UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FIRENZE

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FIRENZE Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali Tesi di Laurea Triennale in SCIENZE BIOLOGICHE di Simone Li Puma Caratterizzazione della struttura e della genetica di popolazione di Testudo hermanni in un'area naturale della Toscana. Characterization of the structure and the population genetics of Testudo hermanni in a natural area in Tuscany. Relatore: Prof. Marco Vannini Correlatrice: Dott.ssa Sara Fratini Anno Accademico 2010/2011

2 INDICE 1 INTRODUZIONE pag Biodiversità ed estinzione. pag La IUCN. pag Diversità genetica delle popolazioni naturali. pag L'equilibrio di Hardy-Weinberg. pag Fattori che influenzano la diversità genetica. pag Conseguenze della ridotta dimensione della popolazione. pag Effetti del collo di bottiglia e deriva genetica. pag Effetti dell'inincrocio. pag Cause genetiche dell'estinzione. pag Gestione delle specie in pericolo. pag Uso dei microsatelliti nella genetica di popolazione. pag Scopo della tesi. pag MATERIALI E METODI pag Specie di studio: Testudo hermanni. pag Area di studio e campionamento. pag Analisi genetiche. pag Estrazione del DNA. pag PCR (Polymerase Chain Reaction). pag Microsatelliti utilizzati. pag Sizing (analisi genotipica). pag Analisi dei dati. pag RISULTATI pag. 39 2

3 3.1 Struttura della popolazione. pag Diversità genetica nella popolazione. pag Confronto fra il gruppo di animali nativi e immessi. pag Relazioni di parentela. pag CONCLUSIONI pag BIBLIOGRAFIA pag RINGRAZIAMENTI pag. 62 3

4 1. INTRODUZIONE 1.1 Biodiversità ed estinzione. Per biodiversità si intende comunemente l'insieme della varietà naturale degli ecosistemi e delle specie che ne fanno parte, intesa come diversità genetica inter- e intra-popolazionale. Mantenere la biodiversità naturale degli ecosistemi si rivela essere molto importante per vari motivi, fra i quali certamente sono da annoverare i fini etici oltre che quelli di corretto sfruttamento delle biorisorse e dei servizi resi dall'ecosistema: fenomeni quali la produzione di ossigeno da parte delle piante, i cicli di nutrienti, l'impollinazione, e altri ancora, non esisterebbero senza un'adeguata biodiversità naturale. La biodiversità può essere mantenuta solo fintanto che le eventuali estinzioni di specie in pericolo siano bilanciate da un egual numero di processi di 'speciazione', ovvero di origine di nuove specie a partire da popolazioni isolate di individui che subiscono pressioni evolutive diverse rispetto ai loro simili e se ne differenziano progressivamente. Si è calcolato infatti che normalmente le specie persistono tipicamente per circa 5-10 milioni di anni, prima di estinguersi. Diverso però è il discorso quando si parla di estinzioni di massa : in questi casi il numero di estinzioni è talmente elevato che i normali processi di speciazione non bastano a bilanciarne l'effetto deleterio sulla biodiversità globale. Questo è ciò che si sta verificando in epoca attuale: la biodiversità del pianeta sta rapidamente diminuendo sotto l'effetto continuo, diretto e indiretto, delle attività umane, che sempre di più giocano un ruolo fondamentale nel complesso sistema di funzionamento della natura. Un numero infatti attualmente sconosciuto, ma certamente molto elevato, di specie è già andato incontro ad estinzione, e moltissime altre specie stanno subendo una drastica riduzione della dimensione delle popolazioni di individui che le costituiscono, e ciò rappresenta un grosso rischio. Non a caso si parla di sesta estinzione : il fenomeno sta infatti lentamente assumendo le proporzioni di un'estinzione di massa. In realtà, a livello 4

5 generale, la proporzione di specie estinte potrebbe sembrare modesta, in quanto considerando mammiferi e uccelli solo l'1-2% delle specie sono da considerarsi a conti fatti estinte, pur essendo state documentate all'incirca 700 estinzioni dal XVII secolo ad oggi. Quello che preoccupa è però l'andamento dell'estinzione, il cui tasso è rapidamente aumentato in maniera notevole nel corso del tempo. Ma cosa causa l'estinzione di una specie? Oggigiorno sempre più importanti si stanno rivelando i fattori associati all'attività dell uomo per quanto riguarda la sopravvivenza di specie a rischio, e l'impatto umano si prospetta sarà sempre più negativo nel prossimo futuro. Le attività antropiche causano infatti cambiamenti ambientali troppo rapidi perché le specie possano evolvere adattamenti di risposta. A dare una mano all'attività antropica però, sono anche i fattori stocastici: per stocasticità si intende tutta una serie di fluttuazioni casuali a cui le popolazioni sono naturalmente sottoposte, variazioni dettate dal caso che possono avere origini ambientali, demografiche e/o genetiche. La stocasticità ambientale rappresenta una variazione di quei fattori ambientali che vanno a costituire la nicchia ecologica della specie in studio, siano essi la disponibilità di nutrienti o la percentuale di precipitazioni, o ancora il livello di esposizione alla luce solare. Nella stocasticità ambientale rientrano anche le variazioni date da eventuali catastrofi come alluvioni, uragani e simili, in quanto questi sono chiaramente fenomeni che causano conseguenze stocastiche sulle nicchie ecologiche originali. La stocasticità demografica è la semplice e casuale variazione dei rapporti fra nascite e decessi o fra maschi e femmine che avviene comunemente in qualsiasi popolazione. Infine, con stocasticità genetica, si intendono quelle variazioni a livello genetico che hanno un impatto deleterio sulla specie, in particolar modo la perdita di variabilità genetica causata dalla riduzione delle dimensioni della popolazione, con conseguente inincrocio (inbreeding) che riduce ulteriormente le dimensioni della popolazione (aumentando il numero dei decessi e riducendo quello delle nascite), riducendo quindi di conseguenza ancora la variabilità genetica: si parla in questi casi di vortice di estinzione. 5

6 1.1.1 La IUCN. La IUCN (Unione Internazionale per la Conservazione della Natura) è un organo preposto a definire quali specie siano minacciate dal rischio di estinzione e quali invece non corrano per adesso questo rischio. Le specie possono venire correntemente classificate dalla IUCN come: specie in pericolo critico (critically endangered), specie in pericolo (endangered), specie vulnerabili (vulnerable), specie a più basso rischio (lower risk). La classificazione avviene sulla base dell'osservazione del livello di riduzione della dimensione delle popolazioni, dell'attuale dimensione stessa delle popolazioni, della restrizione dell'area dell'habitat, e della probabilità prevista di estinzione in termini quantitativi (Tabella 1). Uno dei più recenti aggiornamenti delle cosiddette Liste Rosse IUCN (gli elenchi delle specie minacciate) ha evidenziato come la biodiversità in Europa stia subendo un allarmante calo, soprattutto per quanto riguarda gli organismi d'acqua dolce, calo che però ovviamente si ripercuote su tutto l'ecosistema: il 44% di tutti i molluschi d'acqua dolce, il 37% dei pesci, il 20% degli anfibi, il 19% dei rettili, il 15% dei mammiferi e il 13% degli uccelli sono ormai da considerarsi specie minacciate ( 1.2 Diversità genetica delle popolazioni naturali. La diversità genetica si rivela essere per le popolazioni una fonte insostituibile di vitalità, in quanto di fronte al cambiamento ambientale continuo essa è necessaria per garantire alle popolazioni sufficienti vie di adattamento alle nuove condizioni cui nel tempo si ritrovano a dover far fronte. La perdita di diversità genetica è quindi una delle cause fondamentali del rischio di estinzione, in associazione all'inincrocio e alla complessiva e consequenziale perdita di successo evolutivo 6

7 per via della riduzione della fitness della popolazione (riproduzione, e sopravvivenza dei riprodotti stessi). Criteri (uno qualunque tra A e E) Specie in pericolo critico Specie in pericolo Specie vulnerabile A. Riduzione osservata o prevista della dimensione della popolazione 80% di riduzione negli ultimi 10 anni o in 3 generazioni 50% 20% B. Estensione dell'area frequentata o occupata < 100 km 2 < 10 km 2 e due dei seguenti punti: 1) gravemente frammentata o nota per esistere in un unico sito 2) diminuzione continua 3) fluttuazioni estreme < 5000 km 2 < 500 km 2 5 siti < km 2 < 2000 km 2 10 siti C. Popolazione osservata e declino stimato continuo o popolazione gravemente frammentata < 250 individui maturi < 2500 < D. Popolazione stimata in < 50 individui maturi < 250 < 1000 E. Analisi quantitative che indicano la probabilità di estinzione allo stato selvatico Almeno il 50% entro 10 anni o in 3 generazioni, qualunque dei due sia più lungo Almeno il 20% entro 10 anni o in 5 generazioni Almeno il 10% entro 100 anni Tabella 1: criteri di classificazione IUCN per le specie minacciate (IUCN 2002). Il livello di diversità genetica esistente all'interno di una popolazione si esprime generalmente attraverso tre parametri: il polimorfismo, l'eterozigosità media e la diversità allelica. 7

8 Definendo 'locus' il sito su un cromosoma in cui è posizionato un particolare gene, per polimorfismo si intende la presenza all'interno di una specie o popolazione di due o più alleli per un determinato locus. Una popolazione si definisce monomorfica per un certo locus quando per quel locus è presente un solo allele, uguale in tutti gli individui (l'allele ha una frequenza superiore a 0.99, o a 0.95 se si vogliano minimizzare eventuali incongruenze date dalle dimensioni diverse del campione preso in esame). In tali casi la diversità genetica è totalmente ridotta a zero, in quanto tutti gli individui sono omozigoti per lo stesso allele. Un individuo è omozigote se possiede due copie dello stesso allele, eterozigote se invece le due copie sono diverse: l'eterozigosità media di una popolazione (che si indica con H) è la somma delle proporzioni degli eterozigoti per ciascun locus divisa per il numero totale di loci campionati, e quanto più è bassa tanto più è ridotta la diversità genetica della popolazione. La diversità allelica infine (indicata con A), è la media aritmetica del numero di alleli contenuti nella popolazione per ogni locus e, anche in questo caso, essa è direttamente proporzionale all'ammontare della diversità genetica intra-popolazionale. C'è da specificare che la diversità genetica varia da un locus ad un altro nell'intero patrimonio genetico posseduto da ciascun individuo: di solito infatti i livelli più alti di diversità genetica si riscontrano in quelle sequenze di DNA che possiedono uno scarso rilievo funzionale, e che pertanto sono maggiormente soggette all'insorgenza di mutazioni casuali, che poi non vengono riparate. L'esempio forse più famoso è quello dei microsatelliti: motivi nucleotidici molto corti (1-6 paia di basi) ripetuti consecutivamente lungo il filamento di DNA e molto comuni negli organismi eucarioti, che possono arrivare ad avere tassi mutazionali di 10-4 per generazione, valori ben più alti di altre sequenze funzionalmente più importanti (Hearne et al., 1992; Edwards et al., 1992). Esistono varie tecniche per misurare la diversità genetica in una popolazione, a partire dall'elettroforesi di proteine (che però sottostima il reale livello di diversità genetica in quanto solo il 30% circa della variabilità del DNA si riflette poi in un'effettiva variabilità di proteine espresse), per passare al sequenziamento di loci di DNA nucleare amplificati tramite PCR (Polymerase Chain Reaction), o ancora 8

9 all'analisi del DNA mitocondriale, che però viene solitamente trasmesso solo per via materna e si rivela quindi essere più utile ai fini della risoluzione di ambiguità tassonomiche o della comprensione della biologia di una specie, piuttosto che ai fini di uno studio sulla variabilità genetica inter-individuale. Si può ottenere una stima della diversità genetica di una popolazione sfruttando il concetto dell'equilibrio di Hardy-Weinberg L'equilibrio di Hardy-Weinberg. Ponendo il caso di una popolazione in cui vi sia accoppiamento casuale, e siano invece assenti quei fattori che controllano l'evoluzione, quali la mutazione, la migrazione o la selezione, si ha che le frequenze alleliche e quelle genotipiche date dall'appaiamento di coppie di alleli (in organismi diploidi) raggiungono dopo una sola generazione un equilibrio. Tale equilibrio viene definito equilibrio di Hardy-Weinberg e getta le basi per studiare quanto una popolazione diverga dall'accoppiamento casuale o quanto quindi subisca l'effetto della selezione naturale o di altri fattori. Secondo l'equilibrio di Hardy-Weinberg, all'interno di una popolazione, definendo p e q le frequenze relative nella popolazione degli alleli dominanti e recessivi per un tale carattere espresso, si può rappresentare il numero totale di omozigoti per l'allele p come p 2, il numero di omozigoti per l'allele q come q 2 e il numero degli eterozigoti come 2pq. Per una popolazione all equilibrio vale p 2 + q 2 + 2pq = 1. Per ottenere tale equilibrio bisogna però fare certe assunzioni: la popolazione deve avere grande dimensione; deve essere chiusa (non deve quindi esserci migrazione di individui); devono essere assenti le mutazioni; gli alleli devono seguire un normale processo di segregazione mendeliana; i genotipi parentali devono avere tutti lo stesso livello di fertilità e la stessa capacità di sopravvivenza; i gameti devono potersi unire casualmente e devono avere un'identica capacità di fertilizzazione. L'equilibrio di Hardy-Weinberg è valido per qualsiasi locus (eccetto quelli localizzati sui cromosomi sessuali). Secondo questa teoria la 9

10 frequenza degli eterozigoti non può essere maggiore del 50% per un locus con due alleli; l equilibrio di Hardy-Weinberg prevede inoltre che, quando un allele è raro, è più frequente riscontrarlo in individui eterozigoti, mentre invece quando è un allele comune è più facile trovarlo in individui omozigoti. Calcolate le frequenze alleliche e genotipiche di una popolazione, grazie all'equilibrio di Hardy-Weinberg si può valutare quanto esse si discostino da esso e quanto quindi siano a rischio di estinzione, poiché esso dipende strettamente dalle dimensioni della popolazione, dalla variabilità genetica di essa e da quanto siano importanti per quella popolazione gli effetti di mutazione, migrazione e selezione Fattori che influenzano la diversità genetica. La diversità genetica è alla base del processo di evoluzione, e se manca la prima, non può esserci la seconda, in quanto (come già detto) le popolazioni naturali necessitano di una sufficiente variabilità che permetta loro di potersi adattare ai continui cambiamenti dell'habitat in cui vivono. Ma quali fattori influenzano la diversità genetica? Innanzitutto la mutazione, che rappresenta di per sé una forza evolutiva debole nell'arco di brevi periodi poiché solitamente i tassi di mutazione sono molto bassi, pur essendoci zone del DNA che tendono a mutare più facilmente. Si definisce una mutazione come un cambiamento genetico improvviso in un allele o in un cromosoma, ed essa rappresenta l'unica possibilità di rigenerare la diversità genetica di una specie quando quest'ultima la perda quasi completamente. A conti fatti, solo una piccola parte di mutazioni risulta essere vantaggiosa (di quelle con effetti fenotipici forse solo l'1-2%). Allo stesso modo esiste una certa porzione di mutazioni che caratterizza i cosiddetti alleli deleteri, ovvero alleli che non sono adatti alla sopravvivenza della specie nell'habitat in cui vive, che assumono generalmente la caratteristica di alleli recessivi, e che sono una possibile fonte di morte di un individuo se in condizioni di omozigosi. Un altro fattore che influenza la diversità genetica è la migrazione (o flusso 10

11 genico) tra popolazioni diverse, ovvero lo spostamento di individui da una popolazione ad un'altra che comporta un rimescolamento degli alleli e un (eventuale) più rapido ripristino della diversità. Se un individuo immigrante possiede uno o più alleli assenti nella popolazione ricevente, tali alleli non solo vengono inseriti nel pool genico della popolazione, ma in caso di accoppiamento con successo, vengono anche fissati nella popolazione in quanto la loro frequenza relativa aumenta nel momento in cui vengono prodotti nuovi individui di generazione in generazione. La migrazione tende generalmente a ridurre le differenze genetiche fra popolazioni diverse. C'è da dire che però non sempre la migrazione può avere effetti positivi: molte specie in pericolo sono infatti minacciate dal flusso genico proveniente da specie imparentate più o meno lontanamente ma non in pericolo, che fa sì che i nuovi alleli sostituiscano gradualmente gli alleli della popolazione ricevente piuttosto che arricchirne la variabilità. Si tratta di depressione da esoincrocio (outbreeding) ed è il caso, ad esempio, di una popolazione di stambecchi delle Alpi della Cecoslovacchia, abituati a riprodursi d'inverno e a far nascere i piccoli in primavera: incrociati con individui di sottospecie diverse, aventi quindi diversi adattamenti locali, questi stambecchi finirono per avere un ciclo riproduttivo sfasato, con l'accoppiamento spostato verso l'estate, e la nascita dei piccoli spostata nel periodo invernale. La conseguenza diretta fu la morte degli individui giovani, non ancora adatti alle rigide temperature (Templeton, 1986). Un terzo fattore che regola la diversità genetica è, dopo gli effetti del caso (molto importanti nelle popolazioni di piccole dimensioni), la selezione: essa è una forza che determina il successo di quegli individui capaci di adattarsi ai cambiamenti dell'ambiente in cui vivono, aumentandone la fitness. Gli adattamenti possono in genere presentarsi come modificazioni fisiologiche, comportamentali o genetiche: se però i cambiamenti ambientali sono eccessivamente estremi, c'è la possibilità che nessun individuo riesca a farvi fronte e allora le specie si estinguono. La selezione naturale agisce come una forza che plasma le popolazioni favorendo i genotipi che volta per volta possiedono i più alti tassi di sopravvivenza e di riproduzione in relazione all'ambiente circostante e alle risorse che offre. Pertanto, definendo fitness relativa il tasso di sopravvivenza del singolo genotipo sulla 11

12 totalità degli individui, ogni allele che determina cambiamenti nelle fitness relative degli individui che lo possiedono sarà soggetto a selezione. In questo modo le frequenze di eventuali alleli particolarmente di successo aumentano di generazione in generazione fino a fissare l'allele nella popolazione, e la rapidità della fissazione dipende strettamente dalla forza con cui agisce la selezione naturale e dalle frequenze alleliche iniziali. Tutto questo dipende però anche da quanto un certo carattere venga trasmesso alle generazioni successive: si definisce questo nuovo parametro ereditabilità (indicata con h 2 ), e rappresenta la proporzione di variabilità genetica per un dato carattere dovuta alle sole differenze genetiche e non a quelle ambientali. Caratteri espressi da alleli che sono caratterizzati da un'alta ereditabilità avranno una maggiore risposta alla selezione, e viceversa caratteri con ereditabilità inferiore non verranno inficiati dalla selezione naturale. Conseguentemente le ereditabilità possono essere sfruttate per predire coscienziosamente la risposta evolutiva di una data popolazione ad un certo cambiamento ambientale. Generalmente, a parità di ambiente, le popolazioni con maggiore grado di eterozigosità possiedono valori di ereditabilità medi più alti. Per quanto riguarda lo stretto rapporto che interconnette mutazione e selezione, quest'ultima ha il potere di riuscire a rimuovere da una popolazione eventuali alleli deleteri, con un tempo però talmente lungo, e un numero talmente vasto di generazioni, che nuove mutazioni deleterie finiscono per insorgere prima ancora che le precedenti siano state eradicate. Si tende quindi a raggiungere un delicato bilanciamento fra comparsa di alleli deleteri per mutazione ed eliminazione di essi tramite selezione che prende il nome di equilibrio mutazione-selezione. Pertanto tutte le popolazioni naturali con esoincrocio sono contraddistinte da una permanente bassa frequenza di alleli deleteri definita carico mutazionale. L'inincrocio nelle popolazioni naturali ha invece l'effetto di aumentare la probabilità che questi alleli deleteri emergano in omozigosi. 1.3 Conseguenze della ridotta dimensione della popolazione. 12

13 Che ormai alcune specie abbiano raggiunto numeri così esigui da essere presenti quasi solo in cattività è un dato di fatto. E proprio queste popolazioni, soprattutto se piccole e isolate, possono andare incontro ad una serie di problemi genetici o comportamentali collegati alla loro ridotta dimensione (Hedrick et al., 2000). I problemi più frequenti nelle piccole popolazioni sono soprattutto l'aumento dei fenomeni di inincrocio e la diminuzione della fitness riproduttiva, con conseguente riduzione della diversità genetica e della capacità evolutiva in risposta ai cambiamenti ambientali (Boakes et al., 2007) Effetti del collo di bottiglia e deriva genetica. Genericamente la riduzione drastica della dimensione di una popolazione naturale viene definita effetto da collo di bottiglia (bottleneck): questo può avvenire in seguito all'azione di forze atipiche di selezione naturale (come la caccia o le persecuzioni che si sono verificate contro particolari specie animali nel corso della storia dell'uomo), oppure perché una parte di una popolazione si ritrova ad essere completamente isolata dal resto, sia per via di spostamenti migratori anomali che per via dell'improvvisa intrusione di barriere geografiche prima inesistenti (a seguito di catastrofi naturali, ad esempio). Ciò che ne consegue è che i pochi individui rimasti sono portatori solo di una minima parte della totalità di alleli originariamente presenti nella popolazione, e rappresentano perciò una ridotta frazione casuale della diversità genetica iniziale (effetto del fondatore) (Willis et al., 1993). Conseguentemente si avrà un totale cambiamento delle frequenze alleliche e la perdita di alcuni alleli, in particolare quelli rari, e soprattutto una perdita generale dell'eterozigosità (Kirkpatrick et al., 2000). Tutto questo opera tramite un processo che si definisce deriva genetica casuale : quando in una popolazione diploide a riproduzione sessuale due individui si riproducono, la generazione successiva deriverà da un campione di gameti parentali. Se la popolazione è piccola però, può succedere che certi alleli 13

14 (soprattutto se rari) possano non venire trasmessi per puro effetto del caso. Le frequenze alleliche fluttuano quindi in continuazione da una generazione a quella seguente (Allendorf et al., 2007). Questo ha, per periodi lunghi di tempo, tre specifiche conseguenze: innanzitutto un calo della diversità per fissazione degli alleli più comuni nelle popolazioni e perdita invece di quelli rari, con conseguente riduzione del potenziale evolutivo (Boakes et al., 2007); secondariamente una maggiore diversificazione tra sottopopolazioni derivanti da una stessa popolazione d'origine (popolazioni frammentate); infine una definitiva prevalenza degli effetti di deriva genetica su quelli di selezione naturale (Crow et al., 1970; Glemin, 2003). Chiaramente fluttuazioni delle frequenze alleliche in popolazioni piccole saranno molto più ampie che in popolazioni grandi e maggiormente stabili. Le popolazioni naturali frammentate quindi andranno incontro a questo tipo di effetti per tutti i loro loci genetici, e quelle di piccole dimensioni in particolare subiranno una maggiore deriva genetica di quelle grandi. Le popolazioni risultanti da un collo di bottiglia hanno in media un'eterozigosità inferiore a quella di partenza e un numero di alleli più basso. La proporzione di eterozigosità iniziale mantenuta dopo una sola generazione di collo di bottiglia equivale a H 1 /H 0 = 1-1/2N, in cui H 1 rappresenta l eterozigosità immediatamente successiva al collo di bottiglia ed H 0 quella iniziale. La proporzione dell eterozigosità iniziale persa è 1/2N, per cui, in linea teorica, colli di bottiglia della durata di una sola generazione dovrebbero essere molto forti per avere un impatto considerevole sull'eterozigosità. La perdita generale della diversità genetica deriva quindi più da riduzioni sostanziali della dimensione della popolazione, che da singole generazioni di colli di bottiglia (Frankham et al., 2006). Ad ogni modo però le perdite possono accumularsi nel tempo, e in tal caso il declino dell'eterozigosità previsto nel tempo è esponenziale, ed è tanto più rapido quanto più brevi sono le generazioni della specie in esame (Kirkpatrick et al., 2000) Effetti dell'inincrocio. 14

15 Come conseguenza diretta della ridotta dimensione della popolazione si ha che in popolazioni chiuse con il tempo ogni individuo diventa parente di qualcun altro, cosicché gli incroci tra individui non correlati diventano praticamente impossibili (Boakes et al., 2007). L'incrocio così inevitabile tra individui imparentati (che non è il risultato di una scelta attiva, ma semplicemente una conseguenza del piccolo numero di fondatori e della ridotta dimensione della popolazione) è definito inincrocio (inbreeding), e si definisce depressione da inincrocio (inbreeding depression) la drastica riduzione di fitness riproduttiva che ne consegue. Difatti l'inincrocio causa nella popolazione una riduzione dell'eterozigosità, una diminuzione della fertilità e della sopravvivenza e un aumento del rischio di estinzione (Kristensen et al., 2005; Kalinowski et al., 1999). Gli individui nati da inincrocio vanno generalmente incontro ad una maggiore mortalità giovanile, rispetto a quelli nati da esoincrocio, e presentano spesso caratteristiche qualitative più scarse. Con l'inincrocio la progenie ha un'aumentata probabilità di ereditare alleli che sono copie recenti della stessa sequenza di DNA (identità per discesa) (Hedrick et al., 2000). La probabilità che quindi in un individuo gli alleli per un certo locus siano identici per discesa è il coefficiente di inincrocio (F), che dà una stima approssimativa della presenza di inincrocio in una popolazione e varia tra 0 e 1 a seconda che esso sia un fenomeno totalmente assente o presente all'interno di una popolazione. In questo modo la frequenza degli eterozigoti si riduce considerevolmente venendo dimezzata da una generazione all'altra, mentre aumenta quella degli omozigoti (rispetto alle frequenze attese dall'equilibrio di Hardy-Weinberg). In una popolazione quindi un'eventuale deficienza di individui eterozigoti può essere sintomo della presenza di accoppiamento non casuale. In una situazione di questo tipo gli omozigoti per gli alleli recessivi finiscono per diventare molto più frequenti che in una normale popolazione con accoppiamento casuale, e se si parla di alleli deleteri, è ovvio che questo sia un grosso rischio (Grueber et al., 2008). I valori di F possono normalmente venire calcolati confrontando l'eterozigosità 15

16 osservata (H o ) con quella attesa (H e ): F = 1 H o /H e. L'inincrocio aumenta con le generazioni in tutte le popolazioni ridotte e chiuse (in cui non sia presente flusso genico), ad un tasso che dipende dalla loro dimensione. Tuttavia in molte specie l'inincrocio è un fenomeno raro in quanto sono stati evoluti meccanismi che evitano tutto ciò e che coinvolgono due dei più variabili loci genetici conosciuti, ossia quello di autocompatibilità (SI) nelle piante e quello del sistema maggiore di istocompatibilità (MHC) nei vertebrati. Gli effetti dell'inincrocio dipendono anche dalla struttura della popolazione. Va innanzitutto detto che la dimensione effettiva di una popolazione (N e ) è la dimensione di una popolazione ideale che andrebbe incontro ad una perdita di diversità genetica di intensità identica a quella della popolazione reale in esame: è un valore netto che esprime il comportamento genetico di una popolazione reale relativamente a quello di una popolazione ideale. Se ad esempio una popolazione censita conta 1000 individui ma perde diversità genetica allo stesso ritmo con cui la perderebbe una popolazione ideale di 100 individui, si dirà che la dimensione effettiva di quella popolazione è 100 e non A conti fatti risulta sempre: N e < N (di circa il 10%), per via di vari fattori che causano deviazioni come ad esempio un rapporto sbilanciato tra i due sessi o la variazione delle dimensioni delle singole famiglie di individui, o ancora fluttuazioni casuali nella dimensione della popolazione. Fatta questa premessa, e considerato il fatto che popolazioni già piccole si trovano ad avere una dimensione effettiva veramente molto esigua, va specificato che in natura spesso e volentieri le popolazioni sono frammentate. L'impatto della frammentazione su diversità genetica, inincrocio e rischio di estinzione dipende strettamente dal livello di flusso genico che connette le sottopopolazioni, che a sua volta può dipendere da svariati fattori quali il numero stesso delle sottopopolazioni, le loro dimensioni e la loro distribuzione geografica, oppure la distanza che le separa. Se c'è un basso flusso genico, tutti quei fenomeni riguardanti la perdita di diversità genetica e la depressione da inincrocio si acuiscono. Il livello di frammentazione e di differenziazione fra le sottopopolazioni può essere misurato stimando proprio i coefficienti di inincrocio a diversi livelli, secondo le cosiddette statistiche F o F-stat : ponendo H I 16

17 l'eterozigosità osservata mediata fra tutte le sottopopolazioni, H S l'eterozigosità attesa dall'equilibrio di Hardy-Weinberg mediata fra tutte le sottopopolazioni, e H T quella attesa per l'equivalente popolazione totale (somma delle sottopopolazioni), si possono calcolare differenti coefficienti di inincrocio: F IS = 1 - H I /H S rappresenta l'inincrocio all'interno delle singole sottopopolazioni; F IT = 1 - H I /H T rappresenta l'inincrocio all'interno della popolazione nel suo totale; F ST = 1 H S /H T è invece una misura di quanto le sottopopolazioni risultino essere diverse tra loro. Quest'ultimo valore varia tra 0 e 1 a seconda che non ci siano differenziazioni considerevoli fra le sottopopolazioni o che in esse ci sia una vera e propria fissazione di alleli differenti in atto Cause genetiche dell'estinzione. Come già detto in precedenza, la progenie inincrociata ha valori minori di sopravvivenza e capacità riproduttiva rispetto a quella originata da esoincrocio. La depressione da inincrocio è stata in realtà osservata in ogni specie naturale. È stato appurato che essa è più elevata in condizioni di stress, è maggiore se l'inincrocio che la causa procede più velocemente, ed è presente ad un livello generalmente minore del solito anche in specie che si inincrociano naturalmente. La depressione da inincrocio dipende strettamente da due differenti processi, che sono la dominanza e il vantaggio dell'eterozigote. La dominanza è quel fenomeno per cui attraverso l'inincrocio aumenta la frequenza degli omozigoti per gli alleli deleteri recessivi, permettendo loro di essere espressi. Col vantaggio degli eterozigoti invece gli alleli che determinano una fitness maggiore in eterozigosi aumentano la depressione da inincrocio nel momento in cui quest'ultimo diminuisca la frequenza proprio di quegli eterozigoti che sarebbero avvantaggiati e più adatti all'habitat, aumentando invece quella degli svantaggiati omozigoti. In presenza di dominanza di un allele vantaggioso, teoricamente l'azione della selezione potrebbe ridurre la frequenza degli alleli deleteri (azione purificante o purging selection), ma questo non è possibile in presenza di vantaggio 17

18 dell'eterozigote. Pertanto la dominanza contribuirebbe maggiormente alla depressione da inincrocio. Numerosi studi (Templeton et al., 1983; Ralls et al., 1986; Reed et al., 2001) hanno tentato di dimostrare il possibile intervento della purging selection nel diminuire l'aumento di alleli deleteri dovuto all inincrocio: secondo alcuni autori, infatti, sarebbe possibile eliminare naturalmente e rapidamente, attraverso la selezione naturale, molti degli effetti negativi dell inincrocio proprio incrementando intenzionalmente l inincrocio stesso. Tuttavia i risultati degli studi sembrano variare molto a seconda delle specie in questione e delle condizioni di mantenimento in cattività (Reed et al., 2003; Armbruster et al., 2005), senza contare il fatto che raramente si riescono ad apprezzare i benefici in termini di aumento della fitness. In generale è quindi meglio cercare di evitare l inincrocio e di mantenere il massimo livello possibile di diversità genetica. La depressione da inincrocio può essere stimata confrontando la fitness di organismi inincrociati con quella di gruppi di controllo originati con esoincrocio. Per capire quanto l'inincrocio sia fondamentale come causa di estinzione, si può fare riferimento ad uno studio che venne condotto anni fa su varie popolazioni di specie diverse deliberatamente inincrociate: il risultato ottenuto era che, in linea di massima, dopo sole otto generazioni di accoppiamento fratello-sorella la percentuale di estinzione nelle popolazioni oscillava fra l'80% e il 100% (Frankham, 1995). Chiaramente anche tassi inferiori di inincrocio aumentano il rischio di estinzione, è solo necessario un po' più tempo perché se ne osservino gli effetti. Evidenze dirette del palese coinvolgimento dell'inincrocio nell'estinzione di popolazioni naturali sono fornite da vari altri studi condotti ad esempio sulle farfalle finlandesi (Saccheri et al., 1998) o sulle pecore delle Montagne Rocciose (Berger, 1990). Ciò che emerge è che sembra che le popolazioni minori di 50 individui siano condannate all'estinzione nel giro di 50 anni. Esiste però anche un numero limitato di esempi in cui le estinzioni di popolazioni naturali possono essere direttamente attribuite alla sola assenza di variabilità genetica. La prova più diretta è fornita dagli studi sui loci di auto-compatibilità delle piante, i cui alleli possono andare persi in piccole popolazioni a causa della deriva genetica, e ciò, a lungo andare, comporta una ridotta produzione di semi e, 18

19 successivamente, l'estinzione. Un esempio ancora più eclatante è costituito dagli attacchi di organismi patogeni, che rappresentano una grande minaccia per tutte le specie: una bassa diversità genetica diminuisce drasticamente la capacità delle popolazioni di resistere a tale pressione tramite il proprio sistema immunitario (il sistema maggiore di istocompatibilità MHC nei vertebrati), in quanto esso funziona proprio tramite un meccanismo di elevata variazione dei loci, e quanto più alto è il livello di eterozigosità di un individuo, tanto più alto sarà il numero di patogeni contro cui sarà in grado di combattere per difendersi. Si pone dunque l'interrogativo di stabilire quanto una popolazione debba essere grande per mantenersi geneticamente vitale per lunghi periodi di tempo. La dimensione minima viene definita minima popolazione vitale (Minimum Viable Population, MVP) e può essere stabilita considerando che una popolazione, per rimanere vitale, debba poter avere le condizioni necessarie a mantenere una buona fitness riproduttiva, un buon potenziale evolutivo, e un buon livello di diversità genetica per singolo locus sul lungo periodo. Secondo alcuni una dimensione effettiva di 50 individui sarebbe sufficiente ad evitare la depressione da inincrocio nel breve periodo (Franklin, 1980). Per poter mantenere un'adeguata diversità genetica e un buon potenziale evolutivo a lungo termine invece, molti sono d'accordo nel porre una MVP effettiva di 500. In queste analisi va però sempre tenuto conto del fatto che la dimensione effettiva N e di una popolazione naturale corrisponde a conti fatti sempre a circa il 10-11% di quella censita N, quindi una MVP di 500 corrisponde in realtà a 5000 individui. Basandosi sull'evidenza empirica, Thomas (1990) suggerì che, in generale, come MVP il valore 10 risulta essere troppo piccolo, 100 inadeguato, 1000 adeguato per specie con tipica variabilità demografica, adeguato per uccelli e mammiferi, che tipicamente mostrano fluttuazioni demografiche ben più ampie del normale. Le popolazioni che risultano avere una dimensione insufficiente non sono comunque condannate all'estinzione immediata, ma richiederanno un apposito piano di gestione e un intervento umano più incisivo per avere la sopravvivenza assicurata. 19

20 1.4 Gestione delle specie in pericolo. Quando si parla di gestione genetica in natura delle specie minacciate, uno degli obiettivi primari è quello di invertire il declino della popolazione. Il primo passo in questo senso è innanzitutto quello di identificare e rimuovere le cause del declino con controlli legislativi sui fenomeni di caccia e prelievo, istituzione di riserve protette, riduzione degli inquinanti ambientali e miglioramento generale della qualità dell'habitat, allontanamento di predatori non naturali e di eventuali competitori. Nel caso poi di popolazioni con dimensioni troppo ridotte, potrebbero anche essere adottate tecniche di conservazione ex situ seguite da reintroduzione. Tutto questo diventerebbe però ancora più funzionale se nella popolazione minacciata si riuscisse ad introdurre anche variazione genetica aggiuntiva. Una strategia d'azione efficace potrebbe essere quella di includere nella popolazione individui provenienti da altre popolazioni, allo scopo di aumentare la diversità genetica e migliorare la fitness riproduttiva, come ad esempio è successo per le vipere della Svezia (Madsen et al., 1999). Naturalmente gli individui scelti devono fornire un adeguato approvvigionamento di diversità genetica, pertanto dovranno provenire da esoincrocio (se disponibili) oppure essere comunque differenziati geneticamente dalla popolazione nella quale stanno per essere introdotti. Nel caso non siano disponibili individui appartenenti alla stessa categoria tassonomica, si può ricorrere ad altre sottospecie o comunque ad una specie affine con la quale la specie in esame potrebbe incrociarsi con successo: in tali casi è necessario prima di tutto valutare su base sperimentale se gli ibridi nati dall'incrocio siano fertili e vitali, sia nella prima generazione filiale che in quelle successive. I benefici che possono derivare da un incrocio di questo tipo devono essere molto alti, poiché ci sono seri rischi di depressione da esoincrocio se la tecnica non avesse successo. In ogni caso la depressione da inincrocio verrebbe notevolmente ridotta, e l'azione della selezione sessuale finirebbe per estirpare la maggior parte dell'eventuale depressione da esoincrocio. Qualora la popolazione in pericolo non potesse essere incrociata per mancata disponibilità di sottospecie o specie affini, dovrebbero comunque essere istituiti 20

21 regimi di intervento per: aumentare la dimensione della popolazione; costituire popolazioni in più località al fine di minimizzare il rischio derivante da catastrofi; massimizzare il tasso riproduttivo migliorando l'habitat; istituire allevamenti ex situ di conservazione; isolare la popolazione dai cambiamenti ambientali tramite un regime di quarantena da malattie, agenti parassitari, predatori e competitori. Purtroppo molte specie minacciate possiedono habitat frammentati e sono quindi caratterizzate dalla presenza di numerose sottopopolazioni. In questo caso le opzioni gestionali consistono nel ristabilire il flusso genico attraverso la riallocazione (lo spostamento di individui) e la creazione di nuovi corridoi di migrazione, ovvero strisce di habitat che permettano di mantenere in collegamento le varie sottopopolazioni e facilitare i movimenti degli individui di sottopopolazioni diverse. La riallocazione può però essere un processo costoso e, soprattutto, rischioso, per via di eventuali trasmissioni di malattie o alterazioni comportamentali degli individui riallocati. In alternativa può essere sfruttato il metodo della inseminazione artificiale fecondando individui di una sottopopolazione con gameti prelevati da individui di un'altra. Questo processo rientra nelle cosiddette tecnologie riproduttive assistite, insieme al salvataggio e alla crioconservazione di gameti in banche, alla fertilizzazione in vitro, al trasferimento degli embrioni e al trasferimento del nucleo (clonaggio). Lo scopo è ovviamente quello di incrementare le popolazioni selvatiche con individui prodotti in cattività. Le analisi di sensibilità permettono agli studiosi di valutare diversi programmi di recupero per specie minacciate: a partire da un'analisi di vitalità delle popolazioni (PVA), si fanno piccole variazioni di alcuni parametri al fine di stabilire quale sia quello che influenza maggiormente la vitalità della popolazione. In questo modo, oltre all opportunità di poter effettuare un monitoraggio a lungo termine, possono essere confrontate strategie gestionali alternative per stabilire quale possa essere la 21

22 migliore da seguire in termini di risultati e di fondi necessari. 1.5 Uso dei microsatelliti nella genetica di popolazione. Come anticipato nel paragrafo 1.2, i microsatelliti rappresentano un valido strumento di studio della diversità genetica nelle popolazioni naturali, in quanto loci estremamente variabili: essi sono infatti in grado di evidenziare riduzioni dell'eterozigosità e della diversità allelica. Conosciuti anche come Simple Sequence Repeats (SSRs) o Short Tandem Repeats (STR), sono segmenti di DNA con un motivo di sequenza molto breve (1-6 paia di basi) ripetuto più volte in tandem, e sono molto comuni negli eucarioti (Tautz et al., 1984): ripetizioni di tre o quattro basi sembrano essere più rare, ma comunque sempre presenti in gran quantità (Edwards et al., 1991). Si trovano sia in regioni codificanti del genoma che in regioni non codificanti, sebbene siano più frequenti in queste ultime perché non soggetti a selezione. Sono sequenze estremamente variabili, con tassi di mutazione dell'ordine di 10-4 (Hearne et al., 1992; Edwards et al., 1992). I microsatelliti presentano generalmente alleli multipli, a seconda del numero di ripetizioni della sequenza, ed in particolare le sequenze con dieci o più ripetizioni hanno maggiori probabilità di presentare più alleli (Weissenbach et al., 1992; Weber, 1990). Risultano essere sparsi un po' per tutto il genoma, anche se non omogeneamente. Inoltre le frequenze genomiche dei microsatelliti sembrano variare tra i diversi taxa sia per il numero assoluto di loci presenti che per il numero di ripetizioni (Zane et al., 2002). Le regioni fiancheggianti i microsatelliti sono solitamente molto conservate nei genotipi appartenenti alla stessa specie. Conseguentemente, costruendo su queste regioni dei primer specifici è possibile amplificare mediante PCR frammenti di DNA contenenti STR per poi analizzare i polimorfismi esistenti. Le varianti alleliche riscontrabili potrebbero differire tra loro nella lunghezza della sequenza ripetuta oppure nel numero di ripetizioni della sequenza base. 22

23 Le variazioni del numero di ripetizioni sono dovute allo strange-slippage replication, cioè ad uno scivolamento della polimerasi durante la normale replicazione del DNA che comporta l aggiunta o la delezione di basi ripetute (Schlotterer et al., 1992) oppure possono derivare da eventi di crossing over ineguale tra cromatidi omologhi. Alcuni di questi errori vengono di solito corretti da meccanismi di riparazione cellulare come ad esempio le correzioni delle bozze ed il mismatch-repair (MMR), ma non tutti vengono riparati, e generano quindi variabilità. Grazie alle loro caratteristiche i microsatelliti sono marker ottimali per studi di genetica di popolazione, e grazie alla loro amplificazione tramite PCR si può stimare l'effettivo grado di inincrocio di una popolazione, oltre che il flusso genico in atto. Ma al di là di questo, i microsatelliti offrono basi per numerosi altri tipi di studi, come ad esempio studi di parentela o tassonomia: vengono infatti usati come marcatori specie-specifici codominanti negli studi di genetica e biologia molecolare. Tuttavia i microsatelliti possono anche presentare problemi: uno di questi è l omoplasia, ossia la condizione di uguaglianza nella tipologia e nel numero di ripetizioni tra due alleli che hanno diversa discendenza ma che si presentano identici in stato (e quindi non distinguibili tramite elettroforesi). Questo fenomeno, che è una delle conseguenze dell alta variabilità dei tassi mutazionali dei microsatelliti, induce a sottostimare il reale livello di divergenza di due popolazioni. Un altro problema è rappresentato dall'eventuale presenza di alleli nulli: se nella regione di appaiamento dei primer per l amplificazione del locus esiste una mutazione che impedisce l appaiamento dell oligonucleotide alla sequenza bersaglio da amplificare, l amplificazione non avviene e l allele non viene individuato (il risultato è quindi un allele nullo). Ne risulta una sottostima del reale numero di eterozigoti per quanto riguarda quell'allele. Quando si affronta uno studio in cui s'intende utilizzare i microsatelliti, è sempre bene consultare eventuali studi già fatti sulla specie in esame o su specie simili e utilizzare i microsatelliti già isolati per la specie, in quanto, come già detto, essi sono marcatori specie-specifici. La probabilità che le regioni fiancheggianti siano conservate diminuisce con la distanza filogenetica, pertanto si possono effettuare 23

24 anche test di cross-amplificazione su microsatelliti isolati per specie affini. Se invece per la specie di studio non sono state mai effettuate ricerche simili, allora sarà necessario procedere alla costruzione di librerie genomiche della specie e al successivo disegno di coppie di primer capaci di amplificare i microsatelliti isolati, per poi poter procedere con lo studio. 1.6 Scopo della tesi. Lo scopo del presente studio è stato quello di analizzare la struttura demografica di una popolazione naturale di Testudo hermanni censita e campionata in un area delle colline metallifere (GR) nell estate 2011, e di stimarne, tramite analisi genetiche, il grado di variabilità genetica, il tasso di inincrocio, le eventuali relazioni di parentela e la presenza di ibridi. Testudo hermanni è una specie tutelata dalla IUCN in quanto ritenuta specie a rischio, a causa della degradazione e della frammentazione dell habitat in cui vive e del prelievo incontrollato per scopi commerciali. La popolazione in questione risulta composta sia da individui sicuramente autoctoni che da individui di incerta provenienza immessi in maniera non controllata nell area in un secondo momento, facilmente identificabili grazie ad un sistema di marcatura individuale applicato prima del rilascio. Le analisi genetiche sono state condotte utilizzando sei loci microsatelliti precedentemente testati sulla specie in esame e mi hanno permesso di definire quale reale effetto abbia avuto una tale immissione sulle frequenze alleliche della popolazione naturale. 24

25 2. MATERIALI E METODI 2.1 Specie di studio: Testudo hermanni. Oggetto del presente studio è una popolazione naturale di tartarughe terrestri della specie Testudo hermanni (Gmelin, 1789; Fig. 1), appartenente alla famiglia Testudinidae, superfamiglia Testudinoidea, sottordine Cryptodira, ordine Testudines, classe Reptilia. Fig. 1: un esemplare di Testudo hermanni. Questa specie, come molte altre afferenti al genere Testudo, è inserita nelle liste rosse della IUCN come specie in via di estinzione, e pertanto è protetta dalla Convenzione di Berna (allegato II) e inclusa nella Convenzione di Washington 25

26 CITES (appendice II) e nell'allegato A del regolamento dell'unione Europea 1332/2005: in conseguenza di ciò la detenzione è regolamentata, e la vendita di un esemplare è assolutamente proibita, salvo che si tratti di un soggetto nato in cattività da genitori a loro volta nati in cattività. In quest'ultimo caso è comunque necessario rispettare una serie di specifiche regolamentazioni: l'animale deve infatti essere reso sempre riconoscibile e identificabile tramite l'uso di vari metodi di marcatura quali l'inserimento del microchip (se la tartaruga è lunga almeno 10 cm o ha almeno cinque anni di vita), o il semplice riconoscimento fotografico del piastrone e del carapace. La specie Testudo hermanni è diffusa in tutta la zona Mediterranea, ma si distinguono due sottospecie: Testudo hermanni hermanni popola le zone più occidentali (Spagna, Francia, Italia), mentre Testudo hermanni boettgeri quelle orientali (Grecia, Croazia, Albania) (Bour, 1997). In Italia la sottospecie più diffusa, e sicuramente l'unica autoctona, è quindi T. h. hermanni: le popolazioni italiane rappresentano circa il 5-24% del totale della specie nell'intero areale (Calvario et al., 1997). Il suo areale di distribuzione (Fig. 2) appare frammentato ma concentrato soprattutto lungo tutte le coste tirreniche e parte di quelle adriatiche (Abruzzo, Molise, Puglia), e nelle isole come la Sicilia, la Sardegna e alcune di quelle dell'arcipelago Toscano. È presente infine, ma con una distribuzione più puntiforme e meno consistente, in Spagna (Baleari), in Corsica e nel sud della Francia (Stubbs, 1989). Fig. 2: areale di distribuzione di Testudo hermanni nel Mediterraneo. La frammentazione dell'habitat e la forte riduzione delle popolazioni naturali della forma occidentale sono dovute all'alta frequenza degli incendi boschivi, e 26

27 soprattutto alla diminuzione quantitativa degli habitat idonei a questa sottospecie, per via di attività antropiche di agricoltura, allevamento o sviluppo turistico (Stubbs et al., 1986). Vari studi di filogeografia hanno dimostrato, analizzando RNA mitocondriale, che gli esemplari di T. h. hermanni presenti in Italia sono geneticamente omogenei tra loro, e sembrano discendere da una popolazione sopravvissuta ad un forte collo di bottiglia, probabilmente dovuto ai pesanti cambiamenti climatici avvenuti nel tardo Pleistocene, con rifugio glaciale locato in Sicilia (Van der Kuyl et al., 2002). Inoltre gli esemplari siciliani mostrano notevoli affinità con gli individui presenti in Spagna (Heron, 1968), mentre quelli in Francia sarebbero discendenti da esemplari provenienti da un diverso rifugio glaciale (Bour, 1986). Gli esemplari di T. h. hermanni prediligono ambienti con una forte esposizione solare, pertanto popolano un'ampia varietà di habitat mediterranei aridi e submesofili, soprattutto piane rocciose, radure, aree dunali vicino alla costa, e zone coltivate e adibite al pascolo. Di solito questi habitat hanno una vegetazione densa e fitta di alberi e arbusti: alcuni gruppi sono infatti presenti in boschi misti di querce, carpini, frassini e pioppi. Le aree in cui T. h. hermanni vive sono generalmente caratterizzate da inverni miti, estati calde e asciutte, e precipitazioni scarse. Come tutti i rettili, le T. h. hermanni sono animali ectotermi, con temperature ottimali oscillanti tra 20 C e 27 C, e nelle prime ore della giornata necessitano di stare ferme al sole per innalzare la propria temperatura corporea e attivare le funzioni metaboliche: l'esposizione al sole permette, fra l'altro, anche di assorbire i raggi UVB, utili per la sintesi della vitamina D. Una volta raggiunta la temperatura corporea necessaria per l'attivazione degli enzimi digestivi le tartarughe danno inizio alla ricerca del cibo. Nonostante questo però, con temperature superiori ai 30 C le tartarughe diventano apatiche e scavano piccole buche nei pressi di bassa vegetazione o si riparano in piccoli anfratti, allo scopo di cercare refrigerio. Il loro ciclo annuale prevede che in autunno, col calare delle temperature ambientali, esse smettano di alimentarsi al fine di svuotare del tutto il proprio intestino da eventuali residui di cibo, per poi (verso Novembre o Dicembre, a seconda della latitudine) interrarsi o ripararsi in luoghi protetti in vista del letargo, 27

28 fase metabolica assolutamente necessaria per questa specie che va impedita solo in caso di malattia o debilitazione. La temperatura ideale di letargo è di circa 4 C: temperature inferiori a 2 C arrecano danni cerebrali o morte, mentre invece temperature superiori a 10 C inducono uno stato di dormiveglia pericoloso che comporta l'esaurimento più rapido delle scorte di grasso necessarie a superare tutto l'inverno. In T. h. hermanni le dimensioni del carapace (negli adulti) variano dai 13 (maschi della Puglia) ai 22 cm (femmine della Sardegna); esso presenta un colore di fondo variabile fra il giallo brillante e l'ocra o l'arancione. I disegni scuri sono organizzati in un unico disegno quasi simmetrico che spesso finisce per ricoprire più del 50% della superficie. Il quinto scudo vertebrale presenta un disegno bordato di nero che ricorda la serratura di una chiave. Una caratteristica peculiare delle T. h. hermanni, che le distingue dalle T. h. boettgeri, è la pigmentazione gialla delle scaglie sotto gli occhi. Inoltre, nel piastrone, la sutura pettorale risulta sempre minore di quella femorale. La differenziazione tra maschi e femmine può essere effettuata solo tramite l'osservazione dei caratteri sessuali secondari, poiché l'organo copulatore del maschio viene estroflesso solo al momento dell'accoppiamento (Willemsen et al., 2003). Generalmente i maschi appaiono più piccoli delle femmine, con una coda robusta e lunga e un astuccio corneo ben sviluppato. Hanno una maggiore distanza dell'apertura cloacale dalla base della coda, e presentano una concavità del piastrone evoluta per facilitare la monta sul carapace delle femmine. Al contrario, le femmine presentano una coda piccola e corta, un astuccio corneo ridotto, e un piastrone piatto, come quello degli esemplari giovani e subadulti. Gli scuti anali del piastrone formano nel maschio un angolo maggiore che nella femmina, ma hanno una minore altezza: questo garantisce al maschio una maggiore mobilità della coda durante l'accoppiamento. Lo scuto sopracaudale, infine, nel maschio è curvo verso il basso, come protezione da eventuali aggressioni di altri maschi e come facilitazione del mantenimento della posizione quasi verticale durante 28

29 l'accoppiamento, mentre nella femmina è allineato al carapace (Fig. 3). Fig. 3: caratteri sessuali secondari in T. h. hermanni. Tutte queste caratteristiche sono indice delle diverse necessità che maschio e femmina si trovano a dover affrontare nel loro ruolo riproduttivo. Il periodo riproduttivo è di solito esteso a tutto il periodo di attività, ovvero da Aprile fino alla fine di Settembre, a seconda delle condizioni climatiche, con un calo durante i mesi estivi più caldi. A seguito del letargo, i primi a svegliarsi e attivarsi sono i maschi, che devono cominciare a nutrirsi prima delle femmine per poter avere le energie necessarie ad andare in cerca delle potenziali partner e per potersi accoppiare con queste quando sono appena uscite dai loro ripari invernali e non hanno ancora sufficienti energie per riuscire a respingerli. I maschi ingaggiano spesso fra loro liti territoriali, con combattimenti che prevedono morsi e cozzate del carapace. Durante il corteggiamento il maschio cerca di immobilizzare la femmina mordendola sulla testa e sulle zampe, alternando i morsi a tentativi di monta. La copula avviene con l'estroflessione del pene (contenuto nella coda) per emettere sperma nell'ovidotto della femmina. In questa fase il maschio emette un tipico suono al ritmo dei movimenti del corpo: questo rumore deriverebbe dall'effetto dell'aria bruscamente compressa dai polmoni per via del forte dispendio energetico. È stato ipotizzato che tali vocalizzazioni possano servire alle femmine come criterio di scelta dei maschi migliori (Galeotti et al., 2005). Le femmine depongono le uova tra Maggio e Luglio, e il luogo di deposizione viene scelto valutando la temperatura e il livello di umidità. Vengono solitamente effettuati numerosi tentativi di scavo, prima di trovare il luogo giusto. Le T. h. hermanni depongono in questo modo fino a tre covate, con un numero di uova variabile fra le 2 e le 6 ciascuna. Il sesso dei nascituri dipende strettamente dalla temperatura d'incubazione: se inferiore a 32,5 C saranno preponderanti i maschi, se superiore le femmine. La maturità sessuale viene raggiunta intorno agli 8-10 anni di età, poiché questi sono animali molto longevi. L'anfigonia ritardata è una caratteristica interessante e peculiare della biologia riproduttiva delle tartarughe: le femmine sono capaci di produrre uova fertili per 29

30 molte deposizioni successive (fino a quattro anni) grazie alla presenza di tubuli di immagazzinamento a livello dell ovidotto in cui lo sperma viene conservato e mantenuto vivo (Roques et al., 2004; Johnston et al., 2006) (anche se la vitalità degli spermatozoi sembra calare nel tempo, con conseguente diminuzione progressiva del tasso di fertilità delle uova stesse). 2.2 Area di studio e campionamento. La popolazione in esame è stata campionata fra Aprile e Giugno del 2011 a Bonsecchino, in località Valpiana, Massa Marittima (GR) (Fig. 4). L area di campionamento, di circa 12 ettari, comprende varie zone con diversa copertura vegetale (boschi di leccio/arbusteti/campi aperti), e si trova ad un'altitudine di 214 metri sul livello del mare. Fig. 4: veduta aerea della zona di campionamento, località Valpiana, Massa Marittima (GR). I primi individui ad essere campionati, ad Aprile-Maggio, sono stati i maschi, in quanto, come prima specificato, essi sono i primi ad uscire dal letargo, per poter andare in cerca delle femmine. Fra Maggio e Giugno invece sono state poi campionate le femmine, più facilmente reperibili perché in tale periodo si spostavano per cercare siti di ovodeposizione adatti. 30

31 Durante questi mesi sono stati censiti in totale 62 individui (Tabella 2). Maschi Femmine Immaturi Totale Tabella 2: numero di individui censiti e campionati. Ogni individuo è stato opportunamente misurato e pesato, distinguendo gli individui sicuramente autoctoni da quelli probabilmente immessi (e di incerta provenienza) in base alla presenza di una marcatura lungo il bordo del carapace degli animali (metodo Thornton). Il metodo di marcatura Thornton consiste nel praticare delle incisioni negli scuti marginali del carapace, ognuno dei quali corrisponde convenzionalmente ad un valore numerico (Fig. 5). Questo metodo veniva utilizzato, prima dell avvento dei microchip, per marcare gli esemplari detenuti al centro Carapax (Massa Marittima), chiuso ormai da qualche anno. Si può quindi ipotizzare che gli esemplari già marcati da me rinvenuti provengano dal suddetto centro, per immissione volontaria o perché sfuggiti. Fig. 5: metodo di marcatura Thornton, usato dal Carapax. Prima del rilascio ogni esemplare è stato fotografato e marcato con un numero sul carapace al fine di evitare che lo stesso animale venisse ricatturato (Fig. 6). 31

32 E stato inoltre effettuato da ciascun esemplare il prelievo di tessuto epiteliale per le successive analisi genetiche. I tamponi boccali (buccal swab) sono stati ottenuti passando delicatamente un cotton fioc all'interno della bocca delle tartarughe. Ogni tampone è stato successivamente fatto asciugare e conservato in una provetta eppendorf sterile a -20 C. Fig. 6: esemplare marcato e fotografato. 2.3 Analisi genetiche. La seconda parte dello studio, comprendente le estrazioni del DNA e le amplificazioni dei loci microsatelliti, si è svolta dal mese di Ottobre 2011 al mese di Marzo 2012 presso i laboratori del Dipartimento di Biologia Evoluzionistica Leo Pardi, a Firenze Estrazione del DNA. Il DNA per le analisi è stato estratto dai tamponi boccali utilizzando idrossido di sodio NaOH che, unito alle alte temperature richieste dal protocollo di esecuzione, favorisce la lisi alcalina. In questo modo non solo si rompono le membrane cellulari, ma vengono anche distrutti i labili legami a idrogeno tra le basi nucleotidiche, così che i due filamenti di DNA si separano (denaturazione). Successivamente viene aggiunto TRIS 1M a ph 8, un buffer comunemente usato 32

33 per riportare alla neutralità le soluzioni molto acide o basiche. Durante questa fase si ristabiliscono i legami a idrogeno tra le basi nucleotidiche e si torna ad avere DNA a doppio filamento. Il protocollo di estrazione usato è il seguente: Mettere 500 μl di NaOH 50 mm in una eppendorf da 1.5 m. Inserire il tampone nella eppendorf e vortexare. Lasciare i campioni nel bagnetto termostatato a 97 C per 10 minuti. Rimuovere il tampone premendolo sulle pareti dell'eppendorf. Aggiungere immediatamente 75 μl di Tris 1M (ph 8). I campioni di DNA così ottenuti sono stati conservati a -20 C fino al momento di effettuare le successive analisi (ovvero l'amplificazione dei loci microsatelliti) PCR (Polymerase Chain Reaction). La tecnica della PCR (anche detta reazione a catena della polimerasi ) consente la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscano le sequenze iniziali e terminali (Mullis et al., 1986), allo scopo di ottenerne milioni di copie. Questo permette di effettuare analisi genetiche anche a partire da piccolissime quantità di DNA, o perfino da materiale antico e/o degradato. La reazione di base sfrutta i principi basilari della replicazione del DNA, e consiste nella ripetizione (per un determinato numero di cicli) di tre fasi successive: 1) denaturazione per separare i filamenti di DNA e usare poi i filamenti singoli come stampo; 2) attacco dei primer ai filamenti stampo (annealing); 3) sintesi di nuovi filamenti da parte dell'enzima DNA-polimerasi. A tale scopo sono necessari: DNA stampo (ovvero il DNA bersaglio, da amplificare); un segmento di DNA a doppio filamento che funga da innesco (primer); oligonucleotidi trifosfato (dntps) per costruire i nuovi filamenti copia; ioni Mg 2+ per creare un ambiente adatto allo svolgimento della reazione; 33

34 una DNA-polimerasi termostabile (Taq polimerasi). La Taq polimerasi è la DNA-polimerasi del batterio Thermophilus aquaticus, isolato dall'acqua di un geyser. Essa viene utilizzata per la sua resistenza alle alte temperature, proprietà che la rende in grado di poter essere sottoposta a ripetuti cicli di denaturazione senza perdere la propria attività. Normalmente, in vivo, le DNA-polimerasi possiedono capacità esonucleasiche (una 3'-5' e una 5'-3') che permettono loro di rimuovere eventuali nucleotidi introdotti erroneamente e correggere quindi quegli errori che potrebbero dar luogo a mutazioni puntiformi. In vitro, però, queste capacità vengono perse, con conseguenti maggiori probabilità di errori durante l'amplificazione: ciò non influisce tuttavia sulla significatività delle successive analisi, in quanto la probabilità di incorporare lo stesso errore più volte è molto bassa. Per amplificazioni di frammenti specifici di DNA si usano due primer (forward, F, e reverse, R), che si attaccano rispettivamente a monte e a valle delle regioni fiancheggianti la sequenza che si desidera amplificare. Pertanto devono potersi ibridare in maniera specifica ed efficiente alla sequenza d'interesse, per non amplificare anche regioni aspecifiche. Il Mg 2+ condiziona l'attività polimerasica e l'ibridazione dei primer, e aumenta la temperatura di denaturazione del DNA stampo, quindi la sua presenza si rivela essere di estrema importanza: bisogna prestare attenzione affinché nella miscela di reazione non sussistano eccessive quantità di agenti chelanti (EDTA) o di gruppi carichi negativamente (ad esempio gruppi fosfato), poiché entrambi potrebbero catturare il magnesio presente rendendolo non disponibile. Nella fase di denaturazione del DNA a filamento stampo (prima fase) la miscela contenente il DNA da amplificare viene portata alla temperatura di 94 C; successivamente (fase di annealing) la temperatura viene abbassata fino ad un livello che varia tra i 40 e i 60 C, a seconda del primer utilizzato, poiché per ogni primer esiste una temperatura di ibridazione ottimale; infine (fase di estensione) la temperatura viene rialzata a 72 C per massimizzare l'attività della Taq polimerasi, che determina un allungamento dei primer legatisi ai filamenti stampo utilizzando gli oligonucleotidi per sintetizzare nuovi filamenti. Questi passaggi vengono poi 34

35 ripetuti per un numero di cicli variabile fra i 30 e i 40 al fine di ottenere un'elevatissima quantità di copie della sequenza di DNA d'interesse (ad ogni ciclo il numero di copie della sequenza raddoppia) (Fig. 7). Nel presente studio è stata usata sempre la miscela di reazione riportata in tabella 3: le quantità espresse valgono per ciascun campione di DNA caricato. Fig. 7: schema esplicativo della PCR. DNA da amplificare 2 μl H 2 O 8.8 μl Buffer (10x) 1.5 μl Mg 2+ (50 μm) 0.6 μl dntps (10 μm) 1.2 μl Primer F + R (10 μm) 0.6 μl Taq polimerasi 0.3 μl Tabella 3: miscela di reazione utilizzata per le PCR Microsatelliti utilizzati. 35

36 Per eseguire analisi di parentela su determinate specie e sottospecie di testuggine del genere Testudo era già stato precedentemente definito un set di 11 loci microsatelliti grazie a prove di cross-amplificazione (Cutuli et al., 2012). Di questi 11, nel presente studio, sono stati usati i 6 loci risultati essere più polimorfici per la specie in esame (Tabella 4). PRIMER Sequenza T C N cicli Unità di ripetizione Marcatura Leo 10 Leo 56 Leo 76 Leo 71 Gmu B08 Gmu D51 F-AGACTCTCTGTGATGGTAATAGCA R-GATTTTCATTGGCATATAAGACACA F-GATATGCAGGCAAACAGGCT R-CAGGAATCTGTGCATGATTGA F-GAATTCTAACTTTTCTCTGTGGAGC R-TCTTATTGCATATCTGAGTACAGAAGA F-GATTGTGGTCACATATAGAGGAGG R-TGTTGTACTTAGCTGTTCTGATCTATT F-CTCTGAGACCCTTATTCACGTC R-AGCCTTTGTCTGTAAGCTGTTC F-GTTGGGCACTAGATAGATTCG R-CATTCAAGTCAAGGGAAAGAC 50 C C 40 (AC) 15 (TA) 2 (GA) 2 (CT) 6 GCT (CA) 12 NED FAM 54 C 40 (CA) 8 NED 55 C 40 (AC) 9 FAM 55 C 40 (TAC) 10 HEX 55 C 40 (ATCT) 52 HEX Tabella 4: loci microsatelliti utilizzati nello studio; per ciascuno sono riportate le sequenze del primer, la temperatura di annealing, il numero di cicli effettuati in PCR, l'unità di ripetizione del microsatellite amplificato e la marcatura Sizing (analisi genotipica). A PCR effettuata, i prodotti vengono separati, tramite corsa elettroforetica capillare, in un sequenziatore automatico ABI 310 (Perni Elmer, Applied Biosystems, Foster City, USA). In questo modo si può determinare le dimensioni alleliche relative ai vari loci mediante un processo di sizing, reso possibile grazie all'utilizzo di primer marcati durante la PCR: ad uno dei due primer della coppia forward/reverse era stato infatti legato un fluorocromo (6-FAM, HEX, NED) all'estremità 5'. L'analisi delle dimensioni ottenute viene poi effettuata mediante il software GENOTYPER v. 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, USA): ciò che si 36

37 ottiene è un grafico lineare in cui sono presenti uno o due picchi per locus microsatellite a seconda che l individuo in esame sia rispettivamente omozigote (due alleli uguali che si sommano nel medesimo picco) o eterozigote (due alleli diversi distinti nel processo di sizing) (Fig. 8). La dimensione di questi picchi lungo l'asse X rappresenta la dimensione del frammento, ovvero la lunghezza del frammento espressa in termini di paia di basi: frammenti più grandi si troveranno quindi più distanti dall'origine. L'altezza dei picchi invece, lungo l'asse Y, è indice della quantità di prodotto PCR caricato nel capillare e, di conseguenza, della buona riuscita della PCR. Fig. 8: esempio di un grafico risultante da un processo di sizing. È possibile però che nel grafico risultino più picchi rispetto a quelli attesi corrispondenti agli alleli da individuare, dovuti a possibili errori o riverberi dei campioni separati precedentemente: in tali casi comunque essi hanno altezze minori e un diverso profilo rispetto alle bande d'interesse, ed è comunque possibile distinguerli da quelli effettivi osservando la zona lungo l'asse X in cui per quel tale locus è più probabile trovare il picco giusto (dimensioni attese) Analisi dei dati. I dati di struttura di popolazione sono stati analizzati tramite G-test, comparando età, dimensioni e pesi di individui immessi e nativi, e di maschi e femmine. Per quanto riguarda i dati genetici, per la popolazione di T. h. hermanni in esame 37

38 sono state effettuate tutta una serie di analisi statistiche per calcolare indici di diversità genetica, quali l'eterozigosità osservata (H o ) e attesa (H e ) e le frequenze alleliche. Sono stati inoltre calcolati il tasso di inincrocio e il tasso di frammentazione fra i due gruppi di individui considerati separatamente (tartarughe immesse/native). I test per il linkage disequilibrium e per l'equilibrio di Hardy-Weinberg sono stati effettuati con il programma GENEPOP v. 3.4 (Raimond e Rousset, 2004). Nel caso del test per il linkage disequilibrium è stata applicata la correzione di Bonferroni per test multipli, che ha fissato la significatività del test ad un valore di probabilità P < 0,003. Con lo stesso programma sono stati calcolati anche il livello di differenziazione genica fra i due gruppi di individui e le F-stat, e la loro correlazione basata sulle frequenze alleliche, incluso il coefficiente di inincrocio Fis secondo la formula di Weir e Cockerman (1984), la cui significatività è stata testata tramite catene di Markov, usando 1000 permutazioni e 1000 batch per permutazione. Valori di Fis significativamente maggiori di zero indicano alti livelli di inincrocio all'interno del gruppo, mentre valori negativi indicano bassi livelli di consanguineità. Le frequenze alleliche nei due gruppi di individui e nella popolazione totale sono state calcolate con GENETIX v (2004) (Belkhir et al., 1996); FSTAT v (2002) (Goudet, 1995) ha permesso invece di calcolare l'allelic Richness per ciascun locus in ciascun gruppo e nella popolazione totale. Grazie a CHIFISH (Ryman, 2006) ho calcolato il livello di differenziazione fra i due gruppi sia tramite il metodo Fisher, che tramite il metodo Pearson: il test verifica l'esistenza di differenze nelle frequenze alleliche per ogni locus in ogni popolazione o gruppo di individui. ML-Relate (Kalinowski, 2006), infine, è stato usato per stabilire le probabili relazioni di parentela fra gli individui in esame sulla base dei 6 loci microsatelliti analizzati. 38

39 39

40 3. RISULTATI 3.1 Struttura della popolazione. Sono stati censiti 62 individui. Considerando l intera superficie di studio, è stata calcolata una densità di popolazione di 5,16 esemplari per ettaro. Nelle tabelle seguenti sono riportate le misurazioni effettuate sugli individui censiti per quanto riguarda lunghezza e larghezza del carapace (in centimetri) e peso (in grammi). La tabella 5 raccoglie i dati sugli individui immaturi, dei quali non è stato possibile determinare il sesso; la tabella 6 quelli sulle femmine, e la tabella 7 quelli sui maschi. Per ogni individuo è indicata anche la presenza o l assenza dell eventuale ex-marcatura ancora visibile sul carapace, in base alla quale è stato poi possibile distinguere gli individui appartenenti al gruppo di tartarughe immesse da quelli appartenenti al gruppo delle tartarughe native del luogo. Nell ultima colonna è riportata una stima dell età degli individui, calcolata sulla base del numero di anelli di crescita visibili sugli scuti, secondo il metodo formulato da Stubb et al. (1984) che considera che ogni anello corrisponda ad un anno di età. Alcuni autori criticano questo metodo per il fatto che gli anelli negli adulti sono molto sottili e difficili da distinguere, e sostengono quindi che si possa incorrere in sottostime delle età reali degli animali (Bertolero et al., 2005). Inoltre mentre nelle femmine viene mantenuto un tasso di crescita costante lungo tutta la vita, nei maschi esso sembra diminuire col tempo, e quindi anche questo potrebbe condurre a sottostime della reale età. Tenendo presente le critiche al metodo in esame, nella popolazione del Bonsecchino gli individui campionati presentavano un numero variabile di anelli da 8 e 24, che indicherebbe un età fra gli 8 e i 24 anni (Stubbs et al., 1984). 40

41 GIOVANE Lunghezza (cm) Larghezza (cm) Peso (g) ex marcatura età stimata (anni) A 8,5 7,5 152 no 5 B 8 6,7 136 no 4 C 5,5 4,7 42 no 2 Tabella 5: caratteristiche degli individui immaturi. FEMMINA Lunghezza (cm) Larghezza (cm) Peso (g) ex marcatura età stimata (anni) no sì ,5 784 no sì no ,5 11,5 667 sì sì no sì no , sì , no , sì , no ,5 620 sì ,5 855 sì ,5 11,5 751 sì ,5 791 no ,5 705 sì , sì ,5 819 sì ,5 783 sì sì , sì ,5 11,5 851 sì no ,5 11,5 786 no ,3 197 sì no ,4 717 no , sì no ,5 11,7 960 no ,3 814 no 24 Tabella 6: caratteristiche degli individui di sesso femminile. 41

42 MASCHIO Lunghezza (cm) Larghezza (cm) Peso (g) ex marcatura età stimata (anni) ,5 450 sì ,5 302 sì sì ,5 10,5 459 no ,5 507 sì ,5 403 sì ,5 393 sì ,5 10,5 550 sì , sì , sì ,5 439 sì ,5 396 no ,5 393 no ,5 463 sì ,5 8,5 270 sì no sì ,5 222 no ,5 238 sì ,5 10,5 452 sì ,5 430 no , no ,5 515 no sì ,5 272 no 12 Tabella 7: caratteristiche degli individui di sesso maschile. La sex ratio appare sbilanciata a favore delle femmine (F/M = 1,36). Anche considerando in maniera separata i due gruppi, la sex ratio appare comunque a favore delle femmine, ma molto più marcatamente fra gli individui nativi (F/M = 1,55) che fra quelli immessi (F/M = 1,19), che quindi risultano più omogenei. Tramite un foglio di lavoro EXCEL ho realizzato dei grafici per dare un'idea della struttura della popolazione, dividendo gli individui per classi di età (Fig. 9) e per classi dimensionali e sesso (Fig. 10, 11, 12, 13) e distinguendoli in base al gruppo di appartenenza (tartarughe immesse o native ). 42

43 Fig. 9: abbondanza di individui censiti per classi di età, distinti in individui immessi e individui nativi. Come si può vedere, nella popolazione esaminata risultano decisamente preponderanti gli individui con un'età stimata fra gli 11 e i 15 anni (56,4% del totale). Sono invece marginali gli individui con più di 20 anni (3,2%) o con meno di 5 anni (4,8%): è interessante notare che entrambe le categorie sono rappresentate solo nel gruppo degli individui nativi. La distribuzione delle frequenze delle classi d età degli individui immessi è risultata significativamente diversa da quella degli individui nativi (G = 9,55; df = 4; P < 0,05). L età media stimata per il gruppo di individui immessi è di 12,69 (n = 35, con un errore standard ES di 0,47), mentre quella per gli individui nativi è 13,67 (n = 27; ES 1,02): essi risultano nel complesso leggermente meno giovani. Considerando invece distaccatamente gli individui in base al sesso, essi sembrano essere molto simili: l'età media degli individui maschi è 13,96 (n = 25; ES 0,74), mentre quella delle femmine è 13,32 (n = 34; ES 0,58). 43

44 Fig. 10: abbondanza di femmine censite per classi dimensionali di lunghezza, distinte in immesse e native. Fig. 11: abbondanza di maschi censiti per classi dimensionali di lunghezza, distinti in immessi e nativi. Per quanto riguarda gli individui immessi si delinea una lunghezza lineare media del carapace di 13,47 cm (n = 35; ES 0,3), mentre per gli individui nativi si ha una lunghezza media del carapace di 12,56 cm (n = 27; ES 0,48): essi appaiono in media più piccoli degli individui immessi, ma il G-test non rileva alcuna differenza significativa tra le distribuzioni di frequenza delle classi di lunghezza (G = 2,45; df = 5; P > 0,1). Nessuna differenza si riscontra anche tenendo distinti i maschi dalle femmine (maschi: G = 0,77; df = 2; P > 0,1; femmine: G = 6,089; df = 5; P > 0,1). La lunghezza media delle femmine è di 14,35 cm (n = 34; ES 0,24), quella dei 44

45 maschi di 12,02 cm (n = 25; ES 0,19): le femmine appaino quindi mediamente più grandi, come confermato dal G-test applicato ai dati di distribuzione di frequenza delle classi di lunghezza (G = 42,75; df = 5; P < 0,001). Appare infatti chiaro quanto la classe di lunghezza più rappresentata fra le femmine sia quella tra i 14 cm e i 15 cm, totalmente assente fra i maschi, mentre fra questi ultimi la classe più rappresentata è quella tra i 10 e i 12 cm, quasi assente nelle femmine. Fig. 12: abbondanza di femmine censite per classi dimensionali di peso, distinte in immesse e native. Fig. 13: abbondanza di maschi censiti per classi dimensionali di peso, distinti in immessi e nativi. Infine, per quanto concerne il peso degli individui, gli immessi presentano un 45

46 peso medio di 573,46 g (n = 35; ES 34,45), i nativi di 515,59 g (n = 27; ES 45,02): essendo mediamente più piccoli degli individui immessi, era logico pensare che pesassero meno. Tra immesse e native, applicando il G-test, non si riscontra comunque alcuna sostanziale differenza tra la distribuzione dei pesi degli individui analizzati, anche tenendo conto del sesso di appartenenza (individui totali: G = 0,45; df =4; P > 0,1; femmine: G = 4,082; df = 4; P > 0,1; maschi: G = 0,336; df = 2; P > 0,1). Per quanto riguarda la distinzione fra maschi e femmine nella popolazione totale, queste ultime, con un peso medio di 694,59 g (n = 34; ES 26,41), sono ben più pesanti dei maschi, con un peso medio di 401,84 g (n = 25; ES 17,99). Anche in questo caso le classi rispettivamente più rappresentate sono praticamente assenti fra gli individui del sesso opposto, e il G-test rileva una differenza significativa tra le due distribuzioni (G = 42,67; df = 4; P < 0,001). 3.2 Diversità genetica nella popolazione. Sono stati genotipizzati in tutto 59 individui, per i 6 loci elencati nel paragrafo I loci microsatelliti usati sono risultati essere in linkage disequilibrium, vale a dire indipendenti nel variare l uno dall altro. Tutte le successive analisi sono state quindi effettuate utilizzando l intero set di loci. Nelle tabelle 8, 9 e 10 sono riportati i risultati ottenuti per quanto riguarda le analisi di diversità genetica, divisi per popolazione totale, gruppo di tartarughe immesse, e gruppo di tartarughe native. Per ciascun locus analizzato sono riportati: numero di individui genotipizzati, numero totale di alleli trovati nella popolazione, Allelic Richness, numero di alleli privati, size range degli alleli, eterozigosità osservata (H o ) e attesa (H e ), probabilità di essere all equilibrio di Hardy-Weinberg secondo la formula di Weir e Cockermann (1984). 46

47 P. Totale N Na A Size range Ho He P Leo , ,5593 0,6044 0,7974 GmuB , ,4407 0,4510 0,8718 Leo , ,6250 0,5738 0,8332 Leo , ,1552 0,1444 1,0000 GmuD , ,3729 0,3690 1,0000 Leo , ,5254 0,5037 0,7974 Totale 59 / / / 0,4464 0,4410 0,9998 Tabella 8: analisi di diversità genetica della popolazione totale di tartarughe in esame, locus per locus e per l intero set di microsatelliti. N indica il numero di individui analizzati; Na il numero di alleli riscontrati; A l'allelic Richness; Ho e He le eterozigosità osservate e attese; P la probabilità che la popolazione sia all'equilibrio di Hardy-Weinberg. 47

48 Immesse N Na A Np Size range Ho He P Leo , ,5143 0,6232 0,0815 GmuB , ,4571 0,5106 0,6460 Leo , ,6176 0,5492 0,6203 Leo , ,1471 0,1383 1,0000 GmuD , ,2857 0,2882 1,0000 Leo , ,5714 0,5068 1,5097 Totale 35 / / / / 0,4322 0,4360 0,7700 Tabella 9: analisi di diversità genetica del gruppo di tartarughe immesse nella popolazione in esame, locus per locus e per l intero set di microsatelliti. N indica il numero di individui analizzati; Na il numero di alleli riscontrati; A l'allelic Richness; Np il numero di alleli privati, trovati solo in questo gruppo di individui; Ho e He le eterozigosità osservate e attese; P la probabilità che la popolazione sia all'equilibrio di Hardy-Weinberg. 48

49 Native N Na A Np Size range Ho He P Leo , ,6250 0,5842 0,5254 GmuB , ,4167 0,3573 1,0000 Leo , ,6364 0,6110 0,8924 Leo , ,1667 0,1560 1,0000 GmuD , ,5000 0,4672 1,0000 Leo , ,4583 0,5098 0,6947 Totale 24 / / / / 0,4672 0,4476 0,9989 Tabella 10: analisi di diversità genetica del gruppo di tartarughe native nella popolazione in esame, locus per locus e per l intero set di microsatelliti. N indica il numero di individui analizzati; Na il numero di alleli riscontrati; A l'allelic Richness; Np il numero di alleli privati, trovati solo in questo gruppo di individui; Ho e He le eterozigosità osservate e attese; P la probabilità che la popolazione sia all'equilibrio di Hardy-Weinberg. I coefficienti di inincrocio per ogni locus sono riportati in tabella

50 Immesse Native P. Totale Fis Fis Fis Leo10 0,1769 Leo10-0,0714 Leo10 0,0751 GmuB08 0,1060 GmuB08-0,1705 GmuB08 0,0230 Leo56-0,1268 Leo56-0,0426 Leo56-0,0900 Leo71-0,0645 Leo71-0,0698 Leo71-0,0755 GmuD51 0,0087 GmuD51-0,0718 GmuD51-0,0107 Leo76-0,1296 Leo76 0,1028 Leo76-0,0435 Tabella 11: coefficienti di inincrocio Fis per ciascun locus in ciascun gruppo e nella popolazione totale. immessi Confronto fra il gruppo di animali nativi e Valutando il livello di differenziazione genetica fra i due gruppi di individui, si è trovato che essi non risultano differenziati sul totale dei loci. In tabella 12 ho riportato i valori di Chi 2 e il grado di differenziazione mediato fra i 6 loci in esame, calcolato sia tramite il Fisher's method che tramite il Pearson's method usando il software CHIFISH. Vengono generalmente ritenuti significativi risultati inferiori a 0,05: in conseguenza di ciò, nessuno dei loci ha presentato un grado di differenziazione significativo, con nessuno dei due metodi di calcolo. Metodo Chi2 df P-value Fisher 13, ,31654 Pearson 17, ,24027 Tabella 12: livello di differenziazione genetica fra il gruppo di individui immessi 50

51 e quello dei nativi (mediato fra tutti i loci) calcolato con due metodi diversi. Chi 2 rappresenta l'attendibilità del calcolo, in relazione ai gradi di libertà df; P-value esprime l'effettivo grado di differenziazione. Usando come esempio le frequenze alleliche nei due gruppi di individui per il locus GmuD51, che ha mostrato il livello di differenziazione più vicino ad un valore significativo (P-value = 0,0562), ho realizzato un istogramma per mostrare la variazione delle frequenze alleliche fra i due gruppi (Fig. 14). 0,9000 0,8000 0,7000 0,6000 0,5000 Frequenze 0,4000 0,3000 0,2000 0,1000 Immesse Native 0, Alleli Fig. 14: distribuzione della frequenza allelica per il locus GmuD51 nel gruppo di individui immessi e nativi. 3.3 Relazioni di parentela. Tramite ML-Relate e i dati genotipici ottenuti da GENEPOP, sono state calcolate 51

52 delle stime riguardo ai rapporti di parentela (analisi di relatedness) all'interno della popolazione studiata, sia considerandola nel suo totale, sia considerando i due gruppi separatamente. La percentuale di individui imparentati fornisce una stima del livello reale o potenziale di inincrocio nella popolazione. A tale scopo ML- Relate confronta i genotipi osservati per i 6 loci in esame tra coppie di individui, e attribuisce un valore di probabilità alle possibili parentele, indicando poi la relazione di parentela con la probabilità maggiore come quella più adatta alla coppia considerata. In tabella 13 riporto le percentuali con cui si riscontrano le varie parentele, sia nei due gruppi considerati separatamente, che nella popolazione totale (Fig. 15). Parentele FS HS PO UN Immesse 9,75% 11,09% 11,43% 67,73% Native 10,50% 7,61% 12,32% 69,56% P. Totale 8,65% 11,34% 13,97% 66,00% Tabella 13: relazioni di parentela all'interno dei due gruppi e nella popolazione totale in percentuale. FS indica una relazione di fratellanza (Full Siblings); HS indica due individui presumibilmente cugini fra loro (Half Siblings); PO indica gli individui legati da una relazione genitore-figlio (Parent-Offspring); UN è la percentuale di individui non imparentati (Unrelated). 52

53 Fig. 15: percentuali di relazioni di parentela nella popolazione. 53