di particolato atmosferico vengono sottoposti a test di mutagenesi sui ceppi TA98 e TA di Salmonella typhimurium (metodo di incorporazione in piastra) in accordo con i metodi standard (Maron DM, Ames BN. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutat Res 1983; 113: 173-2). Il principio del test di Ames si basa sulla retromutazione in quanto utilizza ceppi di Salmonella typhimurium recanti ognuno un diverso tipo di mutazione nell operone che codifica per la biosintesi dell istidina e la positività viene valutata sul numero dei revertenti, cioè sul numero dei batteri che riacquistano il fenotipo del ceppo originale. L utilizzo di due ceppi di Salmonella typhimurium permette di evidenziare diversi tipi di danni genetici a livello di una o poche coppie di basi nel DNA (mutazioni puntiformi); in particolare il ceppo TA98 rileva mutazioni per inserzione o delezione di basi mentre il ceppo TA rileva mutazioni per sostituzione di basi. Per distinguere le sostanze che per esercitare la loro azione mutagena devono essere metabolizzate (mutageni indiretti o promutageni), come ad esempio gli Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA), da quelle che possono agire sul DNA direttamente (mutageni diretti), come ad esempio i nitroderivati degli IPA, tutti i test su S. typhimurium vengono condotti con e senza attivazione metabolica esogena. A tal fine si utilizza la frazione microsomiale epatica di ratto S9 ottenuta da ratti nei quali è stata stimolata l attività degli enzimi epatici ( S9 ottenuto da ratti indotti con Aroclor124. MOLTOX USA). Per ogni campione si saggiano cinque concentrazioni e per ogni concentrazione si eseguono tre repliche indipendenti. I revertenti vengono contati dopo 48 ore di incubazione delle piastre in termostato a +37 C.

3 Valutazione e rappresentazione dei dati La valutazione della ripetibilità delle tre repliche indipendenti viene effettuata mediante l applicazione del fattore di copertura sperimentale Kp (ISO/TR 13843: Water quality guidance on validation of microbiological method ). La mutagenicità dei campioni di particolato atmosferico viene determinata considerando solo il tratto lineare delle curve dose/risposta al fine di eliminare l interferenza dovuta all eventuale presenza di effetto tossico o altri effetti inibenti l attività mutagena dei campioni (Bernstein L, Kaldor J, McCann J, Pihz MC. An empirical approach to the statistical analysis of mutagenesis data from the Salmonella test. Mutat Res 1982; 97: ). Per stabilire la positività (mutagenicità) dei campioni di particolato si applica il criterio del raddoppio cioè un campione si considera positivo quando il rapporto tra il numero dei revertenti indotti e il numero dei revertenti spontanei è > 2 (Chu KL, Patel KM, Lin AH, Tarone RE, Linhart MS, Dunkel VC. Evaluating statistical analysis and reproducibility of mutagenicity assay. Mutat Res 1981; 8: ). Per l analisi quantitativa si ricava il valore dei revertenti/nm 3 di aria che è rappresentato dal coefficiente angolare della retta di regressione dei valori relativi al numero di revertenti riscontrati in ciascuna delle piastre, per ogni dose (m 3 di aria aspirata equivalenti). Per rappresentare l effetto mutageno totale dei diversi campioni si utilizza il Fattore di Genotossicità che si ottiene sommando gli effetti dei test considerati. Per calcolare questo parametro vengono utilizzati i rapporti tra i valori dei trattati e dei loro rispettivi controlli (Rossi C, Poli P, Buschini A, Campanini N, Vettori MV, Cassoni F. Persistence of genotoxicity in the area surrounding an inceneration plant. Toxicol Environ Chem 1992; 36: 7-87). RISULTATI Osservando, in generale, l evoluzione temporale della mutagenicità del particolato atmosferico (Fig1) si riscontra un tipico andamento stagionale con valori più elevati nei mesi autunno-invernali con un aumento nei mesi di ottobre e novembre 1 rispetto ai corrispondenti periodi dell anno precedente ed una diminuzione, invece, nel mese di agosto. I valori di mutagenicità riscontrati non sono, tuttavia, particolarmente elevati, soprattutto se confrontati con quelli degli altri nodi della rete regionale. Considerando l evoluzione della mutagenicità espressa come numero di revertenti/nm 3 (Fig2), si nota che la sensibilità dei diversi test utilizzati non si mantiene costante nel tempo, evidenziando variabilità, anche per quanto riguarda l aspetto qualitativo, nella presenza delle sostanze mutagene associate al particolato.

4 Per verificare una eventuale correlazione tra le concentrazioni di CO e di NO 2, rilevate nello stesso sito di campionamento del particolato, e il numero di revertenti/nm 3 (Fig3) ottenuti con i singoli test, sono state costruite le corrispondenti rette di regressione. Non si è riscontrata correlazione nel periodo di campionamento agosto-dicembre1. Infatti questi inquinanti, anche se sono, in generale, dei buoni indicatori di inquinamento da traffico e a volte possono essere anche dei buoni descrittori dell andamento della mutagenicità del particolato atmosferico per un determinato sito, non possono essere presi come indicatori della mutagenicità associata al particolato atmosferico. I dati relativi alla mutagenicità del particolato atmosferico urbano campionato a Rimini e del particolato campionato negli altri nodi della rete regionale sono pubblicati nel sito Internet: LA RESPONSABILE DELLASPECIALIZZAZIONE Dott.ssa Francesca Cassoni IL RESPONSABILE DEL DIPARTIMENTO TECNICO Dr. Gianmarco Curti

5 FG ago- 3,7 Range FG Giudizio set-,6 ott-,7, - 1,4 negativo nov- 2,4 dic- 4,2 1, - 2,9 debolmente positivo gen-1 6,2 feb-1 2, 3, - 14,9 positivo mar-1 3 apr-1,4 > fortemente positivo mag-1,3 giu-1 lug-1,2 ago-1,8 set-1,6 ott-1 6,7 nov-1 3,9 dic-1 4,3 Intervalli di positività del Fattore di Genotossicità calcolato in base a tutti i test eseguiti sui ceppi TA98 e TA di Salmonella typhimurium con e senza attivazione metabolica esogena. Rimini Fattore di Genotossicità dic-1 nov-1 ott-1 set-1 ago-1 lug-1 giu-1 mag-1 apr-1 mar-1 feb-1 gen-1 dic- nov- ott- set- ago- Fig.1 - Rete Regionale di Monitoraggio della Genotossicità del particolato atmosferico urbano (PM 2, ), ARPA - Emilia Romagna. Stazione di rilevamento:rimini; via Abete. Evoluzione temporale della Genotossicità del particolato atmosferico urbano (PM 2, ) rilevata come Fattore di Genotossicità su tutti i test in Salmonella typhimurium. Elaborazione: Specializzazione"Mutagenesi Ambientale ed Occupazionale", Arpa Emila-Romagna, Sezione Provinciale di Parma

6 PM2, revertenti/m 3 TA98 TA98+ TA TA+ ago- 2 9 set ott- 1 4 nov dic- 4 7 gen feb mar apr mag giu lug ago set ott nov dic Rimini Revertenti/m 3 aria ago- set- ott- nov- dic- gen-1 feb-1 mar-1 apr-1 mag-1 giu-1 lug-1 ago-1 set-1 ott-1 nov-1 dic-1 TA98 TA98+ TA TA+ Fig.2 - Rete Regionale di Monitoraggio della Genotossicità del particolato atmosferico urbano (PM 2, ), ARPA - Emilia Romagna. Stazione di rilevamento:rimini, via Abete. Evoluzione temporale della Genotossicità del particolato atmosferico urbano (PM 2, ) rilevata attraverso l'induzione di revertenti/m 3 aria in Salmonella typhimurium ceppi TA98 e TA con (+) e senza attivazione metabolica esogena. Elaborazione: Specializzazione"Mutagenesi Ambientale ed Occupazionale", Arpa Emila-Romagna, Sezione Provinciale di Parma

7 R 2 =,1 NO 2 (ago-dic1) TA98 R 2 =,2 NO 2 (ago-dic1) TA R 2 =, NO 2 (ago-dic1) TA R 2 =, NO 2 (ago-dic1) TA R 2 =,1 CO (ago-dic1) TA98 R 2 =,2 CO (ago-dic1) TA98+, 1 1, 2, 1 1, 2 R 2 =, CO (ago-dic1) TA R 2 =,1 CO (ago-dic1) TA+, 1 1, 2, 1 1, 2 Fig.3 - Rete Regionale di Monitoraggio della Genotossicità del particolato atmosferico urbano (PM 2, ), Arpa Emilia-Romagna. Stazione di rilevamento: Rimini, via Abete. Correlazioni tra le concentrazioni di CO, NO 2 e i revertenti/nm 3 di aria rilevati nel periodo indicato.