BIOTECNOLOGIE pag 1 di 12 POS VIR 001 INT rev. 0 del 05/02/2008 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): MONITOR PCR HMG

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1 BIOTECNOLOGIE pag 1 di 12 Redatto: F.Gatto Verificato Responsabile Struttura Semplice: I.M.Ciabatti Verificato RQ: M.Guarducci Approvato Responsabile di Struttura Complessa: D.Amaddeo

2 BIOTECNOLOGIE pag 2 di Scopo Lo scopo della presente procedura è quello di descrivere le responsabilità e le modalità operative per la rilevazione di mais (Zea mays) in matrici agro-alimentari mediante metodiche di PCR real time. 2. Campo di applicazione La presente procedura è applicata a DNA estratto da matrici agro-alimentari contenenti, costituite o derivate da mais per la rilevazione di Zea mays e la valutazione quali-quantitativa del DNA estratto. Nel caso in cui il DNA di mais venga rimosso o altamente degradato durante il processo produttivo della matrice agro-alimentare, il metodo non fornisce risultati affidabili. 3. Definizioni ed abbreviazioni - bp (base pairs): coppie di basi - Controllo LOD: DNA estratto da un materiale di riferimento a base di mais utilizzato ad un quantitativo corrispondente al LOD (limite di rilevazione) - Ct o ciclo soglia: ciclo al di sopra del quale la fluorescenza misurata supera un valore soglia e si distingue dal rumore di fondo. - DNA bersaglio endogeno: tratto di DNA caratteristico della specie vegetale analizzata, presente in un numero di copie costante e conservato nelle diverse varietà vegetali di quella specie. - LOD (limit of detection): limite di rivelazione - NTC (no template control): controllo negativo di PCR - OGM (Organismi Geneticamente Modificati): organismi il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto si verifica in natura con l accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale. - PCR (Polymerase Chain Reaction): reazione enzimatica in vitro, catalizzata da DNA polimerasi DNA dipendenti, che determina l amplificazione del DNA bersaglio. - Primer: oligonucleotide, che riconosce una sequenza specifica del DNA bersaglio, utilizzato per innescare la reazione di PCR. - Probe o sonda: oligonucleotide marcato che riconosce una sequenza specifica del DNA bersaglio rivelandone la presenza. - Real Time PCR: tipologia di PCR in cui il sistema di rilevazione, avvalendosi di sonde marcate con fluorocromi specifiche per il prodotto di amplificazione, consente di seguire ciclo dopo ciclo l andamento della reazione. 4. Riferimenti - ABI Prism 7900HT Sequence Detection System and SDS Enterprise Database User Guide - Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System and SDS Enterprise Database User Guide

3 BIOTECNOLOGIE pag 3 di 12 - Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing - European Network of GMO Laboratories (ENGL) Version ( - DO VIR Documento Organizzativo - Event-specific method for the quantitation of maize line TC1507 using real-time PCR Protocol 2005 ( - Event-specific method for the quantitation of maize line TC1507 using real-time PCR Validation Report 2005 ( - IGR VIR 001 Istruzione gestione reagenti - IL VIR 002 Creazione di file TEMPLATE.sdt - ISO/FDIS 24276: 2006 Foodstuffs Nucleic acid based methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products general requirements and definition - PG QUA 011 Validazione dei metodi e stima dell incertezza di misura - PG QUA 005 Gestione dei documenti - PG VIR 001 Ricevimento, analisi, conservazione e smaltimento di campioni ufficiali prelevati per la ricerca di organismi geneticamente modificati (OGM) - PG VIR 003 Gestione delle aree e delle attività per l esecuzione dei protocolli di PCR - POS VIR 015 SUP Estrazione di DNA con la metodica CTAB precipitante - POS VIR 016 SUP Estrazione di DNA con Dneasy Plant Maxi Kit - POS VIR 052 SUP Estrazione di DNA con la metodica CTAB - POS VIR 053 SUP Estrazione di DNA con Dneasy Plant Mini Kit - The fitness for purpose of analytical methods, EURACHEM Guide, Moduli allegati - POS VIR 001 INT/1 - FOGLIO DI LAVORO - ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): 6. Principio Il DNA estratto e purificato dal campione da sottoporre a prova è amplificato enzimaticamente e rilevato mediante l impiego di una coppia di primer ed una sonda specifici per il DNA bersaglio endogeno caratteristico di Zea mays: Nome Tipo Sequenza 5-3 MaiJ-F2 Fw TTg gac TAg AAA TCT CgT gct ga mhmg-rev Rv gct ACA TAg gga gcc TTg TCC T Mhmg-probe Pr FAM-CAA TCC ACA CAA ACg CAC gcg TA-TAMRA L amplificazione del DNA bersaglio endogeno genera un amplificato di 79 bp del gene hmg. L eventuale comparsa di amplificati viene seguita attraverso un sistema di rivelazione in fluorescenza integrato allo stesso apparato di amplificazione. Vengono utilizzate sonde marcate con due fluorocromi, cosiddetti reporter (legato al 5 della sonda) e quencher (legato al 3 ); in assenza di amplificazione, il reporter irradiato trasferisce energia al quencher

4 BIOTECNOLOGIE pag 4 di 12 e viene osservata la fluorescenza solo di quest ultimo; a seguito di amplificazione, l attività 5 esonucleasica della polimerasi rimuove il reporter dalla sonda con conseguente emissione di fluorescenza specifica del reporter. Tale fluorescenza aumenta in modo direttamente proporzionale al numero di amplificati. La fluorescenza misurata viene normalizzata rispetto ad un fluorocromo di riferimento passivo (ROX) presente nella miscela di reazione. La monitor run viene effettuata come prova qualitativa per tutti i DNA estratti da campioni, controlli e materiali di riferimento contenenti, o che possono contenere Zea mays. Questi vengono analizzati solo con il sistema endogeno hmg, allo scopo di determinare la rilevabilità di DNA di mais nell estratto. Nella monitor run ciascun campione, controllo e/o materiale di riferimento viene sottoposto a prova ad almeno due concentrazioni diverse di DNA, ciascuna esaminata in duplicato. La differenza tra i Ct medi osservati ( Ct) deve corrispondere all appropriato fattore di diluizione del DNA in modo da verificare l eventuale presenza di inibitori di PCR. Nella reazione è inserito un campione di DNA di mais alla concentrazione del LOD del metodo (controllo LOD), il cui valore di Ct rappresenta il cut off oltre il quale i campioni vengono considerati negativi per la presenza di DNA di mais. 7. Apparecchiature, materiali, reagenti, materiali di riferimento e dispositivi di protezione individuale 7.1 Apparecchiature ABI Prism 7900HT Sequence Detection System ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System Cappa a flusso laminare verticale sterile Congelatore -20 C ± 5 Frigorifero +4 C ± 2 Microcentrifuga Pipette monocanale volumi da 2 a 1000 µl Produttore di ghiaccio Vortex 7.2 Materiali Bicchieri di plastica Forbici Ghiaccio Griglia per microprovette Micropiastre ottiche di reazione da 96 pozzetti MicroAmp o microprovette ottiche MicroAmp Pinzette Provette tipo Eppendorf da 1,5 ml Provette tipo Eppendorf da 2,0 ml Puntali con filtro volumi da 2 a 1000 µl Secchielli per ghiaccio Soluzione decontaminante (IPR VIR 081)

5 BIOTECNOLOGIE pag 5 di 12 Soluzione disinfettante etanolo al 70% (IPR VIR 050) Strumento per l installazione dei tappi MicroAmp o pettine per il fissaggio della pellicola adesiva Supporti speciali per provette da 1,5 ml Supporto per micropiastra MicroAmp a 96 pozzetti o per microprovette Tappi ottici MicroAmp o pellicola ottica adesiva 7.3 Reagenti H 2 O grado reagente sterile (IPR VIR 096) Master Mix Monitor PCR HMG (IPR VIR 136) TE: Tris-HCl ph 8,00 1mM / EDTA ph 8,00 0,01 mm (IPR VIR 127) 7.4 Materiali di riferimento DNA estratto da materiali di riferimento certificati a base di farina di mais. 7.5 Dispositivi di protezione individuale Guanti in lattice o vinile senza polvere Camice 8. Responsabilità Il Responsabile di Struttura ed il Responsabile della Prova hanno la responsabilità di garantire e verificare la corretta applicazione della presente procedura. Le responsabilità relative alla preparazione dei reagenti, all esecuzione del metodo di prova, alla lettura ed alla verifica dei risultati sono riportate sui moduli PG QUA 005/12: Tabella responsabilità personale a tempo indeterminato (TRPI) e PG QUA 005/13: Tabella responsabilità personale a tempo determinato, collaboratori e consulenti (TRPD). 9. Modalità operative Da eseguire nell area di prova 220 o 221A sotto cappa a flusso laminare verticale sterile. Nell eseguire la procedura l operatore deve osservare scrupolosamente la PG VIR 003 (Gestione delle aree e delle attività per l esecuzione dei protocolli di PCR ). Nell eseguire la procedura compilare il modulo POS VIR 001 INT/1 consistente in tre pagine: la stampa dei due fogli di lavoro campioni ed esiti e risultati contenuti nel file excel MONITOR HMG.xls costituiscono rispettivamente pag.1 e pag.3, mentre la stampa della piastra di amplificazione definita nel file SDS MONITOR HMG.sds costituisce pag Norme di igiene e sicurezza

6 BIOTECNOLOGIE pag 6 di 12 Per l esecuzione della presente procedura si rimanda a quanto disposto dalla PG VIR 003 specificando che tali disposizioni, vista l innocuità della prova per l operatore, sono esclusivamente a tutela dell esito della prova stessa. 9.2 Preparazione dei campioni e dei controlli Come controlli negativi usare il controllo negativo estrazione e il controllo negativo PCR (H 2 O a grado reagente sterile) Come controllo positivo usare il controllo positivo di estrazione. Per la determinazione del Ct cut off al di sopra del quale i campioni sono da considerarsi negativi, introdurre anche un DNA di controllo positivo ad un quantitativo corrispondente al LOD (controllo LOD). Dai campioni/controlli, estrarre e purificare il DNA secondo una delle seguenti procedure di supporto: POS VIR 052 SUP, POS VIR 053 SUP, POS VIR 015 SUP oppure POS VIR 016 SUP. Se possibile, quantificare il DNA ottenuto mediante lettura spettrofotometrica. Per i campioni ed il controllo positivo diluire il DNA estratto nel modo seguente: 1. nel caso in cui la resa di DNA estratto sia inferiore o uguale a 40 ng/µl, diluire 1:4, con H 2 O grado reagente sterile o buffer TE. Nella monitor run vengono esaminate la concentrazione del DNA estratto tal quale e la diluizione 1:4. 2. nel caso in cui la resa sia superiore a 40 ng/µl, diluire il DNA, con H 2 O grado reagente sterile o TE, alle concentrazioni di 40 ng/µl e 10 ng/µl, che saranno entrambe esaminate nella monitor run. Conservare a + 4 C ± 2 (al massimo per una settimana) oppure in congelatore a 20 C ± 5, per periodi più lunghi. Ciascuna diluizione dei campioni e del controllo positivo di estrazione viene sottoposta a prova in duplicato. Il controllo negativo di estrazione è analizzato in duplicato senza sottoporlo a diluizione. Il controllo negativo di reazione (NTC) e il controllo LOD vengono esaminati anch essi in duplicato. 9.3 Allestimento della prova Prima fase Accensione ed impostazione dell amplificatore 1. Accendere l ABI Prism 7900HT Sequence Detection System o l ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System almeno 30 prima della prova per far scaldare il laser all interno dello strumento. 2. Aprire il file TEMPLATE monitor hmg.sdt, predisposto con il seguente profilo di amplificazione: Step Stage T Tempo Acquisizione n.

7 BIOTECNOLOGIE pag 7 di 12 ( C) (sec.) cicli 1 Denaturazione e attivazione della polimerasi 95 C 600 NO 1x 2a Denaturazione 95 C 15 NO 2b Annealing e sintesi 60 C 60 SI 50x Per l impostazione del file vedi l istruzione IL VIR Definire quindi la collocazione dei controlli e dei campioni nella piastra di reazione da 96 pozzetti in cui avverranno le reazioni riportandola a pag.2 del modulo POS VIR 001 INT/1. 4. Salvare il file come GG-MM-AA monitor hmg.sds, indicando il giorno-mese-anno nel nome del file. Nel caso vengano effettuate più corse nella stessa giornata, attribuire ai file una numerazione sequenziale (es. GG-MM-AA monitor hmg1.sds, GG-MM-AA monitor hmg2.sds, ecc.) Seconda fase Preparazione della miscela di reazione Aprire il file excel MONITOR HMG.xls e compilare il foglio di lavoro campioni (pag. 1 dell allegato POS VIR 001 INT/1) inserendo nella cella corrispondente il numero dei campioni/controlli da sottoporre a prova. Salvare il file con il nome GG-MM-AA MONITOR HMG.xls, indicando il giorno-mese-anno nel nome del file. Nel caso vengano effettuate più corse nella stessa giornata, attribuire ai file una numerazione sequenziale (es. GG-MM-AA monitor hmg1.xls, GG-MM-AA monitor hmg2.xls, ecc.). Nella cella Volume di Master Mix da prelevare (ul): dello stesso file, è presente la formula per il calcolo automatico del volume di Master mix da prelevare con una correzione +15%. Nell area di prova 205 sotto cappa a flusso laminare verticale sterile prelevare il volume di master mix calcolato (MASTER MIX, IPR VIR 136). Prelevare una aliquota di acqua grado reagente sterile di almeno 15 µl da utilizzare come NTC. Trasferire le provette contenenti la master mix e l NTC nell area di prova 220 o 221A. Terza fase Allestimento della prova Sotto cappa a flusso laminare verticale sterile nell area di prova 220 o 221A predisporre il seguente materiale: - Supporti speciali per provette da 1,5 ml. - Provette da 1,5 ml autoclavate. - Due bicchieri di plastica inseriti uno nell altro e contenenti qualche ml di soluzione decontaminante, dove sono eliminati i puntali dopo l uso. Durante l esecuzione della prova, mantenere i campioni di DNA in esame in ghiaccio o supporto refrigerato. 1. Prendere i supporti speciali per provette e disporvi un numero di provette da 1,5 ml pari al numero di campioni/controlli in esame. 2. Distribuire in ogni provetta 41,4 µl di master mix.

8 BIOTECNOLOGIE pag 8 di Prelevare dal ghiaccio le provette contenenti le sospensioni di DNA dei campioni da analizzare e dei controlli e trasferirle su un altro supporto speciale. 4. Agitare su vortex per circa 10 secondi ciascuna provetta e centrifugare alla massima velocità per pochi secondi, al fine di raccogliere sul fondo della provetta la sospensione della miscela di reazione. 5. Trasferire, nelle provette contenenti la master mix, un quantitativo di sospensione di DNA pari a 10,4 µl. In questo modo, ogni provetta conterrà un volume di miscela di reazione completa di DNA stampo pari a 51,8 µl. 6. Agitare su vortex per circa 10 secondi ciascuna provetta e centrifugare alla massima velocità per pochi secondi, al fine di raccogliere sul fondo della provetta la sospensione della miscela di reazione. 7. A seconda dello strumento utilizzato per l amplificazione e rivelazione, disporre sotto cappa: ABI 7900HT: - forbici - bustina contenente i tappi ottici - pinzette - micropiastre ottiche di reazione da 96 pozzetti MicroAmp o microprovette ottiche MicroAmp - strumento per l installazione dei tappi - supporto per micropiastra MicroAmp a 96 pozzetti o per microprovette ABI 7900Fast - supporto per micropiastra MicroAmp a 96 pozzetti - micropiastra ottica di reazione da 96 pozzetti MicroAmp per l ABI 7900HT Fast Real Time PCR - pellicola adesiva Optical adhesive film MicroAmp - pettine per il fissaggio della pellicola adesiva NB: Le piastre MicroAmp a 96 pozzetti sono diverse a seconda dello strumento utilizzato, assicurarsi di utilizzare il formato corretto. 8. Trasferire 25 µl di miscela di reazione completa di DNA stampo nei pozzetti della micropiastra secondo lo schema precedentemente definito e riportato a pagina 2 del POS VIR 001 INT/1. 9. Sigillare i pozzetti della piastra con la pellicola ottica adesiva o con i tappi ottici. 10. Estrarre la micropiastra di reazione dal supporto di base e trasferirla nell area di prova 210 o 221. Quarta fase Amplificazione e analisi dei dati Da eseguire nell area di prova 210 o 221. Disporre la micropiastra di reazione nell apposito vano dell ABI Prism 7900HT o dell ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System e procedere all avviamento della reazione come descritto dal manuale d uso dello strumento.

9 BIOTECNOLOGIE pag 9 di 12 Al termine dell amplificazione procedere all analisi, dopo aver preventivamente salvato la corsa, come di seguito descritto: 1. Impostare la linea di soglia: Impostare la modalità logaritmica per la rappresentazione delle curve di amplificazione. Impostare la linea di soglia nella zona dove i diversi profili di amplificazione risultano paralleli, cioè nella fase esponenziale di PCR. Passare alla modalità lineare e verificare che la linea di soglia precedentemente impostata si trovi nella fase geometrica di amplificazione. 2. Impostare la linea di base: In modalità lineare, impostare la linea di base 3 cicli prima del ciclo in corrispondenza del quale la linea di soglia incrocia la prima curva di amplificazione (ad es. se il Ct più piccolo è 25, impostare la linea di base a 22). 3. Esportare i dati in un file testo (TXT) e poi copiarli sul foglio di lavoro incolla del file excel GG-MM-AA MONITOR HMG.xls. 4. Analizzare i risultati: sul foglio di lavoro risultati del file excel GG-MM-AA MONITOR HMG.xls vengono riportati automaticamente i valori di Ct corrispondenti a ciascun pozzetto e i valori medi; per i campioni sottoposti a prova il foglio di lavoro calcola automaticamente anche il Ct tra le diluizioni testate. o Verificare che i controlli negativi presentino un Ct 40. In caso contrario la monitor run deve essere ripetuta, eventualmente dopo aver effettuato una nuova estrazione di DNA. o Verificare che il controllo positivo di estrazione, alla concentrazione maggiore, presenti un Ct non superiore al valore di 26, e che, tra le due concentrazioni, la differenza tra i Ct medi sia compresa tra 1,5 e 2,5. In caso contrario la monitor run deve essere ripetuta, eventualmente dopo aver purificato il DNA o effettuato una nuova estrazione di DNA, a seconda del caso. o Se la differenza tra i Ct medi delle diluizioni testate è 1,5 Ct, ciò indica che la soluzione di DNA estratto potrebbe contenere inibitori di PCR. In tal caso, se la qualità delle curve relative alla concentrazione più bassa è sufficientemente buona, utilizzare quest ultima concentrazione per le successive determinazioni, altrimenti ripetere la prova dimezzando il titolo di entrambe le concentrazioni. Se la differenza tra i Ct medi si mantiene 1,5 Ct, sarà necessario purificare il DNA oppure estrarre nuovamente il DNA dal campione (eventualmente utilizzando un metodo di estrazione più efficiente in termini di purificazione rispetto a quello precedentemente impiegato). o Se la differenza tra i Ct medi è 2,5 Ct, esaminare le curve di amplificazione relative alle due diverse concentrazioni di DNA considerate, per verificarne l andamento esponenziale ed effettuare le prove successive sulla concentrazione di DNA che presenta la migliore curva di amplificazione. o Il Ct LOD è calcolato come il Ct medio ottenuto dai due replicati di prova del controllo LOD. 9.4 Verifica fogli di calcolo Con cadenza semestrale l affidabilità dei fogli di calcolo contenuti nel file excel MONITOR HMG.xls utilizzato nella presente procedura viene verificata mediante l analisi di una corsa test standard ad esito noto denominata POS VIR 001 monitor test.

10 BIOTECNOLOGIE pag 10 di 12 Tutta la documentazione relativa a tali verifiche è conservata nell area di lavoro 200 in un apposito raccoglitore denominato OGM Verifica dei fogli di calcolo. 10. Espressione dei risultati Sono considerati positivi i campioni che presentano un valore di Ct medio Ct LOD. I campioni che presentano Ct > del Ct LOD sono considerati negativi per la presenza di DNA di mais. Esito Espressione del risultato 1 Ct campione > Ct LOD non rilevato DNA di mais 2 Ct campione Ct LOD rilevato DNA di mais I risultati dei replicati di estrazione devono essere concordanti. In caso contrario la prova deve essere ripetuta e se i risultati sono ancora discordanti, l esito deve essere espresso con la modalità 1 (non rilevato DNA di mais). Nel caso 1 deve essere indicato il LOD. 11. Validazione del metodo I calcoli relativi alle fasi descritte in questo paragrafo sono riportati nel modulo Foglio di lavoro per la validazione / verifica della capacita del laboratorio nell applicazione dei metodi di prova e di taratura e stima dell incertezza di misura (VMSI POS VIR 001 INT) 11.1 Determinazione del LOD (limite di rivelazione) Per la determinazione del LOD si procede seguendo le linee guida della ISO 24276:2006 determinando il più basso livello di analita (DNA bersaglio della reazione di PCR real time) in corrispondenza del quale lo scarto tipo relativo di riproducibilità (RSD R ) è 33%. Nel nostro caso ai fini di una validazione intra-laboratorio vengono utilizzati dati di ripetibilità e ripetibilità intermedia. Si opera come segue: Il DNA di mais estratto da materiali di riferimento certificati viene diluito in TE in modo da ottenere una serie di diluizioni fino al raggiungimento di un numero di copie di DNA bersaglio compreso tra 1 e 10. Ciascuna diluizione viene esaminata in PCR real time per il sistema hmg in un numero di replicati 5. Vengono selezionati i livelli di concentrazione per i quali si sono ottenuti dei valori di Ct utili nel 100% dei replicati. Si ricava il Ct medio per ciascun livello utile di concentrazione e si calcola la retta di calibrazione Ct contro log (n. copie genomiche): Ct = a Log( n. copie) + b

11 BIOTECNOLOGIE pag 11 di 12 dove a è la pendenza e b l intercetta della retta di calibrazione. Dalla retta di calibrazione viene calcolato, per ciascun replicato, il numero di copie genomiche corrispondente al valore del Ct. Dal numero di copie genomiche per ciascun replicato viene calcolato il valor medio per livello di concentrazione ed il corrispondente scarto tipo; quindi si calcola lo scarto tipo relativo di ripetibilità (RSD r ): x = i n x i σ = i ( x x) i n 1 2 σ RSD r = 100 x dove x = numero di copie genomiche medio x i = numero di copie genomiche per il replicato i n = numero di replicati σ = scarto tipo RSD r = scarto tipo relativo di ripetibilità o coefficiente di variazione Una prima stima del LOD viene determinata come corrispondente al più basso numero di copie genomiche al quale lo scarto tipo relativo di ripetibilità (RSD r ) è risultato 33%. La procedura viene ripetuta integralmente in condizioni di ripetibilità o ripetibilità intermedia. Il LOD assoluto viene definito come almeno uguale al valore più alto tra le stime del LOD ricavate nelle ripetizioni della procedura. Come riportato nel VMSI POS VIR 001 INT, il LOD risulta pari ad almeno 36 copie di genoma aploide (1C) di mais Specificità e sensibilità

12 BIOTECNOLOGIE pag 12 di 12 La specificità della reazione è stata assunta come descritto nel protocollo di validazione del Laboratorio Comunitario di Riferimento (CRL): Event-specific method for the quantitation of maize line TC1507 using real-time PCR Protocol 2005 ( Un ulteriore verifica viene effettuata mediante una ricerca di omologia per la sequenza dei primer e della sonda nei database GenBank/EMBL/DDBJ/PDB con il programma BLASTN. La specificità e la sensibilità sperimentale vengono verificate allestendo prove con campioni/materiali di riferimento positivi e negativi per la presenza di DNA di mais e vengono calcolate tramite le seguenti formule: n. risultati. negativi Specificità (%): 100 VN n. risultati. positivi Sensibilità (%): 100 VP dove: VN = Veri Negativi = n. campioni non contenenti l analita VP = Veri Positivi = n. campioni contenenti l analita e risultano pari a: Specificità = 100% Sensibilità = 100% 11.3 Linearità La linearità viene valutata allestendo diluizioni seriali di DNA di mais comprese tra circa 280 ng e circa 0,07 ng. Ciascun livello di diluizione viene analizzato almeno in duplicato. I Ct medi per livello e il logaritmo del numero di copie vengono utilizzati per il calcolo della retta di regressione e del relativo valore di R 2 Un valore di R 2 0,98 viene considerato accettabile per garantire la linearità di risposta. Su un totale di 13 prove effettuate, il valore di R 2 è sempre risultato > di 0,99 per un intervallo di concentrazioni compreso tra 280 ng e 0,07 ng totali di DNA di mais.