Classificazione dei fenotipi RhD variant

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1 Adelina Ornella Perrone, Ilda Ghiglione, Monica Sasso, Clemente Mazzei Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale-ASL 1, Imperiese (Responsabile: Dott.Clemente Mazzei) It is difficult to discriminate serologically between RhD weak and RhD variant. In this work we used two different available tests for typing partial Rhesus D. Since March 2001 we analysed eighteen samples (coming from women in a fertile age or from transfusing patients) showing doubtful classification of the RhD system. According to the results, it was possible to classify seventeen weak D (fourteen CcD u ee, two CcD u ee, one ccd u ee). A not typing and uncertain classifiable sample with the different serological methods has been analysed with molecular biological methods and has been classified as weak D Type 11, a rare type to transfuse preferably with RhD negative blood. Parole chiave:rhd variant, RhD weak, tipizzazione eritrocitaria Key words: RhD variant, RhD weak, erythrocyte typing Introduzione L'antigene RhD è una proteina di 417 amminoacidi, situata sulla membrana dei globuli rossi 1 (Figura 1). È un mosaico composto da numerosi determinanti antigenici o epitopi, intendendo per "epitopo" una porzione di antigene in grado di reagire con una singola popolazione anticorpale specifica. L'antigene RhD è codificato dal gene RHD, che insieme al gene RHCE (responsabile della produzione degli antigeni CcEe nelle diverse combinazioni alleliche) è situato sul braccio corto del cromosoma 1, regione 34-36, ed è formato da dieci esoni 2 (Figura 2). Circa il 18% della popolazione europea non ha l'antigene RhD, spesso, ma non sempre, a causa della delezione del gene RHD 3,4. Ricevuto: 28 giugno Accettato: 29 luglio 2002 Corrispondenza Dott.ssa Ornella Perrone Via A. Doria San Lorenzo al Mare (IM) Nella popolazione africana i fenotipi RhD-negativi sono anch'essi la conseguenza di fenomeni di delezione a carico del gene RHD, o, meno frequentemente, di mutazioni che lo rendono inattivo. Tali eventi possono essere osservati, per esempio, in presenza dello pseudogene "RHD? " o dell'allele Cde s che determina un ibrido RHD-CE-D 5. Circa l'1% degli Europei possiede alleli RHD con struttura anomala, che codificano per una reattività RhD ridotta, mentre negli Africani la frequenza degli alleli anomali è molto più alta. Di norma, gli alleli anomali codificano per antigeni RhD parziali (detti anche D variant o D mosaic ) ed RhD deboli (oggi indicati come D weak e, un tempo, come D u ). Ricordiamo che i fenotipi RhD parziali sono caratterizzati dalla mancanza di alcuni epitopi mentre gli RhD deboli da una ridotta espressione quantitativa dell'antigene RhD. I portatori di alcuni RhD parziali e di rari RhD deboli si possono immunizzare in seguito a trasfusione con globuli rossi RhDpositivi 6-8 o, se donne, dopo il parto di neonati RhD-positivi. Relativamente alle basi molecolari dei principali antigeni Rh esiste un ampia variabilità 9,10. Tra i parametri da tenere in considerazione per valutare il rischio di immunizzazione post- trasfusionale ricordiamo la densità antigenica e l'indice di similarità Rhesus 11. La densità antigenica esprime il numero di siti antigenici per cellula rilevabili sulla membrana dei globuli rossi con tecniche di citometria a flusso, utilizzando un ampio spettro di antisieri anti-d. Può variare da circa siti/cellula negli RhD normali a meno di 100 antigeni in alcuni RhD weak 12. L'indice di similarità Rhesus misura la differenza qualitativa di ogni campione rispetto a fenotipi RhD normali. Può variare da un valore prossimo a 1 nelle emazie RhD normali ad un valore pari a 0 in quelle RhD parziali, che mancano di uno o più epitopi. Tuttavia, con le correzioni statistiche dovute alla 384 LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol num. 3 maggio-giugno 2002 ( )

2 Figura 1 - L antigene RhD è una proteina formata da 417 aa. I terminali amminico e carbossilico sono inseriti nello scheletro eritrocitario, 12 domini attraversano la membrana eritrocitaria a livello del doppio strato lipidico,regolarmente spaziati e collegati tra loro da occhielli (loops). Sei occhielli sporgono verso lo strato extracellulare della membrana detto glicocalice e sei occhielli sporgono verso l interno (da Wagner et al. 11, modificata) Figura 2 - Rappresentazione schematica del gene RHD che, analogamente al gene RHCE, è formato da 10 esoni variabilità dei saggi analitici, ci si deve aspettare nei campioni RhD normali un valore di indice di similarità Rhesus intorno a 0,845. L'indice di similarità Rhesus è sovrapponibile a quello dei campioni RhD normali nei fenotipi D weak a basso rischio di immunizzazione come nei tipi 1, 2, 3 che sono i più comuni: non risultano, infatti, segnalazioni che soggetti appartenenti a questi tipi abbiano sviluppato anticorpi anti- D in seguito a trasfusione di sangue RhD-positivo. Viceversa, i D weak di tipo 4.2.1, 4.2.2, per i quali è stata descritta o ipotizzata la possibilità di immunizzazione con la trasfusione di sangue RhD-positivo 11, hanno indici di similarità Rhesus al di sotto di 0,4. Durante la tipizzazione sierologica routinaria dei gruppi sanguigni capita di individuare campioni che possiedono una debole reattività RhD, che può essere attribuita alla ridotta espressione quantitativa dell'antigene RhD oppure alla mancanza di qualche epitopo. Se si tratta di donatori di sangue, è imperativo considerarli RhD positivi ed impiegarli di conseguenza anche quando presentano solo una debole reazione con sieri anti-d nel test con antiglobulina, perché possono indurre immunizzazione nei riceventi Rh negativi 13. Viceversa, se si tratta di soggetti da trasfondere o di donne in età fertile, non è facile stimare la probabilità di una loro immunizzazione, e, infatti, sono stati descritti casi di immunizzazione con la produzione di anticorpi anti-d in soggetti RhD variant ed anche in RhD weak 11. È auspicabile che si collabori ad effettuare uno studio accurato relativo alla frequenza nella popolazione dei soggetti RhD deboli e delle varianti qualitative dell'antigene RhD, congiuntamente alla descrizione degli eventi osservati 385

3 AO Perrone et al. Tabella I: patterns di reattività presentati dai campioni con fattore RhD di incerta classificazione Tabella III: patterns di reattività previsti con i campioni classificabili con D-Screen Campioni da approfondire Det. diretta Rh(D) su vetrino, Reazione da ++ a - con sieri anti-d mono e policlonali, lettura dopo due minuti Det. diretta Rh(D) in gel -test, Reazione da ++ a - con sieri anti-d mono e policlonali Ricerca D u in gel-test Reazione da +++ a + Test di Coombs diretto ed indiretto negativi Anti-D DII DIII DIV a DIV b DV a DVI DVII DFR / / Tabella II: patterns di reattività previsti con i campioni classificabili con ID-Partial RhD Typing Anti-D DII DIII DIV a DIV b DV DVI DVII DFR DBT R 0 Har /- di immunizzazione, magari tramite l'istituzione di un Registro. Un aiuto da affiancare allo screening sierologico di routine può essere fornito da alcuni sieri disponibili in commercio che consentono di approfondire la tipizzazione dell'antigene RhD. Materiali e metodi Da marzo 2001 ad oggi, su circa determinazioni di gruppo sanguigno, abbiamo individuato 18 campioni, provenienti da donne in età fertile o da pazienti da trasfondere, che presentavano pattern di reattività riassunti nella tabella I. La determinazione diretta Rh(D) su vetrino, con 4 diversi sieri del commercio (2 policlonali umani, 1 triclonale, 1 monoclonale) presentava una reazione debolmente positiva (1+/2+) o negativa dopo 2 minuti di lettura; la determinazione diretta Rh(D) in gel-test, con 2 diverse schedine monoclonali ed una policlonale, forniva una reazione debolmente positiva (1+/2+) o negativa. La ricerca del D u in gel-test risultava positiva con reattività compresa tra 3+ e 1+. Tutti i campioni esaminati presentavano i test di Coombs diretto ed indiretto negativi. Per giungere ad una più corretta classificazione, abbiamo utilizzato prodotti per la differenziazione degli Rh- D parziali disponibili in commercio e precisamente il Kit "ID-Partial RhD-Typing della Ditta DiaMed italiana Srl, (Vedano al Lambro - MI), e il Kit D-Screen dei Laboratori Diagast- EuraSante (Loos, Cedex - France). Il Kit ID-Partial RhD Typing Set (DiaMed ) è formato da 6 sieri anti-d monoclonali. Esso consente di differenziare le categorie II-IV-V-VI-VII-DFR, DBT, R ohar (Tabella II). Il Kit D-SCREEN (Ditta Diagast) è formato da 9 diversi sieri monospecifici, di classe IgG ed IgM, diretti verso differenti epitopi dell'antigene D. A seconda dei patterns di reattività osservabili, possono essere distinte le varianti: II-III-IVa-IVb-Va-VI-VII- DFR.(Tabella III) Confrontando la reattività del campione in esame con una griglia di valori attesi, si può arrivare a classificare antigeni RhD parziali, o considerarli RhD deboli, oppure prevedere ulteriori accertamenti. Risultati Tra i 18 campioni analizzati, 17 sono risultati positivi con reazioni da 4+ a 3+ con tutti i sieri di ID-Partial RhD- Typing Set. La ricerca con D-Screen era positiva con valori da 4+ a3+ contro sieri di classe IgG, con valori compresi tra 2+ e negativi contro sieri di classe IgM. In base ai risultati ottenuti è stato possibile classificare17 campioni come D weak, precisamente:14 fenotipi CcD u ee, 2 fenotipi CCD u ee, 1 fenotipo ccd u ee. (Tabella IV). Un 386

4 Tabella IV: risultati ottenuti con la classificazione sierologica e l'ausilio dei kit per la tipizzazione dei D parziali 17 campioni reazioni da ++++ a +++ con tutti i sieri ID-Partial RhD - Typing-DiaMed reazioni da ++++ a +++ con sieri IgG D-SCREEN- Diagast reazioni da ++ a - con sieri IgM D-SCREEN- Diagast campioni non appartenenti alle varianti previste dalla tipizzazione D parziale classificati come RhD deboli e precisamente: 14 fenotipi CcD u ee 2 fenotipi CCD u ee 1 fenotipo ccd u ee Tabella V: risultati ottenuti con l'ausilio della biologia molecolare sul campione non classificabile in sierologia 1 campione reazione + con un siero D-SCREEN negativo con ID-Partial analizzato con tecniche di biologia molecolare per la ricerca degli esoni del gene RhD confermata la presenza di tutti gli esoni del gene RhD individuato l allele RhD M2951 classificato come RhD weak di tipo 11 presso il Dipartimento di Medicina Trasfusionale dell Università di Ulm campione, che presentava debole reattività (1 +) con un antisiero D-Screen mentre risultava negativo nella tipizzazione con ID-Partial RhD Typing, è stato inviato, tramite la Ditta DiaMed italiana, dapprima presso il CTS della Croce Rossa di Berna (Svizzera) e successivamente al Dipartimento di Medicina Trasfusionale dell'università di Ulm, in Germania, dove le indagini relative sono state approfondite e completate con studi in biologia molecolare (Tabella V). La ricerca su tale campione degli esoni del gene RHD con tecnica PCR-SSP è risultata positiva dimostrando la presenza di tutti gli esoni. Ricordiamo che il termine SSP sta per Sequence Specific Primer ed è un tipo particolare di tecnica PCR, che non prevede uno step aggiuntivo di digestione o di ibridazione dopo l'amplificazione, bensì l'esecuzione in parallelo di diverse amplificazioni, seguite da rivelazione in elettroforesi su gel di agarosio. Una ulteriore indagine eseguita mediante metodica PCR, ha consentito di individuare nel soggetto la presenza dell'allele RHD M2951, che presenta una sostituzione semiconservativa, causa una densità antigenica molto bassa ed è tipico degli RhD deboli di tipo 11. Pertanto, tale campione veniva classificato come "RhD weak di tipo 11" presso il Dipartimento di Medicina Trasfusionale dell'università di Ulm, in Germania. Si tratta di un D weak descritto in letteratura 11 come tipo raro con circa 183 siti antigenici/cellula e indice di similarità Rhesus pari a 0,53, da trasfondere preferibilmente con sangue RhD negativo. Conclusioni La tipizzazione RhD parziale con antisieri monoclonali di una Ditta nei casi certi, di due Ditte nei casi dubbi, permette una migliore definizione dell'antigene RhD. Quando tutti i sieri monospecifici reagiscono con una buona intensità, si può presumere di avere in esame un antigene RhD debole e stimare un basso rischio di immunizzazione. Nei casi in cui la tipizzazione segnala una variante, o lascia perplessità sull'interpretazione del risultato, si preferisce refertare il fattore Rh come "probabile variante; da trasfondere preferibilmente con sangue RhD negativo", riservandosi di procedere con ulteriori approfondimenti. In conclusione, questo schema operativo ci permette di: - acquisire sempre maggiori informazioni per tipizzare il sistema Rh, - individuare eventuali varianti o RhD deboli di tipo raro, - stabilirne la frequenza nella popolazione, - applicare studi di popolazione, confrontandosi con le tabelle statistiche già elaborate e contribuendo ad elaborarne di nuove, - affrontare con maggior sicurezza la scelta della strategia trasfusionale o di immunoprofilassi più appropriata, caso per caso. Riassunto Dal punto di vista sierologico spesso è difficile discriminare tra RhD weak ed RhD variant,. Nel presente lavoro, abbiamo utilizzato due diverse serie di sieri per la tipizzazione dei fenotipi RhD parziali. Da marzo 2001 ad oggi abbiamo analizzato 18 campioni, provenienti da donne in età fertile o da pazienti da trasfondere, che presentavano incerta classificazione del fattore RhD. In base ai risultati ottenuti è stato possibile classificare 17 weak D e precisamente: 14 fenotipi CcD u ee, 2 fenotipi CCD u ee, 1 fenotipo ccd u ee. Un campione non tipizzabile e di classificazione 387

5 AO Perrone et al. dubbia con le diverse tecniche sierologiche è stato analizzato con tecniche di biologia molecolare ed è stato classificato come D weak di tipo 11, ovvero un tipo raro da trasfondere preferibilmente con sangue RhD-negativo. Bibliografia 1) Avent ND, Ridgwell K, Tanner MJA, Anstee DJ: cdna cloning of a 30 kda erythrocyte membrane protein associated with Rh (Rhesus) blood group-antigen expression. Biochem J 271, 821, ) MacGeoch C, Mitchell CJ, Carritt B et al.: Assignment of the chromosomal locus of the human 30 kda Rh (Rhesus) blood group antigen-related protein (Rh30) to chromosome region 1p36.13-p34. Cytogenet Cell Genet, 59, 261, ) Colin Y, Cherif-Zahar B, Le Van Kim C et al.: Genetic basis of the RhD-positive and RhD-negative blood group polymorphism as determined by Southern analysis. Blood, 78, 2747, ) Wagner FF, Flegel WA: RHD gene deletion occurred in the Rhesus box. Blood, 95, 3662, ) Singleton BK, Green CA, Avent ND et al.: The presence of an RHD pseudogene containing a 37 base pair duplication and a nonsense mutation in Africans with the RhD-negative blood group phenotype. Blood, 95, 12, ) Domen R, Hoeltge G : Alloanti-D antibody formation following transfusion in patients with the weak D (Du) phenotype(abstract). Blood, 90,130b, ) Wagner FF, Gassner C, Muller TH et al.: Molecular basis of weak D phenotypes. Blood, 93, 385, ) Flegel WA, Wagner FF: Rhesus Immunisierungsregister (RIR) [The Rhesus Immunization Surveillance]. Available at: / flegel /RH/RIR/ 9) Cartron JP, Rouillac C, Le Van Kim C et al.: Tentative model for the mapping of D epitopes on the Rh D polypeptide. Trans Clin Biol, 6, 497, ) Reali G, Perrone O: Nuove acquisizioni sul sistema Rh mediate dalla biologia molecolare. La Trasf del Sangue, 45, 60, ) Wagner FF, Frohmajer A, Ladewig B et al.: Weak D alleles express distinct phenotypes. Blood, 95, 2699, ) Jones JW, Lloyd-Evans P, Kumpel BM: Quantitation of the D antigen sites on weak D and D variant red cells by flow cytometry. Vox Sang, 71, 176, ) Flegel WA, Khull SR, Wagner FF: Primary anti-d immunization by weak D type 2 RBCs. Transfusion, 40, 428,

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