Scheda di presentazione del progetto. Titolo del progetto Applicazioni dell'elettroforesi capillare nella ricerca e diagnostica oncologica
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1 Scheda di presentazione del progetto Titolo del progetto Applicazioni dell'elettroforesi capillare nella ricerca e diagnostica oncologica Obiettivi del progetto Lo scopo di questo progetto e quello di sviluppare e mettere a punto metodiche di elettroforesi capillare sia per l'attività di ricerca che per I'attività diagnostica. L'applicazione di queste nuove metodiche sarà rivolta allo studio della clonalità nei disordini linfoproliferativi e allo studio della instabilità dei microsatelliti in patologie selezionate. Responsabile del ruggiungimento degli obiettivi del progetto Prof. Lorenzo Leoncini. Descrizione del progetto Fra le varie metodiche di biologia molecolare, senz'altro, la "Polymerase Chain Reaction" (PCR) è quella che trova maggiore impiego nella pratica quotidiana della diagnosistopatologica. Il patologo, infatti, si trova spesso ad utilizzare tessuti che, per le procedure di campionatura e le metodiche di trattamento, non possono fornire DNA o RNA utlhzzabtle con tecniche classiche quali il Southern o il Northern Blot. La metodica di PCR, che permette dr utthzzare anche piccole sequenze di DNA, si basa sul concetto che una sequenza nucleotidica puo essere amplificata numerose volte fino ad ottenere un numero di copie pari almeno a 106. L'amplificazione del DNA per mezzo della PCR non è limitata al solo DNA genomico, ma puo essere applicata anche al DNA complementare, sintetizzato dal RNA usando una reazione di trascrizione inversa. La PCR rappresenta quindi 1'approccio migliore per I'identificazione di sequenze di DNA, la caratterizzazione genica e per I'analisi dei livelli di espressione genica. Uno dei metodi per poter separar e studiare i vari frammenti del prodottodi PCR e I'elettroforesi capillare (CE) La CE a differenza dell'elettroforesi classica viene eseguita su colonna similmente ad una cromatografia, il tutto awiene in modo automatizzato. I1 sistema consiste di uno strumento per I'elettroforesi collegato ad un computer che mediante software specifico permette di acquisire i dati e dt analizzarli Questo strumento permette di effettuare sia analisi delle sequenze del DNA sia analisi GeneScan ed in entrambi i casi vengono utilizzati traccianti fluorocromati invece dei normali traccianti radioattivi. I frammenti di DNA marcati sono sottoposti ad elettroforesi attraverso il materiale polimerico contenuto nel capillare e si separano secondo le loro dimensioni Mentre passano dal capillare vengono illuminati dal laser attraverso una finestra di rivelazione, i coloranti fluorescenti, ancorati al DNA, passano ad uno stato eccitato ed emettono una radiazione ad una specifica lunghezza d'onda. La CE va sempre piu sostituendo i metodi classici dell'elettroforesi su gel, PAGE (poliacrylamide gel elettrophoresis), Southern Blotting. Essa e carattertzzata da un'alta sensibilità e dalla possibilità di analizzare piccole quantità di campione con la minima quantità di reagenti Inoltre si possono analízzare tessuti non ideali, come campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina e fare un' analisi quantitativa o semiquantitativa tramite la valutazione dell'altezza di picchi e dell'area descritta dai picchi stessi Oggi la CE automatizzata e ampiamente utllizzata sia nella diagnostica che nella ricerca. I campi di applicazione piu diffusi sono -DNA sequencing -Analisi di DNA Frasment o Restriction Patterns (RFLP)
2 -Analisi di Microsatelliti -Analisi di Single-strand Conformation Polymirphism (SSCP) Il sistema CE, insieme al multi-array capillaries, sarà in futuro la tecnica di elezione per analizzare contemporaneamente la sequenza di un grande numero di campioni. L'analisi dei frammenti di DNA tramite CE viene utihzzata per determinare la presenza di mutazioni, polimorfismi e siti di restrizione in una sequenza genica. A differenza del DNA sequencing, l'analisi dei frammenti prevede l'utilizzo di primers fluorocromati nella reazione standard di PCR in modo tale che il frammento di interesse viene subito vrsualtzzato e quindi analizzato. Usando questa tecnica si puo contemporaneamente, e molto rapidamente, distinguere tra un prodotto di PCR normale e uno mutato. La SSCP combinata con la CE fornisce un valido aiuto per la determinazione di mutazioni note e non, su grandi numeri di campioni e soprattutto per studi di screening. Per quanto riguarda le applicazioni di ricerca e di diagnosi in campo oncologico la CE viene utrhzzata per'. -Determinazione delle aberrazioni cromosomiche -Studio della instabilità dei microsatelliti (MSI) -Studi di clonalità -Determinazione di tumor-related mutations e Single nucleotide Polymorphisms (SNPs). La nostra attività di ricerca, con le sue possibili applicazioni diagnostiche, sarà rivolta allo studio della clonalità come supporto alla diagnosi nei disordini linfoproliferativi e allo della MSI in patologie selezionate. Entrambi gli studi verranno condotti con le queste nuove metodiche di CE precisamente GeneScan analysis e Sequencing Analysis. Impatto su altre linee di ricerca. Le attività sopra descritte andranno ad integrarsi ed a favorire lo sviluppo di altri progetti gia presenti nel Dipartimento di Patologia Umana e Oncologia, come lo studio della instabilità dei microsatelliti nel carcinoma del colon retto e gli studi di clonalità nei disordini linfoproiiferativi Per quanto riguarda lo studio della clonalità, nel nostro laboratorio si stanno portando avanti progetti di ricerca che possono, poi, essere applicatin campo diagnostico al fine di migliorare la diagnosi nei disordini linfoproliferativi. Quest'ultimi sono generalmente diagnosticati in base a criteri istomorfologici e immunofenotipici Spesso questi metodi non sono conclusivi per una corretta diagnosi. Nel 5-10% dei casi, infatti, la diagnosi differenziale tra lesione reattiva e linfoma maligno è molto diffrcoltosa, lo studio della clonalità dei riarrangiamenti dei geni delle immunoglobuline (Ig) e del T-cell receptor (TCR) diventa un valido aiuto. Partendo dal presupposto che tutte le cellule tumorali abbiano come progenie una singola cellula trasformata e nel caso dei linfomi e delle leucemie questa cellula sia una cellula linfoide, e possibile discriminare tra un processo reattivo policlonale e una proliferazione neoplastica monoclonale. Recentemente, in Europa, e stato condotto uno studio multicentrico per la standardtzzaztone di protocolli di multiplex-pcr per I'analisi dei riarrangiamenti dei geni delle Ig e del TCR a cui ha partecipato anche il Dipartimento di Patologia Umana e Oncologia (BIOMED-2 Concerted Action BHM4-CT-3936). La clonalità e stata dimostrata nel99o/o nelle patologie maligne a cellule B e nel 94% nelle patologie maligne a cellule T, mentre la grande maggioranza delle lesioni reattive mostrano un andamento policlonale. Lo scopo del nostro progetto di ricerca e quello di utilizzare i protocolli BIOMED-2 per lo studio di materiale fissato in formalina e incluso in paraffina Molti studi hanno dimostrato che il DNA estratto da questi tessuti puo essere amplificato al massimo fino a 400bp. Sarà necessario mettere a punto una metodica di PCR che ci permetta di effettuare dei controlli di qualità del DNA stesso, amplificando esoni di geni controllo. Per quanto riguarda la scelta dei primers, essa sarà fatta tenendo conto che dovranno amplificare sequenze di DNA non molto lunghe e dovranno riconoscere la maggior pare dei segmenti genici funzionali dei geni delle IGH e del TCR. I primers selezionati serviranno per amplificare: IGH completo (VH-JH), IGH
3 incompleto (DH-JH), IGK (VK-JK e I riarrangiamento Kde), IGL (V)"-J).), TCRB completo (VB- JB), TCRB incompleto (DB-JB), TCRG (Vy-Jy) e TCRD. Verranno messe a punto delle multiplex- PCR in accordo con iprotocolli standard. Il metodoutllizzato per discriminare tra prodotto di PCR monoclonale policlonale sarà quello della GeneScan fragment analysis. In caso di proliferazione reattiva non-clonale I'analisi di GeneScan darà una curva Gaussiana, mentre la popolazione linfoide clonale sarà rappresentata da un picco monoclonale del prodotto di PCR. I microsatelliti sono sequenze altamente polimorfiche, sparse lungo tutto il genoma umano, costituite da ripetizionin tandem di una subunità rappresentata da due, tre o quattro nucleotidi Essi sono diventati recentemente di grande interesse oncologico perche coinvolti nello sviluppo di una forma ereditaria di carcinoma del colon (sindrome HNPCC. Hereditary Nonpolypous Colorectal Cancer). Individui affetti da sindrome HNPCC mostrano "instabilità genetica"generalizzata che si evidenzia con la perdita della normale replicazione delle sequenze satellite nel DNA tumorale rispetto al DNA normale (fenotipo RER+) Recentemente sono stati clonati i geni responsabili di questa sindrome: essi sono coinvolti nel sistema del"dna mismatch repair" (MLHI, MSH2, MSH6, PMSI, PMS2) responsabili cioe della corretta replicazione del DNA, inclusa la stabilizzazione delle sequenze microsatellite. Tali geni sono costitutivamente mutati (mutazioni germinali) nei pazienti HNPCC causando una generahzzafa instabilità genetica ed un aumento della frequenza di mutazione. L'aherazione in lunghezza di sequenze microsatellite, interne o adiacenti a geni del controllo della proliferazione cellulare, puo modificare qualitativamente o quantitativamente il prodotto dei geni stessi, giocando così un ruolo nella tumorigenesi. Fra i vari tipi di tumori finora studiati, mostrano instabilità genetica il carcinoma dello stomaco, dell' endometrio, del tratto biliopancreatico e dell' apparato urinario. Nel dipartimento di Patologia Umana e Oncologia, la MSI viene studiata su tessuti freschi di pazienti con carcinoma del colon-retto. Questo progetto, invece, sarà rivolto allo studio di pazienti con diversi tipi di tumore e l'analisi verrà effettuata su materiale fissato in formalina e incluso in paraffrna. Per lo stesso pazrente l'analisi sarà effettuata sia sul DNA normale che su quello tumorale e i risultati confrontati In caso di elevata instabilità (MSI-H), definita dal protocollo di Bethesda come bandshift di 2 o piu microsatelliti, che depone per un rischio di familiarità per mutazioni dei geni codificanti le proteine del " DNA mismatch repair", verrano studiate quest'ultime in modo da identificare il gene interessato. I microsatelliti da analizzare verrano selezionati, a seconda del tipo di tumore, servendosi del pannello della Consensus Conference del National Cancer Institute di Bethesda. Il materiale esaminato sarà DNA genomico estratto da tessuto normale e patologico proveniente da sezioni di tessuto fissato in formalina e incluso in paraftìna, sezionato, raccolto su vetrino e infine prelevato con microdissettore laser. Impatîo sulle slrutlure organizzaíive coinvolte nel progetto. Nell'ambito dei progetti di ricerca condotti in collaborazione con settori disciplinari affini presenti nell'ateneo (MED/6, MED/8, MED/i5, MED/I8, MED/46) la messa a punto di nuove metodich e I'interpretazione dei risultati contribuirà ad awalorare i dati raggiunti. Inoltre la possibilità di mettere a disposizione tecniche sempre piu aggiornate puo contribuire a migliorare la qualità della didattica in campo biomedico. Altri soggetti beneficiuri dei rísultati del progetto L'inscindibilità tra attività didattica e di ricerca e attività assistenziale prevista all'interno dei Dipartimenti ad Attività Integrata (DAI), cioè le strutture organizzatle dell'azienda Ospedaliera Universitaria, rende naturale I'applicazione in campo diagnostico delle metodiche sviluppate nell'ambito del progetto di ricerca illustrato, come awiene in tutti i piu grandi centri di diagnosi e cura in campo oncologico. Tempi previsti per la reuliuazione del progetto Data di inizio del PROGETTO Data di ultimazione del PROGETTO:
4 Durata del PROGETTO: 60 mesi Risorse umune, strumenîuli e servizi coinvolti In questo progetto saranno coinvolti i docenti responsabili di altri progetti di ricerca che sono assimilabili allo stesso (Marcella Cintorino, Maria Teresa del Vecchio, Franco Roviello, Enrico Pinto, Piero Tosi); verrà coinvolto anche personale non docente in servizio presso i laboratori del Dipartimento (Nazzareno Palummo, Lorenzo Pacenti, Rosella Vatti) Gli strumentr utllizzati saranno quelli del Laboratorio di Biologia Molecolare del Dipartimento di Patologia Umana E Oncologia. Essi comprendono, oltre alla comune attrezzafura presente nei laboratori: - piccola strumentazione (termocícltzzatorr. centrifughe, apparati per elettroforesi); - grandi attrezzature (sistema per elettroforesi capillare ABI PRISM 310 Applied Biosystem, microdissettore laser Arcturus) Risorse umane coinvolte Professionalità individuata. n. 1 unità di personale di area tecnica, cat. D, con conosc'enze approfondite di tecniche di biologia molecolare e cellulare nell'ambito dello sviluppo ed applicazione di metodologie strumentali in campo biomedico; Titolo di studio previsto: Diploma universitario Laurea triennale. Si fa presente che I'attività si dovrà svolgere in regime convenzionale con il Servizio Sanitario Nazionale. Attività da svolgere all'interno del progetto: Attuazione dei seguenti punti previsti dal progetto: l) Selezione dei casi da analizzare, estrazione del DNA e controllo della qualità del DNA estratto; 2) Messa a punto delle tecniche per I'amplificazione dei geni Ig\T{, TCR; 3) Scelta dei primers ed amplificazione delle sequenze microsatellite; 4) Ottrmizzazione dell'elettroforesi capillare, 5) Analisi delle GeneScan. Programmazio ne pluriennule dell' attività Descrizione Íasi e sotlo-fasi del Progetto Data nrevista inizio attività Data nrevista fine attività Selezione dei casi da analizzare, estrazione del DNA dai tessuti includi in paraffina, controllo della qualità del DNA estratto, determinazione della quantità t per la successiva amplificazione.
5 Messa a punto delle tecniche per I'amplificazione dei geni IgVH, TCR, tramite PCR (Polimerasi Chain Reaction). Scelta dei prlmers e amplificazione delle sequenze microsatellite su tessuti provenienti da vari tipi di tumori che mostrano instabilità genetica come il cancro del colon retto, il cancro dello stomaco, dell'endometrio, del sistema biliopancreatico e del sistema urinario. Otttmizzazione ell' elettroforesi capillare (GeneScan) e applicazione di essa ai prodotti di PCR Analisi delle GeneScan ed interpretazione dei risultati I Approvato dal Consiglio di Dipartimento con delibera n del Il responsabile del progetto (Prof. Lorenzo Leoncini),.0.,. r e-, t {'' ( " 1,() (- (---- Il Direttore del Dipartimento (Prof.ssa Marcella Cintorino) Siena,
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