Dr. LORENZA DARODA LA RICERCA NEL CAMPO DEGLI OGM

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1 Dr. LORENZA DARODA LA RICERCA NEL CAMPO DEGLI OGM

2 LE SCOPERTE SCIENTIFICHE DEL NOSTRO SECOLO NEL CAMPO DELLA GENETICA E DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE HANNO PERMESSO DI SVILUPPARE TECNOLOGIE IN GRADO DI MODIFICARE IL PATRIMONIO GENETICO DI ORGANISMI COME ANIMALI, PIANTE, BATTERI, VIRUS. ORGANISMI GENETICAMNETE MODIFICATI - OGM

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4 Identificazione di un gene Isolamento del gene Inserimento in un vettore Introduzione in un ospite

5 PRODUZIONE IN ANIMALI TRANSGENICI La maggior parte delle proteine terapeutiche ricombinanti e stata prodotta in fluidi del corpo dei mammiferi come nel latte permettendo una raccolta periodica senza rendere necessario l abbattimento del animale. Per usi commerciali si sta porgendo attenzione su conigli, mucche, maiali, pecore, capre che producono grandi quantità di latte. Altri fluidi come il siero del sangue, urina e fluido seminale sono in via di sperimentazione. UOVA DI POLLO: i polli producono 300 uova l anno ogni uovo contiene 6g di proteine quindi una batteria di 5000 polli potrebbe produrre 150kg di proteina ricombinante / anno.

6 PRODUZIONE IN INSETTI TRANSGENICI PROTEINE RICOMBINANTI POSSONO ESSERE PRODOTTE IN CELLULE D INSETTO MEDIANTE TRASFORMAZIONE STABILE O TRAMITE INFEZIONE MEDIANTE VETTORI RICOMBINANTI DI BACULOVIRUS CHE PERMETTE L ESPRESSIONE TRANSIENTE CON RESA ELEVATA. I VANTAGGI SONO L ABBATTIMENTO DEI COSTI RISPETTO ALLE CELLULE DI MAMMIFERO Appl Microbiol Biotechnol Jul;62(1):1-20. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Ikonomou L, Schneider YJ, Agathos SN. RECENTEMENTE SI SONO SPERIMENTATE LA PRODUZIONE DI COLLAGENE UMANO IN LARVE DI BACO DA SETA. Nature Biotechnology 21, (2003) Human therapeutic proteins from silkworms Florian M. Wurm

7 Centro Ricerche Casaccia - Roma Unità Tecnico Scientifica Biotecnologie, Protezione della Salute e degli Ecosistemi Sezione Genetica e Genomica Vegetale Produzione di piante resistenti a fitopatie virali/fungine Produzione in pianta di molecole per uso biomedico Studi di impatto ambientale di piante geneticamente modificate Genomica e proteomica di specie vegetali di interesse Genotipizzazione della biodiversità di specie vegetali e microbiche di interesse agrario Citogenetica e citometria a Flusso

8 Meccanismo naturale di trasferimento stabile di geni mediata da Agrobacterium tumefaciens DNA genomico cromosoma plasmide Ti Galle del colletto Cellula vegetale trasformata

9 DNA genomico cromosoma plasmide Ti Galle colle Cellula vegetale trasformata

10 Trasformazione mediata da Agrobacterium Trasformazione diretta per elettroporazione o chimica Il DNA esogeno penetra nella cellula privata della parete (protoplasto) Trasformazione diretta tramite cannoncino biolistico percussore proiettile di plastica che spinge le microparticelle ricoperte di DNA DNA esogeno adeso a microparticelle di tungsteno Infezione e trasferimento del DNA esogeno camera da vuoto Formazione di callo in coltura in vitro Cellula vegetale che ha integrato il DNA esogeno nei propri cromosomi Rigenerazione di piantine in vitro Pianta geneticamente trasformata

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12 Tratti agronomici Aumento della produttività Resistenza agli insetti, virus, funghi, nematodi. Resistenza a stress ambientali siccità, salinità. Tolleranza al alluminio (un fattore limitante di crescita nei suoli acidi) Modificazione dei componenti nutrizionali Aumento contenuto vitamine, ferro, proteine, Rimozione di composti allergenici Aumento contenuto amido nelle patate Aumento del contenuto in acido oleico e laurico Aumento del contenuto di antiossidanti (licopene e luteina pomodoro, isoflavoni soia) Biofabbrica di composti per uso biomedico ed industriale Produzione di vaccini, anticorpi, ormoni e composti terapeutici. Produzione di biopolimeri per industria (plastiche, detergenti), fonti di energia (bio-diesel)

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14 Le prime proteine ricombinanti derivanti da piante, venivano prodotte in tabacco ed estratte direttamente dalle foglie raccolte. Una pianta facilmente trasformabile, che si conosceva geneticamente affondo, che permetteva grosse rese in biomassa, ottimale per il molecular farming. Non appartiene alle specie commestibili, e quindi non presenta problemi di contaminazione con la catena alimentare. Molte società biotecnologiche hanno adottato il tabacco per la loro produzione come Mersistem Therapeutics ( Planet biotechnology ( Unico grosso problema del tabacco, la presenza di alcaloidi che devono essere rimossi completamente durante la purificazione del composto.

15 Proteine espresse nei semi dei cereali sono protette degradazione proteolitica possono restare stabili fino a 3 anni a temperatura ambiente, e più anni in frigorifero senza perdere la loro attività. Numerosi cereali riso, grano orzo, mais, sono in sperimentazione per la produzione di farmaceutici. Il mais scelto dalla Prodigene Inc. ( per la sua elevata biomassa, facilità di trasformazione, manipolazione in vitro, le culture facilmente estendibili. Prodigene sta sperimentando l uso del mais per la produzione di: vaccini anticorpi ricombinanti enzimi industriali

16 Per la produzione in larga scala di biofarmaceutici sono stati utilizzati organi di piante edibili, come per esempio i tuberi della patata, il primo importante sistema per la produzione di vaccini. Center for Infectious Diseases and Vaccinology ARIZONA STATE UNIVERSITY Tessuti di patata transgenica esprimente vaccini sono già stati somministrati in pazienti in 3 diversi trial clinici contro vari patogeni umani: Batterio E.Coli enterotossico (tossina B del batterio) Nat Med May;4(5): Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato. Tacket CO, Mason HS, Losonsky G, Clements JD, Levine MM, Arntzen CJ. Virus Norwalk (proteina del capside del virus NVCP) J.INF.DIS 2000, 182: Human Immune Responses to a Novel Norwalk Virus Vaccine Delivered in Transgenic Potatoes Carol O.Tacket, Hugh S.Mason, Genevieve Losonsky, Mary K.Estes,Myron MLevine and Charles J.Arntzen Virus Epatite B (antigene di superficie del virus HBV) Nat Biotechnol Nov;18(11): Production of hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immunization. Richter LJ, Thanavala Y, Arntzen CJ, Mason HS.

17 Tra le altre piante utilizzate come biofabbrica di molecole terapeutiche, soprattutto vaccini edibili, troviamo pomodoro, banane e carote. il pomodoro ha il vantaggio che può essere cresciuto in serra offrendo un contenimento adeguato; la banana ha il vantaggio di poter veicolare nei paesi africani vaccini che altrimenti non avrebbero modo di arrivare ed essere mantenuti in ambienti refrigerati; la carota puo stoccare naturalmente il composto nella radice che è anche la sua parte edibile. Già utilizzata per vaccini contro il Virus del morbillo Vaccine Mar 18;23(17-18): Induction of broadly neutralizing antibodies against measles virus mutants using a polyepitope vaccine strategy. Bouche FB, Steinmetz A, Yanagi Y, Muller CP.

18 Nome Formato Specificità Pianta Proprietà Stato di sperimentazione Avicidin IgG Molecola epiteliale di adesione cellulare (EpCAM) correlata al colon rettale mais NeoRx e Monsanto Trial clinico fase II CaroRx Iga/IgG chimerica secretoria T84.66 IgG ScFv ScFv + interleukin-2 Principale proteina di adesione dello Streptococcus mutants agente della carie Carcinoembryonic antigen (CEA), marcatore di carcinomi epiteliali Anti-HSV IgG1 Glicoproteina B dell herpes simplex (HSV)-2 Anti-RSV IgG Proteina R9 del virus respiratorio sinciziale (RSV) tabacco diverse soia soia St. George s Hospital Medical School, Londra Epicyte Pharmaceuticals Epicyte Pharmaceuticals Trial clinico fase II Trial clinico fase II Trial clinico fase II Trial clinico fase II 38C13 scfv Idiotipo di linfociti B maligni (da cellule di linfoma linea 38C13) PIPP IgG Gonadotropina corionica umana (hcg) Per terapia e diagnosi di tumori che producono h CG, test di gravidanza e contraccezione. piante infettate con virus tabacco Large Scale Biology Trial clinico fase I Trial clinico fase I IN CLINICAL TRIALS

19 Vaccini ricombinanti Tipo di pianta Epatite B Enterotossina E.Coli Rabbia Colera (subunità dellatossina B) Tetano Stafiloccocco aureus tabacco foglie patata tubero lattuga mais semi patata tubero pomodoro tabacco foglie patata tubero tabacco foglie tabacco Twyman RM et al 2005

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21 Misure di contenimento

22 IL CONTENIMENTO Bisogna garantire un CONTENIMENTO a queste piante per ridurre al minimo il rischio di dispersione del transgene sugli organismi non-target e sull ambiente in generale Il contenimento può essere un confinamento di tipo fisico oppure di tipo biologico.

23 IL CONTENIMENTO DI TIPO FISICO LABORATORIO Le Good Laboratory Practices (GLP) sono le pratiche di laboratorio che garantiscono l uso appropriato del materiale biologico all interno dei laboratori e quindi assicurano una corretta gestione. Utilizzo dei reagenti Utilizzo degli strumenti Addestramento del personale

24 Le piante transgeniche, sono numerate e monitorate durante tutte le fasi della loro produzione, dalla trasformazione alla rigenerazione. Le piante dopo la trasformazione vengono cresciute in vitro in appropriate camere di crescita in condizioni estremamente controllate. Durante il loro sviluppo, alcune piante vengono selezionate per delle specifiche caratteristiche, mentre gli scarti vengono invece trattati ed inattivati tramite i metodi tradizionali (autoclavatura, sterilizazione etc) in modo che il materiale biologico non possa sopravvivere fuori dalle strutture del laboratorio.

25 Serra a Contenimento L obiettivo del contenimento è quello di prevenire il trasferimento del DNA ricombinante dagli organismi transgenici che sono collocati all interno della serra alle popolazioni che si trovano all esterno.

26 Vi sono quattro livelli di contenimento, ed è il livello di contenimento adeguato a garantire la sicurezza della classe dell impiego confinato. livello P1: esperimenti con piante transgeniche che non presentano evidenti rischi per l ambiente e che non possono sopravvivere o diffondere nell ambiente. livello P2: esperimenti con piante transgeniche ed organismi associati patogeni o microrganismi esogeni potenzialmente dannosi ma che correttamente gestiti non pongono grossi rischi per gli ecosistemi circostanti. livello P3: esperimenti con piante transgeniche e patogeni che di per sé sono considerati dannosi perché in grado di provocare seri problemi all ambiente circostante. livello P4: esperimenti con piante transgeniche e patogeni che sono in grado di trasmettere malattie molto dannose alle coltivazioni dell ambiente circostante, eseguiti in presenza dei vettori di trasmissione di questi patogeni.

27 Il CONTENIMENTO DI TIPO BIOLOGICO Ridurre al minimo il rischio di dispersione del transgene e di limitare l impatto delle proteine ricombinanti sugli organismi non-target e sull ambiente in generale. Sviluppo di metodologie che prevedono l isolamento riproduttivo, spaziale e temporale, controllo della fioritura e della fertilità della piante transgeniche : Barriere per l ibridazione Inibizione della fioritura Apomissia Maschio sterilità Cleistogamia Eliminazione manuale dell infiorescenza Tempi di fioritura sfalsati Semi sterili

28 Sviluppo di metodologie che prevedono la localizzazione dell espressione della proteina d interesse unicamente in specifici compartimenti cellulari, tessuti o organi : Induzione controllata Cloroplasto Organi di riserva Radici Il nostro interesse : Produrre molecole terapeutiche attraverso la RIZOSECREZIONE in ambiente controllato (culture idroponiche). Alte rese di espressione proteica, misure di contenimento fisico e biologico.

29 Drake PM, Chargelegue DM, Vine ND, van Dolleweerd CJ, Obregon P, MaJK. Rhizosecretion of a monoclonal antibody protein complex from transgenic tobacco roots. Plant Mol Biol May;52(1): Rizosecrezione Gaume A, Komarnytsky S, Borisjuk N, Raskin I. Rhizosecretion of recombinant proteins from plant hairy roots. Plant Cell Rep Aug;21(12): Epub 2003 Jun 18. Menkhaus TJ, Bai Y, Zhang C, Nikolov ZL, Glatz CE. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnol Prog Jul-Aug;20(4): Drake PM, Chargelegue D, Vine ND, Van Dolleweerd CJ, Obregon P, Ma Jk Transgenic plants expressing antibodies: a model for phytoremediation. FASEB J Dec;16(14): Borisjuk NV, Borisjuk LG, Logendra S, Petersen F, Gleba Y, Raskin I. Production of recombinant proteins in plant root exudates. Nat Biotechnol May;17(5): Komarnytsky S, Gaume A, Garvey A, Borisjuk N, Raskin I. A quick and efficient system for antibiotic-free expression of heterologous genes in tobacco roots. Plant Cell Rep May;22(10): Epub 2004 Feb 10. Medina-Bolivar F, Cramer C. Production of recombinant proteins by hairy roots cultured in plastic sleeve bioreactors. Methods Mol Biol. 2004;267: Christey MC, Braun RH. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenesmediated transformation. Methods Mol Biol. 2005;286: Finer JJ. Plant protein secretion on tap. Nat Biotechnol May;17(5):427. No abstract available. Gleba D, Borisjuk NV, Borisjuk LG, Kneer R, Poulev A, Skarzhinskaya M, Dushenkov S, Logendra S, Gleba YY, Raskin Use of plant roots for phytoremediation and molecular farming. Proc Natl Acad Sci U S A May 25;96(11): Review.

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32 Strumenti internazionali di regolamentazione Protocollo di Cartagena

33 Organizzazioni internazionali di sostegno ai paesi in via di sviluppo FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS United Nations Environment Programme UNITED NATIONS INDUSTRIAL DEVELOPMENT ORGANIZATION The International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology

34 AUTORITA COMPETENTI U.S. Coordinated Framework Department of Agriculture USDA Food and Drug Administration FDA Environmental Protection Agency EPA Europa European Food Safety Authority EFSA Joint Research Center JRC Italia Commissione Interministeriale di Valutazione CIV

35 OGM immessi in commercio conformemente alla direttiva 2001/18/CE Decisione 2005/772/CE - granturco 1507 Decisione 2005/635/CE - colza GT73 Decisione 2005/608/CE - granturco MON 863 Decisione 2005/465/CE - colza GT73 Decisione 2004/643/CE - granturco NK /18/CE

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38 LABORATORI Le nuove frontiere della genetica e della biologia molecolare. Tecnologie in uso per la manipolazione genetica. Biotecnologie per la cura delle malattie dell uomo Il limone geneticamente modificato può dare dei vantaggi all agricoltura in Sicilia?