Strumenti e Tecniche di studio in patologia

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1 Strumenti e Tecniche di studio in patologia

2 Gli strumenti della patologia: Microscopia Biologia molecolare Indagini biochimiche

3 Microscopia Ottica citopatologia ed istopatologia citochimica ed istochimica immunocito(isto isto)chimica immunofluorescenza Microscopia Elettronica A trasmissione A scansione

4 Campione citologico Persa la geografia spaziale dell organo / tessuto, i criteri diagnostici si basano quasi esclusivamente sulle caratteristiche delle cellule Caratteristiche morfologiche di nucleo e citoplasma forma colore dimensione Pattern di aggregazione cytopath.co.uk

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6 Citologia esfoliativa cellule esfoliate spontaneamente si ritrovano in: Urine Espettorato Secrezioni Versamenti Liquor (liquido cerebrospinale) Citologia per esfoliazione provocata Cellule attivamente asportate dalla superficie cutanea, di una mucosa o di una lesione Citologia per aspirazione con ago sottile

7 Campione istologico Mantenuti siti, orientamento e rapporti delle componenti tessutali prelevate Anche nelle lesioni che si discostano molto dall anatomia dell organo da cui derivano, è mantenuta la geografia spaziale tra epitelio, stroma, vasi

8 Fissazione del campione Quantità di fissativo da utilizzare = rapporto 1:10

9 in caso di campioni di grandi dimensioni 1 Lesioni più rappresentative 2 Consentire un adeguata fissazione a a cuore

10 Attenzione!!!!! + Elevato n di pezzi Scarsa quantità di fissativo Ridotta fissazione

11 Inadeguata fissazione.alterazione della morfologia cellulare preparato istologico illeggibile!!!! Buona fissazione Scarsa fissazione

12 Attenzione!!!!! Tessuti ricchi di sangue (milza, lesioni emorragiche, ecc.) necessaria la sostituzione periodica del fissativo 1) Incompleta fissazione 2) Formazione di pigmenti formalinici

13 Fissazione Scopi: 1) Immobilizzazione dei costituenti cellulari e tissutali 2) Inattivazione enzimi autolisanti 3) Inattivazione batteri 4) Conferimento di stabilità strutturale ai costituenti chimici del protoplasma Fissazione completa dopo 24 ore

14 Requisiti dei fissativi Elevato potere di penetrazione Fissazione uniforme NO coartazione tissutale Preparazione dei pezzi per l inclusione in paraffina Compatibilità con numerose colorazioni istochimiche ed immunoistochimiche

15 FISSAZIONE MEDIANTE. Agenti chimici Agenti fisici - congelamento - composti organici - composti inorganici - calore

16 Fissativi semplici Formaldeide - in commercio al 40% in soluzione acquosa (formalina) - si usa al 10% (90 volumi di acqua, 10 volumi di formalina), neutra e tamponata - assenza di neutralità: produzione di acido formico nella soluzione (riduzione dell effetto di fissazione!!!) Alto grado di penetrazione No eccessivo indurimento dei tessuti No dissoluzione dei lipidi Immersione per lungo tempo Formazione di legami a ponte tra residui di lisina NO modificazione importante della struttura proteica

17 Pericolosità dei fissativi Formaldeide: - Tossica - Infiammabile - Irritante

18 1) Fissazione 2) Disidratazione 3) Chiarificazione 4) Inclusione in paraffina 5) Taglio delle sezioni 6) Colorazione

19 50 % etanolo 70 % etanolo Disidratazione Tessuto fresco Fissazione in formalina 95 % etanolo 100 % etanolo xylolo paraffina

20 Inclusione in paraffina

21 Taglio delle sezioni sezione vetrino

22 Colorazione

23 Identificazione N rif. Istologico Tessuto od organo Specie animale Colorazione

24 Colorazioni cito-istochimiche - forniscono informazioni sul contenuto e sulla natura delle sostanze chimiche contenute nelle cellule (citochimica) o nei tessuti biologici (istochimica) Alcian - sfruttano la proprietà di alcuni reagenti di interagire con specifici composti chimici contenuti in cellule e tessuti formando dei prodotti colorati visibili al microscopi ottico - utilizzabili anche per rilevare la presenza di alcuni tipi di agenti biologici all interno dei tessuti (es. batteri, funghi, protozoi) Ziehl-Neelsen Grocott

25 Tecniche immunologiche Visualizzazione di una reazione antigene-anticorpo anticorpo mediante l utilizzo l di marcatori fluorocromi Complesso enzima + substrato cromogeno IMMUNOFLUORESCENZA IMMUNOISTOCHIMICA

26 PRINCIPIO DI BASE Immunofluorescenza Fluorocromi: fluoresceina, texas red, rodamina, ecc. DIRETTA INDIRETTA

27 Enzima Immunocito citochimicachimica substrato perossidasi 1) DAB (3,3- diaminobenzidina tetraidrocloruro) 2) AEC (3-amino-9- etilcarbazolo) 3) CN (4-cloro-1-naftol) Fosfatasi alcalina Immunoisto istochimica 1) Fast red 2) Fast blue BB Preparati citologici o sezioni istologiche sottoposte a reazioni immunocito(isto)chimiche portano alla formazione di un prodotto colorato che può essere analizzato al microscopio ottico DIRETTA INDIRETTA

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30 Applicazioni dell immunoistochimica: ricerca di base diagnostica routinaria Esempi in campo diagnostico: - individuazione di antigeni di agenti patogeni nei tessuti - discriminazione tra neoplasie di diversa istogenesi - migliorare la caratterizzazione di neoplasie appartenenti ad uno stesso gruppo (es. linfomi) - identificare l origine di una metastasi di cui non si conosce il tumore primitivo (per es. marcatori tessuto specifici) Valutazione di marker prognostici/predittivi nei tessuti neoplastici

31 PCR - Polymerase Chain Reaction (Reazione a Catena della Polimerasi) tecnica in vitro per l amplificazione esponenziale di una sequenza di DNA disposta tra due regioni a sequenza nota l amplificazione richiede la presenza di primers, ossia oligoncleotidi a singola filamento complementari alle estremità della regione a sequenza nota Consente il reperimento di quantità anche minime di materiale genetico (DNA) presente nei campioni inviati RT (reverse transcription) PCR: variante della tecnica PCR che consente di amplificare una molecola di DNA partendo da un insieme di RNA totali estratti da un tipo cellulare

32 ESEMPI DI APPLICAZIONI DELLA PCR 1. Identificazione di agenti patogeni in campioni biologici umani o animali, o negli alimenti (virus e batteri ) 2. Identificazione di organismi geneticamente modificati (OGM) 3. Ricerca di farine di origine animale nei mangimi destinati all'alimentazione del bestiame 4. Analisi del DNA in medicina legale (es. test di paternità) 5. Diagnosi di malattie genetiche

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