A) procedura analitica per l identificazione ed il conteggio delle fibre con tecnica di Microscopia Elettronica a Scansione (SEM),
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- Berta Biagi
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1 LIFE Project Number LIFE03 ENV/IT/323 - FALL TECHNICAL REPORT No. 3 Analytical Method Determination Of Asbestos Fibers In Landfill Leachate Sezione 1 ver. 1 Analisi in microscopia ottica/elettronica di membrane ottenute da filtrazione di percolato: identificazione e conteggio delle fibre di amianto) Written by Luca Zamengo* e Sergio Malinconico** Edited and approved by Stefano Polizzi* e Federica Paglietti** *Università Ca Foscari (Project Manager) **ISPESL Nota al documento Questo documento è da intendersi come una trattazione parziale della metodica analitica da sviluppare per la determinazione delle fibre di amianto in liquidi non-standard come il percolato da discarica. La stesura definitiva del protocollo prevede test ed analisi in laboratorio con tecniche incrociate che continueranno, come prestabilito, fino al novembre 2004 e nel caso di rallentamenti imprevisti, per tutto il tempo necessario al raggiungimento dell obiettivo. In particolare lo sviluppo del protocollo prevede l utilizzo della Microscopia Ottica in Contrasto di Fase (MOCF), della Microscopia Elettronica a Scansione (SEM) e in Trasmissione (TEM); Inoltre, qualora necessario, saranno effettuati successivi test analitici tramite l utilizzo della Diffrazione a Raggi-X (DRX) e la Spettroscopia FT-IR, l esito dei quali sarà riportato nel protocollo definitivo. Si è ritenuto indispensabile, quindi, suddividere la stesura del protocollo in sezioni, delle quali quella sotto riportata è la prima, che progressivamente saranno redatte, aggiornate e riportate alla Commissione evidenziando gli avanzamenti e le correzioni apportate durante lo sviluppo della metodica definitiva. In questa sezione saranno esposte rispettivamente: A) procedura analitica per l identificazione ed il conteggio delle fibre con tecnica di Microscopia Elettronica a Scansione (SEM), B) metodica preparativa dei campioni da sottoporre ad analisi in Microscopia Elettronica in Trasmissione (TEM) C) procedura analitica da impiegare per analisi in microscopia ottica in contrasto di fase (MOCF) secondo normativa nazionale D.M. 6/9/94 e DLgs. n 277 del 15/8/1991 e normativa europea DIR CEE 83/477
2 INDICE 1. Definizioni 1.1. Scopo e applicazione del metodo 1.2. Riassunto del metodo 2. Procedure e preparative 2.1. Sensibilità analitica e filtrazione 2.2. Analisi SEM Filtrazione Coating Osservazione Conteggio Filtri bianchi 2.3. Analisi TEM Creazione della replica Dissoluzione della membrana Estrazione della replica 2.4. Analisi MOCF Preparazione del campione (vetrini) campi microscopici da esaminare Criteri di conteggio DIR CEE 83/ Filtri bianchi Calcolo della concentrazione Conteggio Limite di rilevabilità
3 1. DEFINIZIONI Aggregato di fibre: insieme di fibre orientate casualmente. Amianto: termine commerciale applicato ad un gruppo di silicati idrati che tendono a separarsi in sottili fibre, flessibili e resistenti a trazione e al calore, chimicamente inerti. Anfiboli: gruppo di silicati ferro-magnesiaci di struttura cristallina con caratteristica sfaldatura secondo due facce prismatiche e di formula generale: A2,3B5(Si, Al)8O22(OH)2 dove A=Mg, Fe2+, Ca, Na o K e B =Mg, Fe2+, Fe3+, o Al. Alcuni di questi elementi possono essere sostitutiti da Mn, Cr, Li, Ti, Pb, o Zn. Gli anfiboli sono caratterizzati da struttura a tetraedri a catena doppia con rapporto Si:O pari a 4:11. Campo: porzione di superficie osservata ad un certo ingrandimento tramite tecniche di microscopia Crisotilo: minerale fibroso del gruppo dei serpentini: Mg3Si2O5(OH)4. Costituisce il più diffuso ed importante tipo di amianto per uso industriale e commerciale. d-spacing: la separazione tra piani atomici cristallografici identici paralleli ed adiacenti. EDS: Energy Dispersive Spectrum. Misura delle energie e delle intensità di raggi X caratteristici mediante un rivelatore a stato solido ed un analizzatore multicanale. Fascio di fibre: fibra composta da più fibre parallele con diametro inferiore unite longitudinalmente. Fibra standard: particella con lunghezza superiore a 5 µm e diametro inferiore a 3 µm e con rapporto dimensionale lunghezza/diametro 3:1, Fibrilla: una singola fibra, di dimensioni inferiori a quelle standard, che non può essere separata in componenti più piccole senza perdere l apparenza e le proprietà fibrose. MFL: milioni di fibre per litro. Rapporto dimensionale: il rapporto lunghezza /diametro di una fibra. Replica: procedura nella preparazione del campione TEM con la quale si produce una sostanziale copia sottile (replica) di una superficie. SAED: Selected Area Electron Diffraction - tecnica in microscopia elettronica con la quale si studia la configurazione cristallina di una piccola area di campione. Sensibilità analitica: concentrazione calcolata in MFL equivalente al conteggio di una fibra.
4 1.1. Scopo e applicazione del metodo Il metodo ivi proposto è stato elaborato al fine di quantificare, tramite tecniche di microscopia ottica/elettronica, il contenuto di fibre di amianto presenti in percolati di discarica ed in generale in liquidi non-standard che presentano un alto contenuto di materiale organico. Il metodo sviluppato permette di valutare la concentrazione numerica delle fibre di amianto standard e quelle di dimensioni inferiori, la loro identificazione minerale e di evidenziare e quantificare ulteriori fibre non amiantifere. Le dimensioni minime delle fibre di amianto riconoscibili variano in funzione sia della metodologia analitica adottata e della relativa sensibilità analitica sia della quantità di materiale interferente organico ed inorganico presente nel campione Riassunto del metodo I campioni di percolato grezzo vengono sottoposti inizialmente ad un processo di pre-trattamento di digestione acida sotto irraggiamento di microonde al fine di diminuire l interferenza proveniente dalle sostanze organiche presenti (vedi TR2). Il liquido risultante, previa omogeneizzazione, viene filtrato su membrane di policarbonato o esteri misti di cellulosa con porosità rispettivamente di 0.45 e 0.8? m a seconda della metodologie microscopiche prescelte. Le membrane vengono trattate con specifiche procedure e sottoposte ad analisi per quantificare e classificare mineralogicamente le fibre di amianto. 2. PROCEDURE E PREPARATIVE Le tre tecniche analitiche prevedono le seguenti fasi primarie in comune: a) Campionamento b) Conservazione c) Pre-trattamento Le metodiche di Campionamento e Conservazione sono descritte nel TR1. La metodica di Pre-trattamento del campione di percolato grezzo è descritta nel TR2. Successivamente, in funzione della tecnica utilizzata, si adotteranno diverse procedure per la: d) Filtrazione e) Preparazione f) Osservazione g) Conteggio Note alle procedure 1)L amianto, in particolare il Crisotilo, è presente in piccole quantità in quasi tutti i più comuni prodotti da laboratorio. Molti edifici e strutture contengono amianto o altri materiali fibrosi che possono interferire con le analisi. E di primaria importanza che tutte le fasi di preparazione siano eseguite in un ambiente dove la contaminazione del campione sia minimizzata. L area destinata alla preparativa dei campioni deve essere separata da fonti potenzialmente contaminanti come pavimentazioni, soffitti, coibentazioni e materiali di varia natura contenenti amianto. Sarà necessario inoltre predisporre set di filtri bianchi da sottoporre alle stesse procedure di quelli adoperati per la filtrazioni del percolato. Su tali bianchi saranno effettuate letture in microscopia che forniranno il valore del fondo ambientale.
5 2)Si è scelto di analizzare sia alla MOCF che al SEM per ogni campione, un mm 2 di superficie delle membrane sopra menzionate, prendendo come riferimento il valore indicato nel D.M. italiano 6/9/1994 per l analisi al SEM di filtri provenienti dal campionamento di particolato aerodisperso in quanto unico riferimento disponibile Sensibilità analitica e filtrazione La preparazione delle membrane da osservare tramite tecniche di microscopia è un punto critico delle procedure. L obiettivo è quello di produrre un filtro sul quale sia distribuito uniformemente il particolato presente nel liquido minimizzando la sovrapposizione di particelle. Il volume che deve essere filtrato dipende dal diametro del sistema filtrante utilizzato, dal contenuto dei solidi sospesi del liquido in esame ed in alcuni casi dalla concentrazione di fibre nel liquido. Dalla pratica si deduce che il parametro limitante è usualmente il contenuto di solidi sospesi prevalentemente di natura organica. La tabella 1 mostra le limitazioni della sensibilità analitica in funzione del volume di liquido filtrato applicabili durante osservazioni di superfici pari 1mm². In generale è stato osservato, nel corso di numerosi tests di prova, che anche la più pallida colorazione assunta dalla superficie del filtro è indice di eccessivo deposito. Non è possibile assicurare che la filtrazione di volumi inferiori a 50 ml per filtri da 47 mm o 10 ml per filtri da 25 mm porti all uniforme deposizione di particolato sulla superficie; si è pertanto stabilito di usare volumi superiori a questi o di procedere con diluizioni con acqua distillata. Tab.1 Limitazioni della sensibilità analitica in funzione del volume di liquido filtrato. Volume filtrato (ml) su filtri da 47 mm** di diametro Sensibilità analitica* (ff/litro) Volume filtrato (ml) Sensibilità su filtri da 25 mm** analitica* (ff/litro) di diametro ml , , , , , , , , , , , ,00 *Concentrazione corrispondente all osservazione di una fibra su un area di 1 mm². ** Assumendo che l area effettiva di filtrazione con l apparecchiatura impiegata sia 199 mm² per filtri da 25mm di diametro e 1134 mm² per filtri da 47 mm di diametro (l area effettiva di filtrazione è il risultato della diferenza tra l area totale dei filtri e l area di una corona circolare esterna di larghezza di circa 4,5 mm occupata dall apparecchiatura stessa) Analisi SEM L analisi in Microscopia Elettronica a Scansione (SEM) permette il riconoscimento morfologico delle fibre di amianto e la loro classificazione mineralogica mediante l elaborazione di Spettri a Dispersione di Energia EDS. Il SEM consente inoltre di definire con grande precisione le dimensioni delle fibre stesse, classificandole come standard qualora abbiano lunghezza > 5? m e larghezza < 3? m o come micronizzate qualora abbiano dimensioni inferiore. In quest ultimo caso non è garantito l esito dell analisi EDS in quanto il diametro minimo del raggio incidente può superare il
6 diametro della fibra che si sta cercando di classificare e conseguentemente l analisi mineralogica resta dubbia. La procedura messa a punto è di seguito riportata: Filtrazione Filtrare per deposizione, su membrana in policarbonato da 0.45 µm, il volume scelto di percolato pre-trattato come in TR2. Risciacquare tutti i contenitori e i materiali utilizzati con acqua distillata e filtrare sulla stessa membrana anche l acqua di lavaggio. Rimuovere accuratamente la membrana e riporla su di un vetrino portaoggetti. Posizionarla, numerandola in essiccatore per un tempo di 3 ore. Rimuovere la membrana dall essiccatore, ritagliarne una porzione (ca. 1cm²) e fissarla su portacampioni SEM. Per lo sviluppo del seguente protocollo si è utilizzato:?? Sistema filtrante multiuso Nalgene a membrane sostituibili (volume utile 150 ml)?? Membrane Millipore in policarbonato (diametro 47mm, porosità 0.45 µm) Coating Depositare uno strato sottile, compreso generalmente tra 0.5 e 30 nm, di materiale conduttivo (ad es. oro o grafite) tramite sputtering sulla superficie utile della membrana per evitare fenomeni di caricamento durante l osservazione SEM. Per lo sviluppo del seguente protocollo si è utilizzato:?? Sputter Coater SC7620 Polaron?? Target: Au?? Gas ionizzato: Argon?? Pressione: 6x10-2 mbar?? Voltaggio applicato: 1kV?? Corrente: 15 ma?? Tempo di sputtering: 15 sec Osservazione Eseguire l osservazione di un numero campi a 2000X corrispondenti a 1 mm² di area superficiale. Per lo sviluppo del seguente protocollo si è utilizzato:?? Microscopio elettronico JEOL JSM 5600LV con microanalisi EDS?? Software interfaccia Link ISIS?? Osservazioni condotte a 20KV?? N di campi osservati: 330?? Area di un campo: 63.7 x 47.5? m² = 3025 x10-12 m²?? Area totale osservata: 1 mm² Conteggio Per il calcolo della concentrazione delle fibre, C, si è utilizzata la formula: C = ( n? d 2 ) / (4 NAV) [fibre/ m 3 ]. Dove:?? n è il numero di fibre conteggiate sulla porzione del filtro esaminata
7 ?? N è il numero dei campi osservati per ricoprire l area di 1 mm² a 2000 ingrandimenti?? d è il diametro effettivo della membrana in metri?? A è l area di un campo a 2000x, in m²?? V è il volume di liquido filtrato, in m³ Filtri bianchi Al fine di verificare la non contaminazione dei filtri bianchi, si effettuerà la letture degli stessi, uno ogni 25 filtri usati. Il numero di fibre ivi riscontrate, in un numero di campi pari a quello esaminato per i campioni di percolato, non potrà essere superiore a 3; in caso contrario occorrerà scartare l'intero set di filtri al fine di non inficiare la corretta valutazione del numero di fibre effettivamente presenti sul filtro. I filtri bianchi dovranno essere esposti all aria, in laboratorio, nel luogo ove si esegue il filtraggio, per un intero turno lavorativo (8 ore). Note: 1)Le fibre di amianto sulle membrane, durante l analisi in microscopia elettronica, possono presentarsi sotto vari aspetti: a) fibre singole; b) fibre divise; c) fibre raggruppate; d) fibre con altre particelle. Le fibre sono conteggiate a seconda di come si presentano: Nelle figure a), b), c) e d) è riportato, nell angolo in basso a destra di ogni quadrante, il valore di conteggio da attribuire all immagine esemplificativa proposta. La stima della lunghezza delle fibre viene riferita alla curvatura della fib ra stessa (cioè alla lunghezza reale) e secondo i dettami generali di conteggio vengono considerate le fibre quando soddisfano le dimensioni geometriche date per definizione (L > 5?m, D < 3?m e rapporto L/D > 3,) DLgs 277/91; 2)Al fine di una più completa ed esauriente valutazione delle analisi è opportuno considerare anche le fibre che:?? presentano un diametro <1µm e non si rende possibile il riconoscimento tramite analisi EDS nel qual caso verranno catalogate come fibre sospette?? presentano una lunghezza inferiore a 5 µm ma mantengono il rapporto dimensionale 3:1. nel qual caso verranno catalogate come fibrille e fibrille sospette. Fig. a)rappresentazione esemplificativa di fibre singole
8 Fig.b)Rappresentazione esemplificativa di fibre divise Fig. c) Rappresentazione esemplificativa di fibre raggruppate
9 Fig. d)rappresentazione esemplificativa di fibre con altre particelle 2.3 Analisi TEM Sono stati condotti test al fine di ottimizzare la metodica di preparazione dei campioni TEM (esposta nel documento EPA 600/ ) impiegando la tecnica della Replica Estrattiva. In particolare il procedimento adottato è il seguente:?? creazione della replica?? dissoluzione della membrana?? estrazione della replica Creazione della replica Dopo la fase di filtrazione ed essiccazione, ritagliare le membrane di policarbonato con porosità di 0,45?m in porzioni di dimensioni (15x3) mm prelevate dalla zona diametrale del filtro. Fissare le membrane cautamente ad un vetrino, numerarle e porle nella camera di deposizione di un Carbon Vacuum Evaporator per il ricoprimento con uno strato sottile di carbone e la creazione della replica. Portare il vuoto nella camera di evaporazione ad un livello di circa 10-4 Torr (0.013 Pa).
10 Evaporare il carbone con intermittenza per evitare un surriscaldamento della membrana. Depositare uno strato sottile di circa 30 o 50 nm sulle striscioline di membrana Dissoluzione della membrana Dopo il ricoprimento al carbonio, lasciare galleggiare le porzioni di membrana direttamente in un bagno di cloroformio per alcune ore. Utilizzare una capsula-petri profonda almeno 2 cm e riempirlo per ¾ con cloroformio. Sistemare con cura la membrana sulla superficie del liquido, evitando di sostare a lungo tra i vapori di cloroformio che tenderanno ad arricciarne la superficie. Dopo alcune ore (in genere 3 ore) il policarbonato della membrana sarà dissolto dal cloroformio Sullo strato di carbonio rimarranno saldati gli oggetti prima presenti sulla membrana Estrazione della replica Il contenuto della replica galleggiante è raccolto inserendo dal basso una grid TEM con idonea pinzetta, e sollevando una porzione della replica. In genere da una replica di 15x3 mm si possono ricavare 2 o 3 grid con sufficiente margine. Le repliche al carbonio sono depositate su grid di rame (300 mesh) di 3mm di diametro Nota: Questo metodo permette una rapida dissoluzione della membrana e un alta purezza della replica raccolta: i campioni così preparati possono essere osservati al microscopio elettronico in trasmissione senza subire l interferenza di sostanze esterne (evitate nella procedura) che possono lasciare tracce sulla grid. 2.4 Analisi MOCF (Procedura per campionamento e analisi in accordo con quanto previsto dal D.M. 6/9/94 e dal D.l. n 277 del 15/8/1991) Preparazione del campione (vetrini) Una parte del filtro, posta su un vetrino da microscopio, è reso trasparente mediante il metodo acetone-triacetina e coperto con vetrino coprioggetti. La procedura è descritta nel metodo indicato dalla Dir. CEE 83/477; (vapori di acetone e triacetina). Per diminuire il tempo necessario alla completa diafanizzazione, dopo la applicazione della triacetina (normalmente di ca. 24 ore), si può scaldare il preparato (vetrino più coprioggetto) per 15 minuti a circa 50 C su una piastra riscaldante Campi microscopici da esaminare Per ciò che concerne l analisi in MOCF, tenuto conto che un campo microscopico corrisponde all'area reticolo di Walton-Beckett (a 500 x è mm 2 ), verranno esaminati 130 campi per ciascun campione corrispondenti ad una superficie di 1 mm2 della membrana filtrante
11 prendendo come riferimento il valore indicato nel D.M. italiano 6/9/1994 per l analisi al SEM di filtri provenienti dal campionamento di particolato aerodisperso Criteri di conteggio (Dir. CEE 83/477). Con la MOCF si effettuerà una prima analisi quantitativa dei filtri in esteri misti di cellulosa al fine di conteggiare tutte le fibre standard presenti nel campione ed una analisi semiqualitativa, ove possibile, delle fibre che presentano caratteristiche ottiche peculiari. Il conteggio dei campioni verrà effettuato secondo le seguenti regole: Per fibra standard si intende qualunque particella, di lunghezza > 5µm, diametro < 3µm e rapporto lunghezza/diametro >3, che non sia in contatto con una o più particelle di diametro maggiore di 3 µm. Le singole fibre che hanno entrambe le estremità entro l'area del reticolo devono essere contate come un'unica fibra; una fibra avente una sola estremità all'interno di tale area deve essere contata come mezza fibra. Le aree del reticolo per il conteggio devono essere scelte a caso all'interno della superficie del filtro e non devono mai sovrapporsi. A tal fine si consiglia di seguire un percorso a greca. Un agglomerato di fibre che appaia compatto e intero in uno o più punti della sua lunghezza, ma appaia diviso in trefoli (fibra ramificata) in altri, deve essere contato come una unica fibra purchè avente le dimensioni standard; in tale eventualità il diametro deve essere misurato in corrispondenza della porzione di fibra intera e non ramificata. In qualsiasi altro agglomerato in cui le singole fibre si tocchino o si incrocino (fascio), queste devono essere contate individualmente ogniqualvolta possano essere distinte sufficientemente per stabilire che abbiano dimensioni standard. Se non è possibile distinguere nessuna singola fibra rispondente a tale definizione, il fascio deve essere contato come un'unica fibra, sempre che sia conforme nel suo complesso a tali dimensioni. Se più di un ottavo di un area del reticolo è coperto da un agglomerato di fibre e/o particelle, tale area del reticolo deve essere scartata ed un'altra area deve essere esaminata per il conteggio Filtri bianchi Al fine di verificare la non contaminazione dei filtri bianchi, si effettuerà la letture degli stessi, uno ogni 25 filtri usati. Il numero di fibre ivi riscontrate, in un numero di campi pari a quello esaminato per i campioni di percolato, non potrà essere superiore a 3; in caso contrario occorrerà scartare l'intero set di filtri al fine di non inficiare la corretta valutazione del numero di fibre effettivamente presenti sul filtro. I filtri bianchi dovranno essere esposti all aria, in laboratorio, nel luogo ove si esegue il filtraggio, per un intero turno lavorativo (8 ore) Calcolo della concentrazione dove: N = n. di fibre contate in totale;
12 n = n. di campi del reticolo esaminati su un filtro (200 o meno in funzione del volume totale prelevato); D = in mm, diametro effettivo del filtro (verrà considerata la superficie della porzione utilizzata nell analisi, prelevata da un filtro di 47 mm di diametro); d = in micron, è il diametro del reticolo di Walton Beckett (100 micrometri); V = in litri, il volume di acqua filtrato Conteggio Per il conteggio è usato un microscopio binoculare con le seguenti caratteristiche: Illuminazione Koehler. Condensatore ABBE o acromatico a contrasto di fase incorporato nel complesso posto sotto al piatto portaoggetti e montato con possibilità di centraggio e messa a fuoco. Aggiustamento del centraggio per il contrasto di fase indipendente dal meccanismo di centraggio del condensatore. Obiettivo acromatico a contrasto di fase positivo parafocale, a 40 ingrandimenti, con apertura numerica compresa tra 0,65 e 0,70 e con assorbimento dell'anello di fase compreso tra 65 e 85%. Oculari a compensazione a 12,5 ingrandimenti: almeno un oculare deve permettere l'inserimento di un reticolo ed avere la messa a fuoco. Reticolo oculare circolare Walton-Beckett con diametro apparente sul piano oggetto di 100 µm ± 2 µm quando si usano l'obiettivo e l'oculare indicati, e controllato mediante un micrometro Limite di rilevabilità Controllare il limite di rilevabilità mediante un "vetrino di prova per contrasto di fase". Quando siano usati nel modo specificato dal fabbricante si deve poter vedere fino al codice 5 sui vetrini di prova AIA e sino al blocco 5 sul vetrino di prova HSE/NPL Mark 2. Tale procedura deve essere effettuata all'inizio della giornata di lavoro.
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