DIPARTIMENTO DI PREVENZIONE MEDICO SQ UNI EN ISO 9001: Certificato CSQ 9122 ASLB. LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 1 di 25

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1 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina di 5 INDICE. SCOPO pag.. CAMPO DI APPLICAZIONE pag. 3. DEFINIZIONI pag. 4. RESPONSABILITÀ pag MODALITÀ OPERATIVE pag Validazione primaria pag Validazione secondaria pag. 5. Controllo del metodo e rivalidazione pag ELENCO DOCUMENTI CORRELATI pag. 5 LISTA DI DISTRIBUZIONE Copia n : RS Microbiologia acque e alimenti (dott.ssa D. Mendogni).. Copia n : ISS ORL Funzione e Nome REDATTO RQ LSP Antonia Crippa EMESSO RAQ del DPM Enrico Gotti APPROVATO RLSP Dott.ssa Daniela Mendogni N Rev. Data MOTIVO 0 /07/007 Prima emissione 9/09/008 Revisione completa Firma

2 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina di 5. SCOPO Scopo del presente documento è definire le linee guida per la validazione dei metodi di prova di tipo microbiologico.. CAMPO DI APPLICAZIONE La presente Istruzione si applica ai metodi di prova utilizzati nel Laboratorio di Sanità Pubblica dell ASL della Provincia di Bergamo su matrici alimentari e ambientali. I metodi di prova possono essere definiti come: - metodi normalizzati: sono metodi pubblicati nelle norme internazionali (ISO), nelle norme europee (EN), nelle norme nazionali (UNI) o pubblicati da enti riconosciuti (ISS, Ministero della Sanità, ecc.). I metodi normalizzati, se applicati correttamente, sono da ritenersi validati. - metodi non normalizzati: derivano da modifiche, integrazioni o estensioni di metodi normalizzati oppure sono metodi sviluppati interamente dal laboratorio (metodi interni). I metodi non normalizzati possono essere utilizzati solo se sono appropriati all uso e se sono validati. 3. DEFINIZIONI Per definizioni e abbreviazioni qui non riportate fare riferimento alla Norma ISO 3534 parte e parte Statistica Vocabolario e simboli e al Manuale Qualità del LSP. Se non diversamente specificato le sottostanti definizioni sono riprese dalla norma UNI EN ISO 640:005 Microbiologia di alimenti e mangimi per animali Protocollo per la validazione di metodi alternativi Analita: quantità particolare sottoposta a misurazione (UNI ENV ISO 3843:003). La Norma UNI EN ISO 640:005 lo definisce anche come componente misurato dal metodo di prova. Può essere rappresentato da un microrganismo. In un metodo microbiologico l analita è costituito da uno o più microrganismi presenti in una determinata matrice. Insensibilità: caratteristica di metodo analitico di non essere influenzato da modesti cambiamenti nelle procedure. Microrganismo (m.o.): colonia (che può essere contata) di batteri, lieviti e muffe, prodotta nelle condizioni specificate da un metodo di prova (ISO 4833:004). Microrganismo target (m.o. bersaglio): microrganismo oggetto della prova. UFC, germe, propagulo: entità vivente in grado di produrre crescita in un terreno nutritivo (UNI ENV ISO 3843:003). L entità vivente può essere una cellula vegetativa, un gruppo di cellule, una spora, un grappolo di spore o micelio micotico. Metodo di riferimento: metodo riconosciuto a livello internazionale e ampiamente accettato. Esempi di metodi di riferimento: Norme ISO, standard nazionali ed equivalenti in vigore, ecc.

3 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 3 di 5 Metodo alternativo: metodo di prova che valuta o dimostra, per una determinata categoria di prodotti, che lo stesso analita è riscontrato come se fosse determinato con il corrispondente metodo di riferimento. Metodo di prova qualitativo: metodo di analisi la cui risposta è la presenza o assenza dell analita in una determinata quantità di campione (UNI ENV ISO 3843:003). Identifica una specie o un gruppo di batteri presenti per unità di peso o volume di matrice; il risultato è espresso come: presenza/assenza per gr o ml di prodotto sottoposto a prova. Metodo di prova quantitativo: metodo che quantifica l analita in una certa quantità di campione attraverso misure dirette (conteggio in una determinata massa o in un volume) o indirette (assorbanza del colore, impedenza, ecc.). Il numero di colonie dell analita è espresso come UFC/gr o ml di prodotto sottoposto a prova. Studio comparativo dei metodi: studio del metodo alternativo verso il metodo di riferimento compiuto da laboratorio capofila (organising laboratory) Studio interlaboratorio: studio delle prestazioni di un metodo utilizzando gli stessi campioni eseguito in parecchi laboratori e sotto il controllo del laboratorio che coordina le prove Organising laboratory: laboratorio che possiede lo staff qualificato e le risorse per eseguire lo studio comparativo del metodo e per organizzare lo studio interlaboratorio Se non altrimenti specificato, le definizioni che seguono sono riprese dalla Norma UNI ENV ISO 3843:003 Qualità dell acqua Guida per la validazione di metodi microbiologici. Validazione di un metodo alternativo: dimostrazione, fornita con sicurezza adeguata, che i risultati ottenuti con un metodo alternativo sono confrontabili con quelli ottenuti dal metodo di riferimento (UNI EN ISO 640:005). Validazione primaria o convalida: determinazione delle specifiche per le prestazioni di un nuovo metodo e/o verifica sperimentale che il metodo soddisfi i criteri di qualità derivati per via teorica. Studia le caratteristiche del metodo in fase di messa a punto e sperimentazione. Validazione secondaria o verifica: dimostrazione per via sperimentale che un metodo stabilito funziona in conformità alle sue specifiche presso l utilizzatore. Rivalidazione: Verifica oggettiva del mantenimento delle performances di un metodo di prova. Distribuzione di Poisson: distribuzione completamente casuale del numero di particelle durante il campionamento di una sospensione perfettamente miscelata. È un modello matematico in grado di descrivere la dispersione naturale di valori sperimentali discreti. Sovradispersione: Variazione in eccesso della casualità di Poisson. Fattore di sovradispersione, u: incertezza casuale addizionale della distribuzione di Poisson, misurata in termini di scarto tipo relativo. Incertezza di conteggio: Scarto tipo relativo dei risultati del conteggio ripetuto delle colonie sulla/e stessa/e piastra/e nelle condizioni concordate. Le condizioni concordate possono essere, ad esempio, la stessa persona, oppure operatori diversi dello stesso laboratorio, oppure laboratori diversi. Incertezza di misurazione: parametro associato al risultato di una misurazione che caratterizza la dispersione dei valori che potrebbero ragionevolmente essere attribuiti all oggetto di valutazione. Accuratezza di misura (della determinazione): approssimazione alla concordanza fra il risultato di una prova ed il valore di riferimento accettato. Accuratezza relativa: grado di corrispondenza fra il risultato ottenuto con un metodo di riferimento e quello evidenziato da un metodo alternativo applicato su un campione identico.

4 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 4 di 5 Coefficiente di variazione (CV): scarto tipo relativo per una caratteristica non negativa, definito dal rapporto fra la scarto tipo e la media. Scarto tipo relativo (Deviazione standard relativa, RSD): stima dello scarto tipo di una popolazione ottenuta da un campione con n risultati diviso per il valore medio dello stesso campione. Limite di rilevamento (o di rilevazione): numero di particelle x (per porzione analitica) ove la probabilità p o di un risultato negativo è uguale al 5%. Limite di determinazione: concentrazione media del minor numero di particelle x per porzione analitica dove l incertezza tipo relativa attesa uguaglia un valore specificato. Linearità: dipendenza lineare del segnale rispetto alla concentrazione dell analita. Errore da sovrapposizione/errore da sovraffollamento: sottostima sistematica del conteggio delle colonie dovuto alla confluenza delle stesse. Questo errore dipende soprattutto dallo spazio disponibile per la crescita delle colonie Precisione: approssimazione della concordanza fra risultati di prove indipendenti ottenute in condizioni predeterminate. La precisione non è correlata al valore vero o ad un valore specificato. Di solito è espressa in termini di imprecisione e calcolata come scarto tipo dei risultati delle prove. Proporzionalità: concordanza dei conteggi di particelle osservati nell ambito del volume (o diluizione) di una serie di porzioni analitiche provenienti da una sospensione di origine comune. Ripetibilità: congruenza fra risultati delle misurazioni successive dello stesso misurando effettuate nelle stesse condizioni di misurazione. Per estensione: congruenza fra risultati di due successive determinazioni relative ad un identico campione, condotte nelle stesse condizioni analitiche. Riproducibilità: congruenza fra i risultati delle misurazioni dello stesso misurando effettuate nelle stesse condizioni di misurazione. Per estensione: congruenza fra risultati di determinazioni eseguite su un identico campione condotte in condizioni analitiche diverse. Selettività apparente o presunta (F): rapporto fra il numero di colonie di riferimento e il numero totale di colonie presenti nello stesso volume di campione. Sensibilità: frazione del numero totale delle colture o colonie positive correttamente individuate nel corso di una valutazione presuntiva. Specificità: frazione del numero totale di colture o colonie negative correttamente individuate durante una ispezione presuntiva. Secondo la Norma EN ISO 640 la specificità è la capacità di un metodo di misurare esattamente un dato analita in un campione senza risentire delle interferenze dei componenti non-target (quali ad esempio l effetto matrice). 4. RESPONSABILITÀ La responsabilità dell applicazione dalla presente Istruzione è del RLSP. Il processo di validazione di un metodo di prova microbiologico si svolge sotto la responsabilità del RS della Microbiologia, il quale assume preventivamente tutte le informazioni necessarie e le esplicita in un protocollo di validazione. Al termine della validazione il RS redige il Rapporto di validazione utilizzando il modello MLSP58. Lo stesso modello può essere utilizzato come traccia per il protocollo di validazione.

5 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 5 di 5 Il rapporto di validazione è comprensiva di una relazione esplicativa (Sezione 6 del MLSP58) che, qualora sia necessario, può essere costituita da un documento allegato (MLSP58b). Il giudizio di idoneità del metodo è espresso dal RS al termine della procedura di validazione; il giudizio viene riportato nella Sezione 7 del MLSP58. L approvazione e l autorizzazione all utilizzo del metodo vengono formalizzate dal RLSP con firma del MLSP58, Sezione 8. Le responsabilità nella gestione del processo di validazione di un metodo microbiologico sono riassunte nella tabella sottostante. ATTIVITÀ Scelta campo di applicazione e studio delle caratteristiche dei metodi Scelta del metodo più idoneo Pianificazione della validazione RESPONSABILITÀ RS RS RS VALIDAZIONE PRIMARIA Verifica sperimentale Elaborazione statistica dei dati Valutazione dei dati ottenuti Approvazione del metodo RS TL per l esecuzione delle prove RS RS RLSP VALIDAZIONE SECONDARIA Verifica sperimentale Elaborazione statistica dei dati Valutazione dei dati ottenuti Verifica delle criticità o errori Approvazione del metodo RS TL per l esecuzione delle prove RS RS RS RLSP

6 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 6 di 5 5. MODALITÀ OPERATIVE CARATTERISTICHE DEI METODI MICROBIOLOGICI METODO QUALITATIVO Identifica una specie o un gruppo di batteri presenti per unità peso o volume di una determinata matrice Il risultato è espresso come Presenza o Assenza per grammo o millilitro di prodotto esaminato METODO QUANTITATIVO Identifica una specie o un gruppo di batteri presenti in una matrice e ne determina il numero di cellule vitali per unità peso o volume Il risultato è espresso come UFC per grammo o millilitro di prodotto esaminato La validazione di un metodo di prova microbiologico è tale se: - fornisce la prova documentata che il metodo è adatto per lo scopo e il campo di applicazione, ad esempio, rivelare la presenza /assenza di m.o. (metodo qualitativo) oppure quantificare il numero di colonie di uno specifico m.o. o di gruppi di microrganismi in una determinata matrice (metodo quantitativo); - assicura l affidabilità durante l utilizzo routinario, ovvero dimostra che le caratteristiche del metodo sono tenute sotto controllo e si mantengono entro limiti specificati. I fattori critici più importanti del processo di validazione sono: rappresentatività dell aliquota di prova rispetto al campione da analizzare; tempo trascorso tra campionamento ed esecuzione della prova; temperatura di conservazione fino all inizio delle prove; tempi e temperature di incubazione; prestazioni dei mezzi colturali (selettività, produttività) e delle prove di identificazione e/o di conferma; competenza del personale impiegato nell esecuzione delle prove. È necessario che tutti i fattori siano adeguatamente disciplinati da indicazioni efficaci, al fine di ridurre la possibilità di interferenze sui risultati finali delle prove. I parametri che caratterizzano un metodo microbiologico sono: campo di applicazione, sensibilità, specificità (selettività), robustezza, accuratezza, esattezza, precisione (ripetibilità e riproducibilità), limite di ripetibilità, campo di misura, limite di rivelabilità, limite di determinazione o quantificazione, incertezza. Modalità, tipo e limiti della validazione di un metodo possono variare in funzione dell applicazione, del settore o di quanto specificato in ambito regolamentato sia esso volontario (es. metodi normati) o cogente (metodi ufficiali). Le norme di riferimento per eseguire la validazione sono: Norma UNI ENV ISO 3843:003 Qualità dell acqua Guida per la validazione di metodi microbiologici con particolare riguardo per i metodi quantitativi selettivi in cui la stima quantitativa è basata sul conteggio diretto delle particelle (microscopio) o indiretto (crescita colonie o torbidità)

7 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 7 di 5 Norma UNI EN ISO 640:005 Microbiologia di alimenti e mangimi per animali Protocollo per la validazione di metodi alternativi nel campo delle analisi di alimenti, mangimi per animali, campioni ambientali e veterinari. Validazione primaria o convalida: è un processo esplorativo finalizzato a stabilire i limiti operativi e le caratteristiche prestazionali (performance) di: - un metodo nuovo - un metodo normalizzato non adeguatamente caratterizzato - un metodo normalizzato modificato dal laboratorio (o esteso ad un campo di applicazione non previsto) - un metodo sviluppato dal laboratorio (metodo interno). Nel caso di metodi quantitativi la validazione primaria è generalmente eseguita per confronto con altri metodi normalizzati o per confronto con una precisione teorica predefinita in ragione dello scopo e del campo di applicazione previsto. I risultati della sperimentazione, le eventuali modifiche apportate alla procedura di prova (utilizzo di terreni diversi, modifica tempi e modalità di incubazione, ecc.) e quant altro può influenzare le prestazioni del metodo devono essere descritti e dettagliati nel MLSP58. Validazione secondaria o verifica: ha luogo quando un laboratorio procede ad implementare un metodo sviluppato e validato altrove. La validazione secondaria indaga la capacità del laboratorio di rispettare le specifiche stabilite dalla validazione primaria. La validazione secondaria seleziona ed utilizza, semplificandole, le procedure della validazione primaria, valutandone però le prestazioni a lungo termine (es. predisponendo apposite carte di controllo). Poiché attualmente le specifiche non sono disponibili per tutti i metodi, i risultati del controllo di qualità esterno possono essere utilizzati come prima tappa per procedere alla validazione secondaria. I campioni naturalmente contaminati, ove disponibili, rappresentano un materiale di prova ottimale per valutare se il MDP è correttamente applicato e rispetta i limiti definiti dalla validazione primaria. 5. VALIDAZIONE PRIMARIA 5.. VALIDAZIONE PRIMARIA METODI QUALITATIVI Le prestazioni del metodo possono essere determinate con l utilizzo di una o entrambe le seguenti tecniche: 5... Confronto con un metodo di riferimento le cui prestazioni sono note 5... Campioni a valore noto. Si possono utilizzare campioni contaminati artificialmente in laboratorio con ceppi di riferimento certificati di microrganismi target e microrganismi interferenti, oppure utilizzare i circuiti interlaboratorio assumendo come valore vero il valore assegnato al valore di riferimento dall organizzatore del circuito (risultati CQE) Validazione primaria metodi qualitativi per confronto con un metodo di riferimento

8 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 8 di 5 Ogni campione è analizzato una sola volta sia con il metodo di riferimento che con quello alternativo. Al fine di ridurre al minimo la non omogeneità di contaminazione intra ed inter campione è necessario che il metodo di riferimento abbia in comune con il metodo sotto studio almeno le fasi iniziali del processo di prova (omogeneizzazione, prearricchimento, ecc.). Il processo analitico è diviso immediatamente prima della separazione delle fasi analitiche secondo il seguente schema: Campione Omogeneizzazione Prearricchimento Incubazione METODO ALTERNATIVO METODO DI RIFERIMENTO 5... Validazione primaria metodi qualitativi: fase sperimentale Campioni a valore noto e/o campioni contaminati artificialmente in laboratorio con microrganismi target e/o con microrganismi interferenti sono analizzati con entrambi i metodi. Le matrici esaminate devono essere rappresentative delle matrici rientranti nel campo di applicazione del metodo stesso. Selezionare tra le tipologie di matrici (alimenti, acque, tamponi, ecc.) quello specifico necessario per la validazione del metodo alternativo. Se il metodo alternativo deve essere validato per tutte le categorie di alimenti (carne, vegetali, latticini, ecc.) o acque (potabili, minerali, reflue, superficiali, ecc.), è necessario studiarne cinque tipologie differenti; questo numero può essere ridotto ad una, due, tre o quattro categorie se la validazione del metodo alternativo è limitata solo ad alcune da esse. È preferibile utilizzare un campione naturalmente contaminato dall analita che deve essere individuato dalla prova di validazione; in alternativa contaminare artificialmente i campioni secondo le modalità descritte nella IOLSP8: è necessario che la contaminazione sia a valori medio bassi ( batteri target/gr o ml) o comunque che il livello di contaminazione si avvicini il più possibile a quello di un campione naturale. Nel caso si utilizzino campioni contaminati artificialmente è comunque indispensabile che i campioni mantengano il più possibile la flora batterica caratteristica della matrice esaminata. FASE : Preparazione del campione - La descrizione della preparazione dei campioni è riportata da ogni singolo protocollo di validazione, poiché non è possibile indicare in questo documento tutte le diverse tipologie. Effettuare diluizioni del campione al fine di determinare il livello di riscontro relativo. FASE : Esecuzione della prova - Esaminare 0 aliquote per ciascuna categoria di campione per entrambi i metodi (da validare e di riferimento) e produrre almeno 60 risultati per categoria di campione da ciascun metodo.

9 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 9 di 5 FASE 3.: Elaborazione risultati - I parametri da prendere in considerazione per la validazione primaria di un metodo microbiologico qualitativo sono: sensibilità specificità accuratezza Si riportano di seguito alcune definizioni tratte dalla Norma UNI EN ISO 640 utili per la comprensione delle equazioni e delle tabelle seguenti. Accuratezza relativa (AC): Grado di corrispondenza tra il risultato ottenuto dal metodo di riferimento e il risultato ottenuto dal metodo alternativo su campioni identici. Deviazione positiva (DP): Il metodo alternativo presenta una deviazione positiva se fornisce risultati positivi quando il metodo di riferimento li dà negativi. Se il risultato vero (atteso) è negativo, la deviazione positiva diventa un falso positivo. Se il risultato vero (atteso) è un risultato positivo dimostrato, la deviazione positiva diventa un vero positivo. Deviazione negativa (DN): Il metodo alternativo presenta una deviazione negativa se fornisce risultati negativi quando il metodo di riferimento li dà positivi. Se il risultato vero (atteso) è un risultato positivo dimostrato, la deviazione negativa diventa un falso risultato. Sensibilità relativa per i metodi qualitativi (SE): Capacità del metodo alternativo di rilevare l analita quando lo stesso è rilevato dal metodo di riferimento. Esprime in percentuale la probabilità che un campione vero positivo risulti effettivamente tale utilizzando il metodo in esame. Specificità relativa (SP): Capacità del metodo alternativo di non rilevare l analita quando lo stesso non è rilevato dal metodo di riferimento. Esprime in percentuale la probabilità che un campione vero negativo risulti effettivamente tale utilizzando il metodo in esame. I dati ottenuti, per ciascuna categoria di matrici testate, vengono tabulati come segue: Risultati Risultati positivi con MR (R+) Risultati negativi con MR (R-) Risultati positivi con MA (A+) +/+ Accordo positivo (PA) -/+ Deviazione positiva (DP) Risultati negativi con MA (A-) +/- Deviazione negativa (DN) -/- Accordo negativo (NA) Metodo Rif.V.N. Class. alternativo + + PA - - NA + - DP - + DN Legenda: MA = metodo alternativo MR = metodo di riferimento Accuratezza relativa ( PA NA) + AC % = 00 N

10 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 0 di 5 NA Specificità relativa SP % = 00 N PA Sensibilità relativa SE % = 00 N + Dove: N è il numero totale dei campioni (NA+PA+DP+DN) N - è il numero totale dei risultati negativi con MR (NA+DP) N + è il numero totale dei risultati positivi con MR (PA+DN) FASE 3.: Intervallo di confidenza Per AC, SE, ed SP espressi in percentuale (p) calcolare l intervallo di confidenza (IC): per 0% < p < 90% allora IC (al 95 %) p ± [ (p(-p)/n] dove n = N, N+, N- rispettivamente per p (in %) = AC, SE, SP per p 90% calcolare il più basso limite di confidenza a 95% secondo la tabella E. dell Allegato E della Norma UNI EN 640:005. FASE 3.3: Risultati discordanti Esaminare i risultati discordanti come descritto nell Allegato F della Norma UNI EN 640:005, utilizzando i conteggi DP e DN. FASE 3.4: Tabella riassuntiva dei risultati e interpretazione Matrice PA NA DN DP Somma AC % N+ SE % N- SP % ( PA + NA) PA + N 00 N PA NA + 00 NA N DN 00 + N DP Tipo Tipo Tipo 3 Tipo 4 Tipo 5 Totale

11 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina di 5 Risultati di AC, SE e SP superiori all 80% sono da ritenersi soddisfacenti, salvo diversa indicazione riportata nei singoli protocolli di validazione. FASE 3.5: Livello di riscontro relativo (livello relativo di determinazione) Il livello di riscontro relativo è definito come il più basso numero di microrganismi vitali che possono essere rilevati con il 50% di probabilità sia con il metodo di riferimento che con il metodo alternativo. Per determinare il livello relativo di determinazione procedere nel seguente modo: - utilizzare un campione per ciascuna matrice scelta in funzione della finalità della validazione; - utilizzare, per ogni matrice testata, un microrganismo target scelto in base alle indicazioni dell allegato G della Norma UNI EN ISO 640:003; - effettuare almeno tre livelli (preferibilmente 5) di contaminazione con il m.o. target per ogni tipologia di campione ed un controllo negativo. Se si utilizzano cinque livelli di contaminazione, la prima concentrazione deve essere prossima a quella teorica di possibilità di riscontro, la seconda dovrebbe essere inferiore a quella di riscontro teorico, la terza e le successive dovranno essere superiori alle due precedenti. Nel caso si opti per tre livelli: primo livello: controllo negativo secondo livello: livello di determinazione teorico terzo livello: livello di contaminazione appena superiore al secondo livello. - eseguire la procedura completa sia del metodo alternativo che del metodo di riferimento, inclusa la preparazione iniziale del campione; - replicare ogni combinazione (campione, livello di contaminazione) più di tre volte sia con il metodo alternativo che con quello di riferimento. Eseguire la replica dove i due metodi divergono: se pertanto la prima fase di ciascun metodo è identica (es. stesso brodo di arricchimento), eseguire la duplicazione nella seconda fase; Calcoli e interpretazioni - Per ogni livello L i (i =,, 3, ecc.) ed ogni combinazione (campione, livello di contaminazione) confrontare i risultati ottenuti da entrambi i metodi secondo la tabella sottostante: Risultati per livello Negativi (-) Positivi (+) Totali Metodo di riferimento a n-a n Metodo alternativo b n-b n Totale a+b n-(a+b) n Il Livello relativo di determinazione è espresso come l intervallo tra due livelli consecutivi di contaminazione tra quelli utilizzati, nei quali si hanno rispettivamente in un livello a=b=50% di n e nel successivo a=b <50% di n. ESEMPIO: In una determinata matrice si sono eseguite quattro repliche per ciascuno dei due livelli di contaminazione L ed L (dove L corrisponde alla diluizione 0 - ed L corrisponde ad una matrice non diluita). Al termine delle repliche i risultati tabulati sono i seguenti:

12 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina di 5 Risultati per livello L Negativi (-) Positivi (+) Totali Metodo di riferimento Metodo alternativo Totale Risultati per livello L (non diluito) Negativi (-) Positivi (+) Totali Metodo di riferimento 3 4 Metodo alternativo 3 4 Totale 6 8 Poiché sono soddisfatte entrambe le condizioni, il Livello relativo di determinazione sarà compreso tra le diluizioni 0 - e 0 0 (matrice non diluita). Nel caso l analita da individuare sia un patogeno si richiede la capacità da parte del metodo alternativo di rilevarlo anche alla minima concentrazione ( UFC/matrice). FASE 3.6: Selettività, inclusività ed esclusività Le tre definizioni sottostanti sono riprese dalla Norma UNI EN ISO 640:005. Selettività: misura del grado di non-interferenza in presenza di analiti non-target. È determinata dall analisi sia del microrganismo ricercato che dagli altri che non sono oggetto della ricerca specifica. La selettività rappresenta la quantificazione dell inclusione (rilievo di un determinato analita nell ambito di un ampia selezione di ceppi) e l esclusione (assenza di interferenza nell ambito di un ampia selezione di ceppi non oggetto della ricerca specifica) di un metodo alternativo. Inclusività: capacità di un metodo alternativo di determinare il microrganismo target nel campione in presenza di un ampio gruppo di specie. Esclusività: mancanza di interferenza nel metodo alternativo da parte di un rilevante gruppo di microrganismi non-target. Selezione dei ceppi microbiologici Scegliere un insieme di ceppi diversi. Ciascun ceppo dovrà essere caratterizzato con prove biochimiche e sierologiche in modo da garantirne l identità. Registrare il materiale dal quale i ceppi sono stati originariamente isolati. Microrganismo bersaglio - Selezionare più colture pure appartenenti a famiglie, specie o ceppi di microrganismi bersaglio dalle matrici oggetto di applicazione del metodo alternativo. Ciascuna coltura pura selezionata viene caratterizzata biochimicamente e sierologicamente e, qualora sia stata isolata da un campione, si registra la tipologia di campione dalla quale è stata isolata. Microrganismi diversi dal bersaglio - Selezionare più colture pure da famiglie, specie o ceppi di microrganismi non-target scegliendo fra quelli che notoriamente producono interferenze con il microrganismo bersaglio e che sono presenti naturalmente nelle matrici oggetto della validazione.

13 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 3 di 5 Inoculo - Ciascuna coltura pura così selezionata, sia target che non target, viene utilizzata per contaminare il primo mezzo di crescita (brodo o terreno), privo della matrice campione, impiegato nel metodo alternativo. Si avranno così tanti mezzi di crescita contaminati quante sono le colture pure individuate, ognuno contaminato con un unica coltura pura. Tale contaminazione è effettuata partendo da una diluizione di ciascuna coltura pura. L inoculo nel terreno di crescita è eseguito utilizzando una diluizione od una coltura pura di ciascun ceppo microbico. Le concentrazioni dell inoculo del microrganismo bersaglio devono essere da 0 a 00 volte maggiori della concentrazione minima rilevabile dal metodo alternativo e deve essere utilizzato il protocollo completo dello stesso, inclusa la fase di pre-arricchimento se prevista. Le concentrazioni dell inoculo dei microrganismi non-target devono essere simili a quelle superiori riscontrate in tutte le matrici oggetto di studio (ovvero simili al più alto livello di contaminazione atteso nella categoria dell alimento utilizzato). Esecuzione delle prove - Si sottopone il mezzo di coltura contaminato a tutti i passaggi previsti dai metodi (alternativo e riferimento). Nel caso di risultati falsi negativi o dubbi per i microrganismi target, di falsi positivi o dubbi per i microrganismi non target è necessario ripetere il test applicando anche il metodo di riferimento. I risultati per la selettività del metodo vengono tabulati come seguente: Metodo di riferimento Microrganismo Risultato atteso Risultato ottenuto Colonia target Colonia non-target Metodo alternativo Risultato atteso Risultato ottenuto Interpretazione - Il metodo alternativo è giudicato selettivo per il microrganismo target in esame se i risultati ottenuti coincidono con i risultati attesi Validazione primaria metodi qualitativi: studio inter-laboratorio Lo studio inter-laboratorio è lo studio delle prestazioni di un metodo utilizzando gli stessi campioni, eseguito in parecchi laboratori e sotto il controllo del laboratorio che coordina le prove (UNI EN ISO 640). Tutti i metodi oggetto di validazione primaria devono essere sottoposti a studi interlaboratorio il cui scopo è quello di determinare la variabilità dei risultati ottenuti da differenti laboratori che

14 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 4 di 5 analizzano gli stessi campioni e confrontano i risultati con quelli ottenuti con il metodo di comparazione oggetto dello studio. Per partecipare allo studio in modo appropriato è richiesto che ciascun laboratorio partecipante alle prove sia in grado di dimostrare la propria competenza nell utilizzo del metodo alternativo e di quello di riferimento. Durante lo studio si devono tenere in considerazione tutti i risultati ottenuti, escludendo esclusivamente quelli per i quali sussiste una chiara evidenza di errori grossolani che possono aver dato luogo a risultati errati. Per ciascun laboratorio vanno tabellati le coppie dei risultati ottenuti sia con il metodo di riferimento che con quello alternativo. Calcolare la specificità e la sensibilità dei due metodi secondo quanto descritto al precedente punto 5..., FASE 3.. Per ciascuna concentrazione di contaminazione e per la totalità dei risultati, confrontare il metodo alternativo e quello di riferimento per valutare l accuratezza relativa ed i risultati discordanti. Calcolare inoltre l intervallo di confidenza per ciascuna concentrazione. 5.. VALIDAZIONE PRIMARIA METODI QUANTITATIVI I conteggi delle colonie in un determinato campione sono il segnale di riscontro più comune derivante dai metodi microbiologici quantitativi. Devono pertanto essere registrate tutte le seguenti informazioni: peso del campione, serie di diluizioni, volume di inoculo e conteggio delle colonie di ciascuna diluizione. In microbiologia questi dati discreti sono spesso incompleti: per esempio, per ottenere il risultato finale di un conteggio, si tiene conto solo delle piastre con non più di 300 colonie, moltiplicando per l inverso del fattore di diluizione. Per tale ragione - e per altri fattori che coinvolgono i processi di crescita dei microrganismi - i dati conteggiati sono spesso trasformati nel loro valore logaritmico o in valori di radice quadrata, nell intento di ottenere una distribuzione simmetrica o simile a questa. Preliminare alla pianificazione del processo di validazione dei metodi quantitativi è la necessità di verificare le capacità tecniche degli operatori abilitati ad eseguire le prove microbiologiche. Poiché la valutazione delle capacità tecniche degli operatori deve essere verificata anche per l esecuzione delle analisi di routine, si rimanda alla IOLSP6 Valutazione performances operatore MICRO. La validazione primaria dei metodi quantitativi prevede tre fasi: fase sperimentale (5...) fase di applicazione a campioni naturali (5...) circuito interlaboratorio (5...3) 5... Validazione primaria metodi quantitativi: fase sperimentale

15 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 5 di 5 Il processo sperimentale si basa sulla conduzione delle prove in parallelo su campioni contaminati artificialmente con colture batteriche a titolo noto secondo quanto previsto dalla IOLSP8 Preparazione campioni contaminati artificialmente. Quando ritenuto opportuno, per semplificare questa procedura, si possono utilizzare campioni suddivisi in aliquote e analizzati come campioni diversi (campioni secondari). Per ogni campione si devono eseguire repliche per ogni livello di diluizione ritenuta leggibile. I campioni secondari così ottenuti saranno analizzati secondo i rispettivi metodi di prova Valutazione della sovradispersione Nella distribuzione di Poisson lo scarto tipo è proporzionale al numero delle particelle (colonie) rilevate per unità di peso o volume. L esecuzione di una prova comporta la comparsa di errori casuali (modalità di preparazione del campione, misure di volumi e/o masse, temperature di incubazione, errori di lettura, ecc.). La somma di tutti gli errori determina un ulteriore dispersione dei risultati, detta sovradispersione, che si somma alla dispersione dei dati della distribuzione di Poisson. Un metodo è considerato idoneo all uso quando la sovradispersione determinata dal metodo stesso non modifica statisticamente la dispersione dei dati di una distribuzione teorica di Poisson. Poiché risulta difficoltoso determinare quantitativamente il valore della sovradispersione, l analisi statistica è rivolta alla valutazione dell accettabilità della dispersione sperimentale osservata. Il calcolo della accettabilità della sovradispersione deve essere applicato su entrambi i metodi. Di seguito si riportano tre espressioni utilizzate per verificare il grado di accordo con il modello teorico della dispersione sperimentale dei dati. G n c i C n χ χ = ( c n n n i= n = ( c C) i C i ln c ) ci c i c ( ci ) i ln c i n Numero delle osservazioni Valore delle singole osservazioni Media aritmetica delle osservazioni c i La seconda e la terza equazioni sono approssimazioni della prima. La distribuzione dei dati è considerata accettabile quando:

16 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 6 di 5 ( G n ( g. l. = n ) χ n ) χ con p 0,95 (g.l. = gradi di libertà) Il sistema consente anche di valutare il contributo alla dispersione dei risultati causata: ) dalla dispersione dovuta agli inoculi delle diverse repliche; ) dalla dispersione dovuta alla preparazione delle diluizioni utilizzate negli inoculi. Il modello di analisi proposto richiede che le prove siano condotte con più repliche su più diluizioni scalari. FASE - Analisi della ripetibilità Nella validazione di un metodo quantitativo bisogna prevedere l esecuzione di più repliche dello stesso campione per valutare la dispersione dei conteggi. Possono essere confrontate prove fatte su matrici diverse e in tempi diversi. La verifica è fatta utilizzando la seguente formula: G n = ( c i ln c ) i ( ci ) ln c i n La valutazione dei risultati è fatta utilizzando la relazione successiva: ( G n ( g. l. = n ) χ ) χ con p 0,95 n Criteri di valutazione: a) La dispersione dei dati nelle singole repliche è accettabile quando il G è inferiore al valore del χ con g.l. = ( numero repliche - ). b) La dispersione dei dati osservata tra le singole repliche di prove indipendenti può essere valuta con la sommatoria dei singoli G. n G tot = G i La dispersione dei valori tra prove indipendenti comprendenti lo stesso numero di repliche è accettabile quando Gtot χ con g.l. = (numero di prove ) Nel caso che si verifichino le condizioni a) e b) si può concludere che il metodo è idoneo perché non modifica la naturale dispersione dei dati presente nella distribuzione di Poisson. FASE - Analisi della proporzionalità Nella validazione di un metodo quantitativo bisogna prevedere l esecuzione di più diluizioni scalari dello stesso campione per valutare la dispersione dei conteggi: diluizioni scalari del campione sono esaminate con i metodi in esame. Sono selezionate le piastre con un numero di colonie compreso tra 5 e 300. La linearità di un metodo è valutata utilizzando la seguente formula: i=

17 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 7 di 5 G m m m c i = * ci ln ci ln i= Ri i= m i= m i= c R i Ove: c i è il numero delle colonie rilevate nella piastra R i è la quantità relativa di campione inoculata alla diluizione in esame Un metodo fornisce risultati proporzionali se la seguente espressione risulta soddisfatta: G χ con g.l. = n. diluizioni esaminate - m g. l 5... Validazione di un metodo per confronto dei risultati ottenuti con un metodo di riferimento le cui prestazioni sono note o ritenute accettabili FASE -a - Calcoli con il metodo statistico di Poisson Verificato che i dati ottenuti sperimentalmente con entrambi i metodi sono compatibili con il modello statistico di Poisson, le prestazione dei due metodi vengono verificate utilizzando la seguente espressione: C C A A C B + C B K p n Dove: C A Media dei valori ottenuti con il metodo di riferimento C B Media dei valori ottenuti con il metodo da validare n Numero delle repliche effettuate con ciascun metodo K p,96 per p = 0,95 Nel caso che la relazione sia soddisfatta, i due metodi forniscono risultati sovrapponibili con una probabilità pari a p. FASE -b Calcoli con il metodo della regressione Prima di effettuare qualsiasi tipo di calcolo trasferire su un grafico bidimensionale i valori dei risultati del metodo di riferimento e di quello alternativo di ciascun campione, utilizzando l asse y (verticale) per il metodo alternativo e l asse delle x (orizzontale) per il metodo di riferimento. I punti di ciascuna concentrazione costituiscono un raggruppamento discreto.

18 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 8 di 5 Al fine di rilevare punti fuori quota o una condizione di non linearità, verificare il grafico per la presenza di risultati anomali, che sono rappresentati da quelli che si manifestano in modo evidente al di fuori di ciascun raggruppamento. Se questi sono presenti, ripetere, se possibile, la prova sullo stesso campione e, se non si individua una spiegazione razionale od il risultato si colloca nuovamente al di fuori di un raggruppamento, scartare temporaneamente questo risultato e ripetere i calcoli conseguenti per valutare il suo impatto nei confronti di tutte le valutazioni dei dati complessivi. Se si riscontra l influenza della diluizione valutare questa evenienza con cautela. Se tutti i dati riscontrati appaiono corretti, utilizzare il programma di regressione lineare, che valuta la probabilità che non vi sia perdita di correlazione o di linearità, ed anche, ineguaglianza ponderale della regressione. Quando una regressione lineare semplice fornisce una linea che si adatta ad una retta (y = a + bx) il suo coefficiente di correlazione fornisce le informazioni richieste. Il significato statistico di r, o l inclinazione di b, non sono sinonimi di prova di tipo lineare. Inoltre dovranno essere verificate le due possibilità (a = 0 e b = ). La linearità o la perdita di reciprocità può essere visualizzata anche con la rappresentazione grafica dei risultati eliminati. Gli (y k ) non sono riportati nei confronti dei rispettivi valori (x k ) (K da a N, N = qn), ma sono valutati i valori scartati (y k - Y k ) verso (x k ). Questa rappresentazione fornisce l entità della non-linearità. L accuratezza relativa fra il metodo alternativo e quello di riferimento è valutata con il modello lineare: y = a + bx Non esiste alcuna imprecisione sistematica (ovvero esiste una accuratezza ideale) fra i due metodi se questa equazione è espressa dalla formula y = x, ottenuta in condizione di equivalenza dei due metodi. L intercetta è teoricamente nulla in questo modello teorico. La valutazione dell intercetta fra due metodi è calcolata da p (a = 0). Se il metodo alternativo presenta imprecisione sistematica nei confronti del metodo di riferimento, la probabilità di p(= 0) è allora inferiore ad α = 0.05 (-sided). L inclinazione teorica della linea fra i punti che hanno prodotto una completa equivalenza è uguale a uno. L inclinazione di b, generata dai due metodi, dovrà essere verificata per p(b = ). Se il metodo alternativo non fornisce in modo significativo gli stessi valori di quello di riferimento, la probabilità p(b = ) è allora inferiore ad α = 0.05 (-sided). In questi casi, il metodo alternativo ha un imprecisione rispetto al metodo di riferimento, dipendente dai valori di concentrazione (x o y) ed è massima nelle zone limite. La stima della precisione dei metodi con la linea di correlazione (<Y U/L ) deriva principalmente dalla deviazione standard S y : x. Questa fornisce i limiti entro i quali la specifica accuratezza del risultato consentirà il suo rilievo con una probabilità del 95%, quando t è di circa.

19 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 9 di 5 FASE - Calcolo della sensibilità e della specificità Le caratteristiche delle prestazioni associate alla sensibilità ed alla specificità possono essere determinate in modo numerico. Queste sono riferite al numero delle colonie in funzione di una valutazione (presuntiva) confrontata con un campione di riferimento. Per sensibilità (S) si intende la probabilità (espressa in percentuale) che una colonia attribuita in fase di lettura ad un organismo bersaglio appartenga alla specie ricercata dopo tipizzazione biochimica. S = P *00 P + FN La sensibilità va calcolata per entrambi i metodi. Per specificità (Sp) si intende la probabilità (espressa in percentuale) che una colonia non attribuita ad un organismo bersaglio appartenga invece alla specie ricercata dopo tipizzazione biochimica. Sp = N *00 N + FP La specificità va calcolata per entrambi i metodi. Le due sensibilità e le due specificità vanno successivamente confrontate con il test del chi quadro per verificare se esiste una differenza statisticamente significativa tra loro. A seguito delle verifiche di n prove, i risultati sono suddivisi in quattro categorie. Numero di presunti positivi riscontrati come positivi (veri positivi) Numero di presunti negativi riscontrati come positivi (falsi negativi) Numero di presunti positivi riscontrati come negativi (falsi positivi) Numero di presunti negativi riscontrati come negativi (veri negativi) Queste frequenze possono essere opportunamente riportate in una tabella x Conteggi confermati + - Conteggi presuntivi + - a b c d Totale a + b c + d a + c b + d n Le caratteristiche delle prestazioni calcolate secondo queste osservazioni sono definite nel modo seguente: sensibilità = a/(a + b), frazione del numero totale dei positivi identificati in modo corretto con il conteggio presuntivo;

20 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 0 di 5 specificità =d/(c + d), frazione del numero totale dei negativi identificati in modo corretto con il conteggio presuntivo; quota di falsi positivi = c/(a + c), frazione di positivi assegnati in modo erroneo; quota di falsi negativi = b/(b + d), frazione di negativi assegnati in modo erroneo Il numero totale delle prove è a + b + c + d = n FASE 3 - Efficienza E Parametro singolo a carattere generale che identifica le colonie correttamente rilevate E = (a + d)/n Le colonie dovrebbero essere saggiate in modo casuale fra tutte le colonie (con e senza caratteri specifici, considerate nella loro totalità). In funzione delle consistenti variabili che coinvolgono la parte operativa della componente microbiologica, nessuna delle caratteristiche delle prestazioni sopra specificate può essere considerata una costante metodo-specifica. FASE 4 - Selettività La selettività del metodo microbiologico è definita come valore logaritmico della frazione delle presunte colonie tipiche ricercate (presunte positive) sul totale: F = lg [(a + c)/n]. La selettività presunta di seguito definita è un livello di selezione utilizzato per convenienza. Se sono disponibili delle risorse, il valore reale della selettività, verificato su conteggi di campioni sicuramente positivi, rappresenta l approccio scientifico migliore. Difficoltà di tipo economico possono limitare il suo utilizzo per il confronto definitivo fra metodi diversi. In alcuni tipi di campioni la selettività può risultare così bassa da impedire un conteggio attendibile. Il limite superiore dell intervallo dei risultati è influenzato i modo significativo dalla selettività. La selettività, inoltre, varia in modo considerevole sotto l influenza di fattori stagionali e di altre cause che possono modificare la concentrazione di un determinato microrganismo e della popolazione batterica concomitante. Non si tratta di una costante dipendente dal metodo. Ciononostante la selettività consente di valutare le prestazioni del metodo e può essere di aiuto a scegliere fra diverse alternative. Dovrebbe essere studiato un numero rilevante di campioni. Non disponendo di criteri di scelta, non si dispone di parametri per decidere quale numero specifico sia da considera sufficiente. Si dovranno produrre dati in numero adeguato per decidere quale soluzione adottare. FASE 5 - Limiti inferiori di riscontro e di determinazione Il limite operativo inferiore è una definizione che coinvolge tutti i tipi di metodo. Questo dovrebbe essere espresso come il numero più basso di colonie o particelle rilevabile con un terreno di coltura in piastre parallele.

21 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina di 5 FASE 6 - Limiti superiori Ogni metodo, in particolare ogni singola determinazione, possiede un limite superiore. Non si tratta di un numero chiaramente definito, ma di una zona indefinita nell ambito del numero delle colonie dove i conteggi per piastra divengono eccessivamente incerti se riferiti ad una valida determinazione. Il limite operativo superiore di un terreno di coltura è caratterizzato nel modo seguente: La sovradispersione dei conteggi paralleli può divenire più consistente e più frequente. La condizione può essere valutata con l ausilio dell indice di dispersione di Poisson. I conteggi delle colonie a diluizioni differenti (volumi) non sono concordanti. La proporzionalità (linearità) viene a mancare. La proporzionalità può essere saggiata con metodi che si avvalgono dell indice G. La prova di proporzionalità (linearità) è la più efficace fra queste due. Entrambe le condizioni possono essere valutate utilizzando una singola prova di proporzionalità, specificamente predisposta per questa valutazione o ricorrendo a dati sui precedenti elementi con prove separate Applicazione a campioni naturali Viene eseguita su campioni reali analizzati con entrambi i metodi. In fase di validazione secondaria occorre valutare e confrontare le diverse efficienze di recupero, l accuratezza, la sensibilità e la specificità dei due metodi ottenuti su campioni reali seguendo il protocollo per la validazione primaria riportato nel paragrafo Circuito interlaboratorio I risultati ottenuti con il metodo in esame vengono confrontati con quelli ottenuti dalla partecipazione ad un circuito interlaboratorio qualificato. I risultati ottenuti sono valutati utilizzando l elaborazione fatta dal circuito interlaboratorio e sono adottati i criteri di accettabilità proposti dallo stesso. Nel caso il circuito interlaboratorio renda noto il valore vero della contaminazione del m.o. target e lo scarto tipo ad esso collegato, la seguente equazione, se soddisfatta, consente di verificare se il metodo in sperimentazione fornisce risultati accettabili: M - µ [ (M/ n) + s µ ] K p Dove: M Media dei valori ottenuti con il metodo in sperimentazione µ Valore vero del contaminante s µ Scarto tipo associato al valore vero K p,96 per p = 0,05

22 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina di 5 5. VALIDAZIONE SECONDARIA o VERIFICA La validazione secondaria (o verifica) serve a stabilire che il laboratorio sia in grado di rispettare le specifiche di un metodo stabilite dalla validazione primaria (valutazione della competenza). La verifica va eseguita: - quando un metodo validato altrove viene introdotto per la prima volta in laboratorio, per dimostrare che si è in grado di rispettare le specifiche stabilite dal metodo stesso; - ogni tre anni, per verificare il mantenimento delle performances del metodo (vedi paragrafo 5.3); - quando l andamento dei CQ suggerisca un intervento correttivo (deviazione dei risultati). Attualmente le specifiche utili per il confronto non sono disponibili per la maggior parte dei metodi. I risultati del CQE possono essere utilizzati come prima tappa per procedere verso la validazione secondaria. La prova di validazione deve simulare il più possibile la prova di routine. I campioni naturali costituiscono pertanto il materiale ottimale da sottoporre a prova e la metodologia richiede solo di allocare la procedura all interno dei limiti operativi definiti dalla validazione primaria. Per utilizzare un metodo validato altrove è necessario applicare il protocollo di validazione senza apportarvi nessuna modifica; è inoltre necessario utilizzare il metodo nel campo di applicazione previsto. Prima di procedere con la validazione è necessario verificare la ripetibilità e la riproducibilità dei conteggi degli operatori (vedi IOLSP6). La condizione ideale per procedere alla validazione secondaria di un metodo è che siano eseguite più repliche per inoculo (almeno due repliche della stessa diluizione) e che siano inoculate quantità scalari di campione. a) Per la valutazione della dispersione dei risultati ottenuti su repliche dello stesso campione alla stessa diluizione viene utilizzato il valore di K p. È preferibile scegliere piastre con almeno 5 colonie. C C K p = () ( C + C ) dove: C e C = valori delle conte nelle due repliche Criteri di valutazione del K p K p =,96,0,0 > K p =,576,6 K p >,6 La dispersione dei conteggi è accettabile La dispersione dei conteggi è critica: è necessario approfondire ulteriormente prima di esprimere il risultato. Verificare eventualmente il conteggio della diluizione successiva La dispersione dei risultati è inaccettabile

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