Linfoma a cellule B: Paragone tra due metodiche di Biologia Molecolare per una diagnosi più efficace

Transcript

1 Linfoma a cellule B: Paragone tra due metodiche di Biologia Molecolare per una diagnosi più efficace Linda Olsson Scuola Superiore Medico Tecnica Locarno Anno 2008/ 09 Lavoro di Diploma eseguito presso: Laboratorio di Diagnostica Molecolare dell Istituto Cantonale di Patologia Locarno Responsabile: Dr. Milo Frattini

2 Indice Riassunto/Abstract. Pag. 3 Scopo del lavoro. Pag. 4 Introduzione. Pag. 5 Pazienti materiali e metodi Pag. 8 i. Casistica campioni. Pag. 8 ii. Materiale e metodi. Pag. 9 a) Estrazione DNA da paraffina. Pag. 9 b) Amplificazione mediante PCR... Pag. 11 c) PCR KRAS... Pag. 12 d) Preparazione gel d agarosio 1,8% e visualizzazione PCR KRAS... Pag. 13 e) PCR per linfoma a cellule B metodica LDM-ICP Pag. 15 f) PCR per linfoma a cellule B metodica BIRD... Pag. 16 g) Analisi dei frammenti.. Pag. 17 Risultati. Pag. 20 i. Falsi negativi... Pag. 20 ii. Positivi certi. Pag. 20 iii. Negativi certi... Pag. 21 iv. Non analizzabili.. Pag. 22 Osservazioni Pag. 24 Conclusioni.. Pag. 25 Ringraziamenti. Pag. 27 Bibliografia Pag. 28 Allegati.. Pag. 29 i. Registro tumori Ticino Alcuni dati epidemiologici del linfoma.. Pag. 29 ii. Diss et al, J Clin Pathol 1994;47: Pag. 31 iii. Protocollo LDM-ICP Fr3-JH.. Pag. 35 iv. Protocollo LDM-ICP Fr2-JH.. Pag. 41 v. Protocollo ditta BIRD.. Pag. 47 2

3 Riassunto Lo scopo di questo lavoro di diploma è stato quello di verificare, tramite tecniche di biologia molecolare, l efficacia d individuazione di linfomi a cellule B con una nuova metodica, registrata con marchio CE (Comunità Europea), della ditta BIRD (Biotecnologia Innovativa per Ricerca e Diagnostica, Dia-chem S.r.l. Napoli) per confronto con quella già utilizzata dal Laboratorio di Diagnostica Molecolare dell Istituto cantonale di Patologia (ICP-LDM), la quale da un 30% di falsi negativi. Durante la differenzazione, e dunque la maturazione dei linfociti a cellule B, avviene un processo chiamato riarrangiamento che permette la creazione di sequenze uniche di DNA per la codificazione delle immunoglobuline. Tali riarrangiamenti sono sfruttati come marker clonali nei linfomi a cellule B. Entrambe sfruttano l amplificazione di acidi nucleici mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) e l analisi dei frammenti su sequenziatore. La metodica utilizzata ora dal ICP-LDM si basa su due distinte PCR che amplificano due distinte regioni, e che originano due frammenti di lunghezza differente, mentre la metodica del Kit BIRD prevede una semi-nested-pcr, basata comunque sull amplificazione di due distinte regioni. Le regioni oggetto dell amplificazione sono uguali tra i due metodi, anche se i primers ibridano in posizioni differenti. L analisi è stata condotta su un totale di 35 campioni bioptici fissati in formalina ed inclusi in paraffina così riportati: 11 campioni falsi negativi, 12 campioni positivi certi, 10 campioni negativi certi e 3 campioni non analizzabili. Il Kit BIRD è riuscito ad identificare un unico campioni in più rispetto alla metodica LDM-ICP, tuttavia ha anche dato 3 falsi positivi. In campioni negativi certi ha identificato picchi monoclonali; per di più i costi di un kit sono molto maggiori. Ciò ci ha indirizzati sul mantenimento della metodica attualmente in uso presso l ICP- LDM, e poter affermare che è paragonabile, se non migliore, della metodica della ditta BIRD registrata CE. Abstract The Aim of this diploma work was to evaluate, with molecular biology techniques, a new method (European Union registered) from the company BIRD (Biotechnology Innovation for Research and Diagnostics) for the detection of B cell monoclonality, in comparision with the method currently in use at the Laboratory of Molecular Diagnostics of the Institute of Pathology Locarno (LDM-ICP), which currently gives a false negative rate of 30%. Normal lymphoid cells udergo rearrangements causing specifity for the immunoglobilin that they produce. Monoclonal proliferations are presumed to be neoplastic; polyclonal populations are not. Both methods use amplification of nuclear acid with Polymerase chain reaction (PCR) and analysis of fragments with automated DNA sequencing LDM-ICP method use 2 PCR instead of the BIRD method use 2 semi-nested-pcr. Both amplified the same regions, (framework 2 to joining region [Fr2/JH] and framework 3 to joining region [Fr3/JH]) but use different primers. The study was carried out on 36 tissue samples fixed in formalin and wax embedded 6-7 section 3 µm. They were divided into 4 classes: 12 false negative samples, B cell Lymphomas in histology analysis but without monoclonal rearrangements of IgH; 11 true Positive samples, B cell Lymphomas in histology and molecular analysis; 12 true negative samples, T cell Lymphomas or inflammations and 3 not analysable samples, in this sample the DNA was too fragmented for LDM-ICP method. The kit BIRD detected only one sample of true cell B lymphoma more than method LDM- ICP; however it also produced 3 false positives, that is monoclonality in samples with T cell Lymphomas or inflammations. Both significantly higher costs and other increased problems associated with the kit in comparison with the older method led to the decision to maintain the LDM-ICP method and affirm that it is comparable or better than the BIRD method. 3

4 Scopo del lavoro In questo lavoro è descritto un confronto tra due metodi per individuare la presenza di linfoma a cellule B in un prelievo bioptico tramite analisi di biologia molecolare. Entrambi prevedono l estrazione di acidi nucleici da tessuto fissato in formalina ed incluso in paraffina, la successiva amplificazione del frammento di interesse con tecniche di PCR (Polymerase Chain Reaction) e l analisi dei frammenti su sequenziatore. Il metodo utilizzato attualmente dal Laboratorio di Diagnostica Molecolare dell Istituto Cantonale di Patologia di Locarno (LDM-ICP) è basato sulla letteratura e fornisce un 30% circa di falsi negativi su campioni classificati come franchi linfomi sulla base delle analisi morfologiche ed immunoistochimiche eseguite da medici patologi. Lo scopo del presente lavoro è di verificare l efficacia d individuazione di linfomi a cellule B con una nuova metodica registrata con marchio CE (Comunità Europea), della ditta BIRD (Biotecnologia Innovativa per Ricerca e Diagnostica, Diachem S.r.l. Napoli) per confronto con quella già utilizzata dall LDM-ICP. Sulla base dei risultati ottenuti, il responsabile del laboratorio deciderà quale metodica verrà utilizzata in futuro per la diagnosi di tali neoplasie. In questo modo avrò l opportunità di avere una formazione approfondita sulle tecniche di biologia molecolare applicate nei laboratori di patologia per la diagnosi di malattie neoplastiche; inoltre, i risultati potranno fornire indicazioni utili al personale del laboratorio nell ottica di una diagnosi più efficace del linfoma a cellule B. 4

5 Introduzione Il linfoma non Hodgkin a cellule B (NHL) è una proliferazione neoplastica incontrollata di cellule di origine linfatica, implicate nella difesa immunitaria dell organismo [3]. Il linfoma a cellule B è una neoplasia frequente che aumenta con l avanzare dell età (solitamente >65 anni) [2,4] con un incidenza in Ticino di 20 nuovi casi all anno per gli uomini e 22 per le donne [4]; la diagnosi viene posta istopatomorfologicamente su un prelievo bioptico del tessuto interessato (linfonodi, milza, midollo osseo,..) con l aiuto della immunofenotipizzazione e della clinica [2]; in caso di dubbio da parte del medico patologo viene richiesto un supporto molecolare, per confermare o meno la diagnosi di linfoma a cellule B. Nel corredo genetico di una cellula B immatura sono presenti tratti di DNA ipervariabili che durante la loro differenziazione subiscono riarrangiamenti. Questi riarrangiamenti sono determinati da perdite randomizzate di tratti di DNA con la formazione di un gene, chiamato VDJ, che andrà a codificare la catena pesante di un immunoglobulina (IgH), specifica per ogni cellula [1]. Ogni cellula, duplicandosi darà luogo ad una progenie cellulare, caratterizzata dalla produzione di uno specifico anticorpo. In una cellula immatura è presente la regione V dove sono presenti i segmenti V H1, V H2, V H3, V H, V Hn, una regione D dove sono presenti i segmenti D H1-15 e una regione J dove sono presenti i segmenti J H1-6. Durante la differenziazione, e dunque la maturazione, alcuni segmenti delle regioni sopraccitate vengono eliminati, con conseguente riarrangiamento della zona circostante. I frammenti mantenuti formano cosi un frammento VDJ specifico per ogni clone [1,5](Vedi figura 1). Figura 1. Riarrangiamento della catena pesante e variabile delle Immunoglobuline (IgH). Le frecce indicano i due distinti riarrangiamenti; il primo con la formazione della regione DJ, mantenendo solo alcuni tratti del DNA della regione D e della regione J. Il secondo riarrangiamento con la formazione della regione VDJ definitiva per ogni cellula ed è evidenziato con il cerchio. 5

6 La struttura della regione variabile del gene IgH è composta da una regione V H dove sono presenti delle zone framework (Fr1, Fr2 e Fr3) che sono conservate per tutti i linfociti B, due zone determinanti la complementarietà (CDR I e CDR II) ipervariabili e specifiche per ogni clone per la produzione di un solo anticorpo. Nella regione D H è presente il CDR III, mentre nella zona J H è presente Fr4. Per unire le diverse regioni (V H, D H e J H ) sono presenti delle zone di inserzione N [1] (vedi figura 2). Nel linfoma a cellule B, in un qualsiasi momento della vita cellulare, un clone di linfocita B può subire un alterazione a livello del DNA, solitamente traslocazioni, a seconda del tipo di neoplasia. Un esempio è il Linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) che tipicamente subisce traslocazioni t(14;18) e t(3;14) [5], mentre il linfoma tipo MALT (Tessuto linfatico mucosa-associato) subisce una traslocazione t(11;18)(q21;q21) [8]. Queste traslocazioni spesso interessano il promotore del gene. Ciò porta ad un espressione più accentuata del gene VDJ di un determinato clone che prende il sopravvento sulle altre cellule originando un espansione neoplastica[9]. La metodica utilizzata ora dal LDM-ICP si basa su due distinte PCR che amplificano due distinte regioni, originando due frammenti di lunghezza differente. I primers utilizzati per una PCR ibridano nelle zone Fr2 e JH dando origine a frammenti compresi tra 250 e 350 bp (vedi figura 2), nell altra PCR si utilizzano invece primers che si legano nelle zone Fr3 e JH dando origine a frammenti tra 80 e 120 bp di lunghezza [9]. Figura 2.La struttura della regione variabile del gene IgH e posizione dei differenti primers Fr2 FR3 e JH. L utilizzo di due PCR distinte è importante per ottenere una diagnosi più sensibile. La metodica del Kit BIRD invece prevede una semi-nested-pcr, basata comunque sull amplificazione di due distinte regioni. I primers, nell amplificazione esterna della PCR Fr2A, si ibridano nelle zone Fr2 e LJH mentre nella PCR interna si ibridano a livello del Fr2 e VLJH ottenendo frammenti di grandezza compresa tra 240 e 280 bp. Nell amplificazione esterna della PCR Fr3A, i primers, si ibridano nelle zone Fr3 e LJH mentre nella PCR interna si ibridano a livello delle zone Fr3 e VLJH ottenendo frammenti compresi tra 80 e 120 bp. 6

7 Pertanto, le regioni oggetto dell amplificazione sono uguali tra i due metodi, anche se i primers ibridano in posizioni differenti. L utilizzo di due distinte PCR, con primers che vanno a legarsi in zone differenti, consente di aumentare la sensibilità di individuare riarrangiamenti patologici: è sufficiente individuare monoclonalità in un frammento per emettere la diagnosi di linfoma a cellule B. Il primer JH, della metodica presente in letteratura [9], e il primer VLJH della metodica BIRD a livello dell estremità 5 hanno coniugato un fluorocromo 6-FAM; in questo modo i prodotti amplificati possano essere analizzati su sequenziatore automatico a elettroforesi capillare. Lo strumento possiede un fotometro in grado di rilevare la presenza di molecole coniugate con fluorocromi eccitate da una sorgente laser, che elabora poi sotto forma di picchi, caratterizzati da dimensione (proporzionale alla lunghezza del frammento) e altezza (proporzionale alla quantità del dato riarrangiamento presente nel materiale di partenza) specifiche. La presenza di uno o due picchi dominanti, di altezza almeno doppia rispetto agli altri, indica una monoclonalità. Per essere confermata, e dunque poter dare la diagnosi di linfoma a cellule B, bisogna confermare con altre due ripetizioni dell analisi ottenendo sempre lo stesso picco con uguali dimensioni [9]. Nel mio caso, essendo già state eseguite in precedenza le analisi con le conferme relative dal personale del Laboratorio, per la metodica della letteratura sarà necessario eseguire un unica volta le analisi con la metodica LDM-ICP; se i risultati che ottengo in questo lavoro non dovessero combaciare con quelli dell analisi eseguita in precedenza, si dovrà procedere a confermare il risultato con una seconda ripetizione. Queste discrepanze possono accadere in quanto il tessuto da cui è stato estratto il DNA è differente tra la determinazione precedente (in diagnosi) e quella attuale. Per la metodica BIRD dovrò invece confermare il risultato come da giusta prassi, non avendola mai utilizzata in precedenza. 7

8 Pazienti, materiali e metodi i) Casistica campioni Le analisi sono state eseguite su: o 13 campioni positivi certi: Casi microscopicamente classificati come linfomi maligni dai medici patologi e confermati dall'analisi molecolare con la metodica in uso presso il LDM-ICP (amplificazione mediante PCR e analisi di frammenti con sequenziatore automatico). o 9 campioni negativi certi: Casi classificati come negativi per presenza di linfoma, sia sulla base della valutazione istologica che su quella molecolare con il protocollo attualmente in uso (questi campioni li abbiamo scelti sulla base di una diagnosi di infiammazione o Linfomi a cellule T). o 11 campioni falsi negativi: Casi classificati come Linfomi a cellule B maligni dai medici patologi ma che non hanno mostrato la presenza di monoclonalità all'analisi molecolare con il protocollo LDM-ICP. La localizzazione della malattia è varia come si può osservare nella tabella 1. Abbiamo deciso di indagare anche 2 campioni che si sono rivelati non analizzabili con la metodica utilizzata ora dal LDM-ICP a causa del DNA troppo frammentato, dove non viene nemmeno amplificato il gene housekeeping (KRAS). Tabella 1. Caratteristiche analizzate: Descrizione della localizzazione della malattia dei campioni con il corrispondente numero progressivo e numero interno dell ICP-LDM (BioMol). In seguito riporterò unicamente il numero progressivo per una questione di praticità e ordine. Il numero LDM-ICP corrisponde ad un certo campione con indicazione del sottotipo (es. T120.1): questi campioni sono stati ritagliati e riestratti per l analisi di questo lavoro di diploma o a causa di un DNA risultato non amplificabile nella prima estrazione. N Progr. Natura del campione N BioMol Falsi negativi 1 Linfonodo cervicale T Cute schiena T Linfonodo cervicale T Cute avambraccio T Cute dorsale MALT T Polmone T Linfonodo cervicale T Linfonodi ascellari T Linfonodo ascellare T Stomaco MALT T Peritoneo T732.2 Positivi certi 12 Testicolo sinistro T Vertebre lombari T Nasofaringe T Duodeno T Antro stomaco T Linfonodi ascellari T Lingua più parti T217.1 N Progr. Natura campione N BioMol 19 Cute guancia T Padiglione orecchio T Fegato T Più parti gastriche T Più parti gastriche T Cervello T412.1 Negativi certi 25 Cute petto, dermatite T Cute naso T Linfonodo, Linfoma T T Duodeno, Linfoma T T Lingua, infiammazione T Linfonodi cervicali, Linfoma T T Duodeno, Linfoma T T Cervello, Linfoma T T Cute, Linfoma T T104.2 Non analizzabili 34 Parti molli fianco T Biopsia oseteomidollare T

9 ii) Materiale e metodi a) Estrazione DNA da paraffina: Materiale: o Etanolo 99,8%, Fluka Analytical, Lotto: o Xilolo 98,5%, Carlo Erba Reagents, Lotto: o Kit QIAamp DNA MiniKit Qiagen Tissue, USA, Lotto: , Cat: NO contenente i buffer, Proteinasi K e colonne di purificazione o Tubi Eppendorf sterili di 2,0 ml, Sarstedt, Nümbrecht, Germania o Tubi Eppendorf sterili da 1,5 ml, Sarstedt, Nümbrecht, Germania o Eppendorf Centrifuge 5415 R, Basel o Microtomo, Microm HM 440E, USA o Vortex, Heidolph REAX 2000, Germania o Cappa, Heraeus Instrument o Termoblocco, CH-100 BioLabo, Châtel-St.Denis o Thermomixer comfort, Eppendorf AG, Hamburg, Germania o Incubatore, Binden, Tuttlingen o Ruota, Falc F 205 Rot o NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer, Witec Ag, Littau Protocollo: A ogni passaggio del protocollo e ogni uscita dalla cappa con le mani cambiare i guanti per evitare una qualsiasi contaminazione. Non soffermarsi troppo durante i passaggi con xilolo vista la sua tendenza a frammentare facilmente il DNA. Tagliare 6-7 sezioni da 3 µm di tessuto fissato in formalina ed incluso in paraffina con un microtomo. Inserire i tagli in una provetta da 2,0 ml utilizzando i guanti. Si può utilizzare la stessa lama per più campioni pulendola dopo ogni taglio con etanolo. Centrifugare per 15 secondi a rpm. Aggiungere 800 µl di xilolo, vortexare per 15 secondi alla massima velocità, centrifugare per 5 minuti a rpm. Eliminare il surnatante. Aggiungere 500 µl di etanolo, vortexare alla massima velocità per 15 secondi. Centrifugare per 5 minuti a rpm, eliminare il surnatante. Ripetere l aggiunta di etanolo e la procedura conseguente. Inserire la provetta con il tappo aperto nel Thermomixer comfort a 45 C e impostare 300 rpm per circa 5-10 minuti, a seconda della dimensione del pellet. Una volta evaporato tutto l etanolo, aggiungere 180 µl di buffer ATL e 20 µl di proteinasi K. Vortexare e sigillare il tappo con parafilm per evitare che si apra il tappo. Incubare a 56 C per tutta la notte in un incubatore su una ruota in movimento. 9

10 Il giorno successivo centrifugare il campione per 15 secondi a rpm per togliere i residui dalle pareti, aggiungere 200 µl di buffer AL, vortexare per 15 secondi alla massima velocità e incubare in un termoblocco per 10 minuti a 70 C. A fine incubazione centrifugare per 15 secondi a rpm. Aggiungere 200 µl di etanolo, vortexare alla massima velocità per 15 secondi. Centrifugare per 15 secondi a rpm. Pipettare la miscela ottenuta (600 µl circa) in una colonna QIAamp e centrifugare a rpm per 1 minuto, staccare la provetta di raccolta e gettare l eluato, mantenere la colonna con il filtro e mettere su una provetta di raccolta pulita. Aggiungere 500 µl di buffer AW1, centrifugare a rpm per 1 minuto, staccare la provetta di raccolta e gettare l eluato, mantenere la colonna con il filtro e mettere su una provetta di raccolta pulita. Aggiungere 500 µl di buffer AW2, centrifugare a rpm per 3 minuti, staccare la provetta di raccolta e gettare l eluato, mantenere la colonna con il filtro e mettere su una provetta di raccolta pulita, centrifugare rpm per 1 minuto. Appoggiare la colonna con il filtro su una provetta da 1,5 ml e aggiungere 50 µl di buffer AE sopra il filtro, incubare a temperatura ambiente per 5 minuti, centrifugare a rpm per 1 minuto. Pipettare l eluato ottenuto dal passaggio precedente e ricaricare sulla stessa colonna QIAamp, incubare 5 minuti a temperatura ambiente e centrifugare a rpm per 1 minuto. Gettare colonna con filtro e tenere provetta contenente la soluzione di DNA. Quantificazione: Per verificare se si è ottenuto DNA di buona qualità, si utilizza la misurazione allo spettrofotometro. Per fare il bianco campione, e quindi azzerare la lettura, utilizzare 2 µl di buffer AE. Si passa poi alla quantificazione degli acidi nucleici presenti nella soluzione utilizzando 2 µl del DNA estratto. Lo strumento fornisce contemporaneamente letture a 230, 260, 280 e 320 nm. Osservare la concentrazione di acidi nucleici e in particolare i rapporti 260/280 e 260/230, che devono essere idealmente compresi tra 1,6 e 2,0. Il DNA assorbe a una lunghezza d onda di 260 nm, le proteine a 280 nm mentre lo xilolo e l etanolo a 230 nm. Valori elevati a 230 o 280 denotano pertanto rispettivamente contaminazione di xilolo/etanolo o proteine (vedi figura 3). 10

11 Figura 3. Grafici dell apparecchio nanodrop al momento della quantificazione degli acidi nucleici. Il grafico sulla sinistra indica un campione con una buona concentrazione di acidi nucleici (147,8 ng/µl) e degli ottimi rapporti 260/280 (2,05) e 260/230 (2,05), infatti la curva del grafico prende un andamento a campana spostato sulla sinistra con il picco massimo a 260 nm. Il grafico sulla destra indica un campione contenente una bassa concentrazione di acidi nucleici (2,1 ng/µl); il rapporto 260/280 (1,72) è accettabile mentre il rapporto 260/230 (0,34) non lo è, probabilmente a causa di contaminazione di xilolo o etanolo. b) Amplificazione mediante PCR Materiale: o dntps (datp, dttp, dctp, dgtp) 100 mm, GE Healthcare, Illustra, UK, Lotto: /12/13/14 o dutp 100 mm, GE Healthcare, Illustra, UK, Lotto: o Kit AmpliTaq Gold with GeneAmp (Applied Biosystems-Roche), USA, Lotto: K09381; Scadenza: contenente la Taq Gold, PCR buffer e la soluzione di MgCl 2 o Acqua deminaralizzata (millipore) autoclavata (Fedegari autoclaven AG) o Tubi Eppendorf da 1,5 ml sterile, Sarstedt, Nümbrecht Germania o Tubi di PCR DNase e RNase free 0,2 ml, Thermo scientific, Axonlab, Baden o Termociclatore, Bio-Rad USA, DNA Engine, PTC-200 Protocollo: Per poter eseguire le amplificazioni utilizzare soluzioni di DNA a 25 ng/µl o a 75 ng/µl prendendo sempre 4 µl di soluzione madre di DNA e aggiungendo una quantità variabile di acqua demineralizzata autoclavata in base alle concentrazioni ottenute e quantificate con lo spettrofotometro. Per sapere quanta acqua aggiungere eseguire il calcolo: ((C1.V1)/C2)-4= Volume d acqua da aggiungere alla soluzione madre di DNA C1= Concentrazione soluzione madre DNA V1= Volume costante di soluzione di DNA 4 µl C2= Concentrazione di DNA che si vuole ottenere 25 ng/ µl o 75 ng/ µl I campioni diluiti a 25 ng/µl e a 75 ng/µl possono essere conservati a tempo indeterminato a 4 C, mentre le soluzioni madri sono congelate a -20 C. 11

12 Tutti i reagenti delle PCR devono essere conservati in congelatore a -20 C. I reagenti e i campioni devono essere scongelati e centrifugati prima di ogni preparazione, mentre la Taq Gold polimerasi viene estratta dal congelatore unicamente al momento dell uso e riposta a -20 C subito dopo l aggiunta alla miscela di reazione. Prima di ogni PCR, preparare i tubi di reazione necessari a seconda del numero dei campioni, calcolando anche due controlli, uno positivo ed un bianco. Per il controllo positivo utilizzare un campione di DNA già amplificato precedentemente con successo; per il bianco utilizzare acqua demineralizzata autoclavata al posto della soluzione di DNA. Il bianco di reazione viene pipettato sempre per ultimo al fine di verificare che non ci siano state contaminazioni durante l operazione. Dopo l amplificazione pertanto, un esperimento sarà considerato valido se e solo se nel bianco di reazione non si sarà evidenziata alcuna banda di amplificazione e se nel controllo positivo si sarà osservata una sola banda di dimensione attesa per quella specifica analisi. Durante la preparazione della mix aggiungere un volume corrispondente ad un campione in più per compensare eventuali perdite durante le manipolazioni e i pipettamenti. Tutti i volumi elencati nelle procedure sono per un unico campione, moltiplicare quindi i volumi dei reagenti a seconda del numero di campioni da analizzare e dei controlli. Preparare prima dell uso le diluizioni di dntps e il dutp. Per i dntps, pipettare in una provetta da 1,5 ml 10 µl di ogni nucleotide (da una soluzione madre a concentrazione di 100 mm). Portare a volume con 60 µl di acqua sterile per ottenere una concentrazione finale 10 mm per ogni nucleotide. Per il dutp preparare una provetta da 1,5 ml e pipettare 10 µl di dutp (da una soluzione madre a concentrazione di 100 mm), portare a volume con 90 µl di acqua sterile per ottenere una concentrazione finale 10 mm. Tutti i passaggi della PCR devono essere eseguiti in ghiaccio con cambio di guanti a ogni passaggio. Al momento dell utilizzo del primer JH per la metodica LDM-ICP e delle mix semi-nested per la metodica BIRD, lavorare il più possibile al riparo dalla luce (ovvero spegnere la luce della cappa e usare solo luce ambientale) vista la presenza di un fluorocromo. Tutti i prodotti d amplificazione possono essere conservati a 4 C per tempo indeterminato. c) PCR KRAS Materiale: o Primer 17F 100 µm (5 -TGGTGGAGTATTTGATAGTGTA-3 ; Invitrogen USA, Lotto: D7328 (A02)964350) o Primer 18B 100 µm (5 -CATGAAAATGGTCAGAGAA-3 ; Invitrogen USA, Lotto: D0328 (A04)964350) Protocollo: Il gene houskeeping viene utilizzato come un controllo interno per assicurarsi che il DNA ottenuto dall estrazione sia amplificabile e non troppo frammentato. In questo lavoro si è deciso di utilizzare 12

13 il gene KRAS. KRAS appartiene ad una famiglia genica molto conservata, codifica per una proteina implicata nella trasduzione del segnale. Questo gene è utilizzato come controllo perché non subisce variazioni di numero di coppie geniche in tutti i tumori, ovvero non è soggetto a duplicazioni o delezioni, eventi che potrebbero alterare il risultato [6]. Pipettare in ogni tubo di PCR 2 µl di soluzione di DNA 25 ng/µl; nel caso la concentrazione della soluzione madre non superi i 25 ng/µl, non diluire il campione ma pipettare direttamente 2 µl di soluzione madre di DNA. Preparazione della Mix di reazione: In un altra provetta da 1,5 ml pipettare 5 µl di Primer 17F e diluire con 45 µl di acqua sterile ottenendo cosi una concentrazione 10 µm; lo stesso procedimento viene eseguito con il Primer 18B. Nella provetta per la mix pipettare 2,5 µl di PCR buffer 10x, 3 µl di MgCl 2 25 mm, 0,5 µl di dntps 10 mm, 0,1 µl di dutp 10 mm e 1,25 µl di entrambi i primers 10 µm. Aggiungere 0,4 µl di Taq Gold polimerasi 5U/µl nella mix. Dopo questa aggiunta terminare velocemente la preparazione della mix con 14 µl di acqua sterile e pipettare 23 µl di mix in ogni tubo di PCR contenente il DNA. Amplificazione: Mettere i tubi di reazione nel termociclatore già impostato precedentemente con il seguente programma: Preicubazione per 2 minuti a 50 C (1 ciclo), denaturazione per 10 minuti a 95 C (1 ciclo). Denaturazione per 15 secondi a 95 C, amplificazione per 30 secondi a 55 C ed estensione per 30 secondi a 72 C; questi passaggi vengono ripetuti per 45 cicli. Estensione finale 3 minuti a 72 C un unica volta e poi i campioni vengono mantenuti a 10 C fino a che vengono prelevati dal termociclatore. d) Preparazione gel d agarosio 1,8% e visualizzazione PCR KRAS Materiale: o PeqGold Universal Agarose, Axonlab Banen, Lotto: o Tris Borate EDTA buffer (TBE) 10X, SIGMA USA, Lotto: 038K8410 o Loading buffer (Soluzione di Blu di Bromofenolo), peqlab Germania o DNA Marker PeqGold 50 bp DNA-Leiter, Biotechnologie GmbH, peqlab Germania, Lotto: o GelRed 0.1%, Biotium USA, Lotto: 8G0T19 o ImageMaster VDS, Pharmacia Biotech USA o Beuta da 100 ml e da 200 ml o Cilindro da 50 ml e da 100 ml o Bilancia analitica, Mettler PC

14 o o o Forno a microonde, Moulinex, symbio Camera elettroforetica con supporto, Bio-Rad USA, Wide Mini-Sub Cell CT Generatore di corrente, BioRad USA, Power Pac Basic Protocollo: Preparazione gel: Preparare la soluzione TBE 1X in un pallone tarato da 2 l con 200 ml di TBE 10X. Portare a volume con acqua demineralizzata. Preparazione del gel da 100 ml: pesare in una beuta da 200 ml 1,8 g di PeqGold Universal Agarose e aggiungere 100 ml di TBE 1X misurato precedentemente. Sciogliere la soluzione in microonde a 200 V per circa minuti fino a che la soluzione è limpida. Lasciare raffreddare il gel fino a circa 55 C (non scotta più al tatto) e versare nella camera elettroforetica 15x10 cm dopo aver posizionato i pettini per creare i pozzetti. Preparazione del gel 40 ml: pesare in una beuta da 100 ml 0,72 g di PeqGold Universal Agarose e aggiungere 40 ml di TBE 1X misurato precedentemente. Sciogliere la soluzione in microonde a 200 V per circa 8 minuti fino a che la soluzione è limpida. Lasciare raffreddare il gel fino a circa 55 C (non scotta più al tatto) e versare nella camera elettroforetica 6x10 cm dopo aver posizionato i pettini per creare i pozzetti. Lasciare raffreddare il gel almeno un ora prima dell utilizzo. Riempire poi la camera elettroforetica con la soluzione TBE 1X coprendo di circa 5 mm il gel. Visualizzazione su gel d agarosio: Una volta ottenuto l amplificato visualizzare il risultato su gel d agarosio 1,8%. Su un foglio di parafilm pipettare per ogni campione 2 µl di loading buffer e 5 µl di amplificato; per il marker pipettare sempre 2 µl di loading buffer, 1 µl di DNA Marker e 9 µl di TBE 1x. Pipettare poi 7 µl di marker e campione in ogni pozzetto del gel. Far migrare a 100 V per circa 30 minuti (fino a che il colorante blu di bromofenolo non arrivi a circa 1-1,5 cm alla fine del gel). Per la colorazione delle bande utilizzare una soluzione di GelRed 0.1% diluito con TBE 1x, lasciare il gel a colorare per almeno 30 minuti. Sciacquare il gel in acqua demineralizzata per eliminare l eccesso di soluzione di GelRed 0.1% e osservare le bande ottenute con l apparecchio ImageMaster; stampare la fotografia (vedi figura 4). Ci si attende un prodotto d amplificazione di 250 bp. 14

15 M Figura 4. Visualizzazione, su gel d agarosio, del prodotto d amplificazione di 3 campioni e controlli dopo PCR KRAS. Partendo da sinistra ci sono i 3 campioni (1,2,3), il bianco di reazione (4) dove non è presente alcuna banda, il controllo positivo (5) che presenta l unica banda a 250 bp e il marker (M), con tutte le bande di dimensione conosciuta. e) Analisi linfoma cellule B con la metodica in uso presso il ICP-LDM FR2-JH/ FR3-JH Materiale: o Primer FR2 (5 -TGGRTCCGMCAGSCYYCNGG-3 ; Invitrogen USA, Lotto:D4989G11 o Primer FR3 (5 -ACACGGCYSTRTATTACTGT-3 ; Invitrogen USA, Lotto:D4989G10 o Primer JH (5 -ACCTGAGGAGACGTGACC-3 ; Invitrogen USA, Lotto: O5039C06), il primer è coniugato al fluorocromo 6-FAM all estremità 5 Protocollo: Per ogni campione in analisi bisogna eseguire due distinte PCR; una PCR amplifica frammenti dalla regione FR2 alla regione JH, un altra PCR amplifica frammenti dalla regione FR3 alla regione JH. I primers FR2, FR3 e JH vengono preparati sotto cappa prendendo 10 µl di primers soluzione madre 100 µm e diluendo con 40 µl di acqua demineralizzata autoclavata ottenendo così una soluzione a concentrazione 20 µm. Pipettare in ogni tubo 2 µl di soluzione di DNA madre. Preparazione della Mix di reazione FR2-JH: Nella provetta della mix pipettare 5 µl di PCR buffer 10x, 3 µl di MgCl 2 25 mm, 1 µl di dntps 10 mm, 0,2 µl di dutp 10 mm e 1,5 µl di primer FR2 20 µm e JH 20 µm. Pipettare 0,25 µl di Taq Gold polimerasi 5U/µl nella mix. Dopo questa aggiunta terminare velocemente la preparazione della mix con 34,55 µl di acqua sterile e pipettare 48 µl di mix in ogni tubo di PCR contenente il DNA. Amplificazione FR2-JH: Mettere i tubi di reazione nel termociclatore impostato precedentemente con il seguente programma: Preicubazione per 2 minuti a 50 C (1 ciclo), denaturazione per 10 minuti a 95 C (1 ciclo). Denaturazione per 1 minuto a 94 C, amplificazione per 1 minuto a 57 C ed estensione per 2 minuti a 72 C; questi passaggi vengono eseguiti per 45 cicli. Estensione finale 5 minuti a 72 C 15

16 un unica volta e poi i campioni vengono mantenuti a 10 C fino a che vengono prelevati dal termociclatore. Preparazione della Mix di reazione FR3-JH: Nella provetta della mix pipettare 5 µl di PCR buffer 10x, 3 µl di MgCl 2 25 mm, 1 µl di dntps 10 mm, 0,2 µl di dutp 10 mm e 1 µl di primer FR3 20 µm e JH 20 µm. Pipettare 0,25 µl di Taq Gold polimerasi 5U/µl nella mix. Dopo questa aggiunta terminare velocemente la preparazione della mix con 35,55 µl di acqua sterile e pipettare 48 µl di mix in ogni tubo di PCR contenente il DNA. Amplificazione FR3-JH: Mettere i tubi di reazione nel termociclatore impostato precedentemente con il seguente programma: Preicubazione per 2 minuti a 50 C (1 ciclo), denaturazione per 10 minuti a 95 C (1 ciclo). Denaturazione per 1 minuto a 94 C, amplificazione per 1 minuto a 55 C ed estensione per 1 minuto e 30 secondi a 72 C; questi passaggi vengono eseguiti per 45 cicli. Estensione finale 5 minuti a 72 C un unica volta e poi i campioni vengono mantenuti a 10 C fino a che vengono prelevati dal termociclatore. f) Analisi Linfoma cellule B Kit Ampli-Lymphoma B (BIRD) Materiale: o Ampli-Lymphoma B (BIRD) 45 test, Dia-chem Napoli, Lotto:100908/02; Scadenza: o Ampli-Lymphoma B (BIRD) 45 test, Dia-chem Napoli, Lotto:010409/02; Scadenza Protocollo: Nel Kit BIRD sono contenuti la Mix PCR Fr2A, Mix PCR Fr3A, Mix PCR Fr2A semi-nested, Mix PCR Fr3A semi-nested, acqua RNase/DNase free, Taq Poymerase (5U/µl) ed un controllo DNA Fr2A. Per ogni campione bisogna eseguire due distinte PCR; una che amplifica un frammento dalla zona Fr2A alla zona LJH ed un altro che amplifica un frammento dalla zona Fr3A alla zona LJH (PCR esterna). In seguito vengono fatte altre due PCR distinte più interne utilizzando l amplificato ottenuto dalle prime PCR (PCR interna) che vanno ad amplificare un frammento da Fr2A a VLJH ed un frammento da Fr3A a VLJH rispettivamente (semi nestad PCR). Per il controllo positivo utilizzare per i primi campioni che si eseguono il controllo dato dal Kit poi, in seguito, una soluzione di DNA amplificato precedentemente con successo con il Kit, questo arrangiamento si rende indispensabile in quanto il controllo positivo del Kit è fornito in quantità limitata. Pipettare in ogni tubo 2 µl di soluzione di DNA 75 ng/µl; nel caso in cui la concentrazione della soluzione madre non superi i 75 ng/µl non diluire il campione ma pipettare direttamente 2 µl di soluzione madre di DNA. 16

17 Preparazione del tubo di reazione FR2A-JLH e FR3A-LJH (PCR esterna): Nella provetta della mix pipettare 10 µl della Mix PCR Fr2A e nell altra provetta 10 µl Mix PCR Fr3A. Aggiungere in ognuna 0,125 µl di Taq Poymerase (5U/µl) e 13 µl di acqua RNase/DNase free. Aggiungere nei tubi di reazione contenente la soluzione di DNA, 23 µl di mix Fr2A dove si vuole amplificare il frammento Fr2A-LJH, e 23 µl di mix Fr3A dove si vuole amplificare il frammento Fr3A-LJH. Amplificazione FR2A-LJH/FR3A-LJH: Mettere i tubi di reazione nel termociclatore già impostato precedentemente con il seguente programma: Denaturazione per 5 minuti a 95 C (1 ciclo). Denaturazione per 1 minuto a 94 C, amplificazione per 1 minuto a 55 C ed estensione per 1 minuto a 72 C; questi passaggi vengono eseguiti per 30 cicli. Estensione finale per 10 minuti a 72 C un unica volta e poi i campioni vengono mantenuti a 10 C fino a che vengono prelevati dal termociclatore. Preparazione del tubo di reazione FR2A-VJLH e FR3A-VLJH (PCR interna): Pipettare in ogni tubo di reazione 1,5 µl di amplificato ottenuto dalle PCR FR2A-JLH e FR3A-LJH (PCR esterne). Nella provetta della mix preparata precedentemente pipettare 10 µl della Mix PCR Fr2A seminested e nell altra provetta 10 µl Mix PCR Fr3A semi-nested. Aggiungere in ognuna 0,125 µl di Taq Poymerase (5U/µl) e 14 µl di acqua RNase/DNase free. Aggiungere in ogni tubo di reazione contenente il prodotto delle PCR precedenti 24 µl di mix Fr2A semi-nested per i campioni che si vuole amplificare il frammento Fr2-VLJH, e 24 µl mix Fr3A seminested dove si vuole amplificare il frammento Fr3-VLJH. Amplificazione FR2A-LJH/FR3A-LJH: Mettere i tubi di reazione nel termociclatore già impostato precedentemente con il seguente programma: Denaturazione per 5 minuti a 95 C (1 ciclo). Denaturazione per 1 minuto a 94 C, amplificazione per 1 minuto a 55 C ed estensione per 1 minuto a 72 C; questi passaggi vengono eseguiti per 20 cicli. Estensione finale per 10 minuti a 72 C un unica volta e poi i campioni vengono mantenuti a 10 C fino a che vengono prelevati dal termociclatore. g) Analisi dei frammenti Materiale: o GeneScan-500 LIZ, Applied Biosystems UK, Lotto: o Formammide, Applied Biosystems, UK, Lotto: o Sequenziatore automatico 3130 Genetic Analyzer della ditta Applied Biosystems USA, Hitachi 17

18 o Genetic Analyzer, Data Colecction, Software v3.0 o GeneMapper Software, version 3.7 o MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate, Applied Biosystems USA o Termociclatore, Bio-Rad USA, DNA Engine, PTC-200 o Centrifuge 5415R, Eppendorf, Hamburg, Germania Protocollo: La visualizzazione del prodotto ottenuto dalle PCR con le metodiche LDM-ICP e BIRD, si eseguono con un sequenziatore automatico. I campioni di entrambe le amplificazioni necessitano di una preparazione prima di essere analizzati con l apparecchio. Tutte le manipolazioni dei campioni vengono eseguite sotto cappa e a luce spenta. La formammide permette di mantenere denaturato il DNA anche a basse temperature. Una fila della piastra di reazione possiede 8 pozzetti. Dato che l apparecchio è in grado di pescare 4 campioni contemporaneamente, se non si deve analizzare campioni in un numero multiplo di 4, aggiungere ai pozzetti vuoti 11 µl di formammide. Analisi dei frammenti Fr2-JH/Fr3-JH (Metodica LDM-ICP): Pipettare in un tubo da PCR 1 µl d amplificato, 0,25 µl di GeneScan-500 LIZ e 10 µl di formammide. Inserire i tubi in un termociclatore preimpostato a 90 C per 2 minuti così da denaturare i campioni. Dopo la denaturazione mettere subito i tubi in una scatola di polistirolo contenete ghiaccio per 15 minuti, coprire i campioni con un foglio d alluminio. Centrifugare i campioni a rpm per 15 secondi, trasferire poi 11 µl di campione nella piastra di reazione nell ordine predefinito precedentemente e registrati nel software connesso all apparecchio. Una volta registrati i campioni nel software si può precedere con l analisi. Nell amplificazione Fr2-JH sono attesi frammenti compresi tra bp; mentre nell amplificazione Fr3-JH sono attesi frammenti compresi tra bp. La presenza di uno o due picchi dominanti, di almeno un altezza doppia rispetto agli altri in entrambe le analisi indica una monoclonalità mentre la presenza di molti picchi indica una policlonalità (vedi figura 5). 18

19 Amplificazione Fr2-JH : Monoclonalità Amplificazione Fr2-JH : Policlonalità Amplificazione Fr3-JH : Monoclonalià Amplificazione Fr3-JH : Policlonalità Figura 5. La presenza di un picco monoclonale confermato più volte nell amplificazione Fr2-JH, Fr3-JH o entrambe indica una diagnosi di Linfoma a Cellule B. La PCR Fr2-JH amplifica frammenti di lunghezza che variano tra le 250 e 350 bp, mentre la PCR Fr3-JH amplifica frammenti tra 80 e 120 bp. Analisi dei frammenti FR2A-VLJH/FR3A-VLJH (Metodica BIRD): Con questa metodica abbiamo utilizzato due alternative per la preparazione dei campioni. La prima alternativa utilizza 0,5 µl di prodotto della seconda amplificazione, 0,25 µl di GeneScan- 500 LIZ e 10,5 µl di formammide; incubare per 2 minuti a 95 C e per 15 minuti in ghiaccio, centrifugare a rpm per 15 secondi e procedere a caricare 11 µl sulla piastra d analisi. La seconda alternativa utilizza 1 µl di prodotto della seconda amplificazione, 0,25 µl di GeneScan- 500 LIZ e 10 µl di formammide; incubare per 2 minuti a 95 C e per 15 minuti in ghiaccio, centrifugare a rpm per 15 secondi e procedere a caricare 11 µl sulla piastra d analisi. Utilizzare la prima alternativa, essendo più diluita, per l analisi dell FR3A-VLJH. Questo perché abbiamo constatato che al momento della visualizzazione c era un eccesso di fluorescenza, e non si poteva quindi dare un risultato attendibile. Nel caso in cui sia stato comunque osservato un eccesso di fluorescenza procedere a diluire il prodotto d amplificazione con acqua demineralizzata sterile con un fattore di diluizione congruo variabile da campione a campione, a seconda dell eccesso di fluorescenza osservato. Utilizzare la seconda alternativa per l analisi dell FR2A-VLJH, in quanto la PCR, che prevede frammenti di amplificazione maggiori, è risultata meno efficiente. Nell amplificazione FR2A-VLJH sono attesi frammenti compresi tra bp; mentre nell amplificazione FR3A-VLJH sono attesi frammenti compresi tra bp. La presenza di uno o due picchi dominanti, di almeno un altezza doppia rispetto agli altri in entrambe le analisi indica una monoclonalità. 19

20 Risultati i) Falsi negativi Due campioni, risultati precedentemente falsi negativi con la metodica dell LDM-ICP, in questo lavoro di diploma dopo nuova estrazione (sempre con l utilizzo dello stesso metodo), hanno evidenziato un picco monoclonale. Tale risultato è stato confermato con 3 ripetizioni della manipolazione. In 7 campioni si sono ottenuti gli stessi risultati per entrambe le metodiche; un campione non si è potuto valutare a causa del fatto che con entrambe le metodiche è risultato non amplificabile. Per 1 campione è risultata migliore la metodica BIRD (vedi figura 6) che è stata in grado di evidenziare un picco monoclonale dove la metodica LDM-ICP non è stata in grado con due differenti estrazioni; mentre per un altro campione è risultata migliore la metodica LDM-ICP per lo stesso motivo del precedente (vedi tabella 2). Due campioni non si sono potuti confermare a causa di un problema con il secondo Kit della BIRD. LDM-ICP diagnosi LDM-ICP Met. BIRD N Progr. FR2-JH FR3-JH FR2-JH FR3-JH FR2-JH FR3-JH OSSERVAZIONI 1 POLI POLI POLI POLI POLI POLI UGUALE 2 POLI POLI NA POLI 283 POLI BIRD MEGLIO DI LDM-ICP 3 NA POLI POLI /254 POLI UGUALE 4 POLI POLI NA NA NA NA NON VALUTABILE 5 POLI POLI POLI POLI POLI POLI UGUALE 6 POLI POLI NA POLI NA POLI UGUALE 7? POLI NA POLI BIRD PEGGIO DI LDM-ICP 8 NA NA NA 89 NA NA BIRD PEGGIO DI LDM-ICP 9 POLI POLI POLI POLI POLI POLI UGUALE 10 POLI POLI POLI POLI POLI POLI UGUALE 11 POLI POLI POLI POLI NA POLI UGUALE Tabella 2. Risultati ottenuti dalla seconda estrazione e analizzati con la metodica in uso presso LDM-ICP e metodica BIRD di tutti i campioni risultati falsi negativi dall analisi eseguita precedentemente dal LDM-ICP. La prima colonna di risultati (LDM-ICP diagnosi) sono i risultati ottenuti precedentemente dalle analisi del LDM. Da notare che 2 campioni, a differenza della prima estrazione, sono risultati positivi dopo la seconda estrazione. Il campione non valutabile è dovuto alla mancanza di materiale di partenza; questi campioni oltre ad essere biopsie, sono stati tagliati diverse volte, pertanto di alcuni campioni ne è rimasto poco. Legenda: Poli=Policlonalità; NA=Non amplificato; I numeri nelle colonne indicano la lunghezza in bp del frammento maggiormente rappresentato indice di una monoclonalità. ii) Positivi certi In 7 campioni si sono ottenuti gli stessi risultati per entrambe le metodiche; per 4 campioni è risultata migliore la metodica BIRD che è stata in grado di evidenziare un picco monoclonale dove la metodica LDM-ICP (con la seconda estrazione) non è stata in grado. Per 1 campione invece, è risultata migliore la metodica LDM-ICP che è stata in grado di evidenziare un picco monoclonale dove la metodica BIRD non è risultata sufficientemente efficace (vedi tabella 3). 20

21 LDM-ICP diagnosi LDM-ICP Met. BIRD N Progr. FR2-JH FR3-JH FR2-JH FR3-JH FR2-JH FR3-JH OSSERVAZIONI 12 NA 89 NA 89 NA 86 UGUALE POLI 277/261 POLI NA NA NON VALUTABILE 14 POLI 89 POLI 89 NA 99 UGUALE NA UGUALE 16 POLI 79 POLI 79 NA POLI BIRD PEGGIO DI LDM-ICP POLI 254 POLI 248 POLI UGUALE 18 POLI / UGUALE 19 POLI 98 POLI POLI UGUALE 20? 99 NA UGUALE POLI NA POLI NA 106 BIRD MEGLIO DI LDM-ICP 22 POLI 98 POLI POLI POLI 72 BIRD MEGLIO DI LDM-ICP POLI NA POLI 234 NA BIRD MEGLIO DI LDM-ICP 24 POLI 113 NA POLI NA 106 BIRD MEGLIO DI LDM-ICP Tabella 3. Risultati ottenuti dalla seconda estrazione e analizzati con la metodica in uso presso LDM-ICP e metodica BIRD di tutti i campioni risultati positivi dall analisi di Linfoma a cellule B eseguita precedentemente dal LDM-ICP. La prima colonna di risultati (LDM-ICP diagnosi) sono i risultati ottenuti precedentemente dalle analisi del LDM. Legenda: Poli=Policlonalità; NA=Non amplificato; I numeri nelle colonne indicano la lunghezza in bp del frammento maggiormente rappresentato indice di una monoclonalità. iii) Negativi certi In 6 campioni si sono ottenuti gli stessi risultati per entrambe le metodiche; in tutti i campioni la metodica LDM-ICP ha correttamente individuato solo policlonalità, mentre in 3 campioni la metodica BIRD ha evidenziato picchi monoclonali confermati più volte in campioni con diagnosi di Linfomi a cellule T e infiammazioni (vedi figura 6). LDM-ICP diagnosi Met. LDM-ICP Met. BIRD N Progr. FR2-JH FR3-JH FR2-JH FR3-JH FR2-JH FR3-JH OSSERVAZIONI 25 POLI POLI POLI POLI NA POLI UGUALE 26?? POLI POLI POLI POLI UGUALE 27 POLI POLI POLI POLI POLI POLI UGUALE 28 POLI POLI POLI POLI 254 POLI BIRD PEGGIO DI LDM-ICP 29 NA POLI NA POLI NA POLI UGUALE 30?? NA POLI NA POLI UGUALE 31?? POLI POLI POLI 101 BIRD PEGGIO DI LDM-ICP 32?? NA POLI NA 100 BIRD PEGGIO DI LDM-ICP 33?? NA POLI NA NA UGUALE Tabella 4. Risultati ottenuti dalla seconda estrazione e analizzati con la metodica in uso presso LDM-ICP e metodica BIRD di tutti i campioni risultati negativi dall analisi di Linfoma a cellule B eseguita precedentemente dal LDM-ICP. La prima colonna di risultati (LDM-ICP diagnosi) sono i risultati ottenuti precedentemente dalle analisi del LDM. Tre campioni su 9 si sono presentati come falsi positivi con la metodica BIRD. Per falsi positivi si intendono campioni negativi certi, come Linfomi a cellule T o infiammazioni, in cui nell analisi molecolare ha evidenziato la presenza di un riarrangiamento dominante (che non avrebbe dovuto essere presente). Legenda: Poli=Policlonalità; NA=Non amplificato; I numeri nelle colonne indicano la lunghezza in bp del frammento maggiormente rappresentato indice di una monoclonalità. Campioni dove non si hanno risultati precedenti in tabella sono indicati con un punto di domanda. 21

22 iv) Non analizzabili Due campioni classificati inizialmente come non analizzabili per l analisi molecolare e diagnosticati come infiammazioni nell analisi istologica, rifacendo l estrazione sono risultati amplificabili per il gene KRAS, così si è potuto procedere con l analisi per il linfoma a cellule B. In un campione si è ottenuto lo stesso risultato sia con la metodica LDM-ICP sia con la metodica BIRD. Nel secondo campione il risultato si discorda unicamente per il frammento Fr3-JH dove con la metodica LDM- ICP è risultato policlonale mentre con la metodica BIRD è risultato non amplificabile. LDM-ICP diagnosi Met. LDM-ICP Met. BIRD N Progr. FR2-JH FR3-JH FR2-JH FR3-JH FRA-JH FR3-JH OSSERVAZIONI 34 NA NA POLI POLI POLI POLI UGUALE 35 NA NA NA POLI NA NA UGUALE Tabella 5. Risultati ottenuti dalla seconda estrazione e analizzati con la metodica in uso presso LDM-ICP e metodica BIRD dei campioni risultati non amplificabili dall analisi di Linfoma a cellule B eseguita precedentemente dal LDM-ICP. La prima colonna di risultati (LDM-ICP diagnosi) sono i risultati ottenuti precedentemente dalle analisi del LDM. Legenda: Poli=Policlonalità; NA=Non amplificato; I numeri nelle colonne indicano la lunghezza in bp del frammento maggiormente rappresentato indice di una monoclonalità. Il campione 2, classificato come falso negativo, è risultato monoclonale con la metodica BIRD. non amplificato per l analisi Fr2-JH e policlonale per l analisi Fr3-JH con la metodica LDM-ICP (vedi figura 5) Figura 5. Il campione 2, classificato come falso negativo, è risultato non amplificato per l analisi FR2-JH (riquadro 1) e policlonale per l analisi Fr3-JH (riquadro 2) con la metodica LDM-ICP. La conferma di quest ultimo era l analisi eseguita precedentemente dal LDM risultato anch esso policlonale. Facendo l analisi con la metodica BIRD si è identificato un piccho monoclonale nell analisi Fr2A-VLJH (riquadro 3) e una policlonalità confermata più volte per l analisi Fr3A-VLJH (riquadro 4). Talvolta, per problemi di amplificazione in vitro, il picco di un frammento può apparire sdoppiato. 22

23 Il campione 31, classificato come negativo certo e diagnosticato come Linfoma a cellule T mediante la metodica LDM-ICP è risultato monoclonale, dunque diagnosi di Linfoma a cellule B, con la metodica BIRD (vedi figura 6) Figura 6. Il campione 31, classificato come negativo certo e diagnosticato come Linfoma a cellule T, analizzato con il metodo LDM-ICP è risultato policlonale sia per l analisi Fr2-JH (riquadro 1) che per l analisi Fr3-JH (riquadro 2), mentre con la metodica della ditta BIRD è risultato monoclonale per entrambe le anlalisi: 252 bp per Fr2A-VLJH (riquadro 3) e 101 bp per Fr3-VLJH(riquadro 4). Talvolta, per problemi di amplificazione in vitro, il picco di un frammento può apparire sdoppiato. 23

24 Osservazioni Nell ottobre 2008 è stato ordinato il Kit della ditta BIRD con sede a Napoli. Questo Kit contiene unicamente 45 test, dunque non è bastato per concludere ed ottenere tutti i risultati, soprattutto conferme e ripetizioni, necessari per il paragone delle due metodiche in esame. A fine marzo 2009 è stato ordinato il secondo Kit della ditta BIRD con arrivo in sede ad inizio aprile 2009; naturalmente il secondo kit aveva lotto differente e scadenza differente. Durante l analisi ci siamo accorti che aveva un problema con l analisi del frammento Fr3A-VLJH: non è stato amplificato alcun frammento, nè controlli interni nè campioni amplificati precedentemente con il primo kit dalla quale si erano ottenuti ottimi risultati. Per l analisi del frammento Fr2A-VLJH si sono viceversa ottenuti frammenti di amplificazione anche se i picchi sono risultati più bassi per confronto con le precedenti analisi ed alcuni campioni che già in precedenza presentavano picchi bassi con questo kit risultavano non amplificati. Abbiamo preso subito contatto con la ditta la quale ci ha inviato unicamente la mix per l analisi Fr3A-VLJH, senza la Taq polimerasi; fortunatamente nel kit difettato c era ancora della restante Taq polimerasi, sufficiente per poter concludere il confronto tra metodiche. 24