INDAGINE SULL ORIGINE DELLA TROTA FARIO DI FENOTIPO MEDITERRANEO (CEPPO FRANCESE ) IN PIEMONTE

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1 INDAGINE SULL ORIGINE DELLA TROTA FARIO DI FENOTIPO MEDITERRANEO (CEPPO FRANCESE ) IN PIEMONTE Progetto di ricerca a cura di Alvise. N. Lucarda e Gilberto Forneris, Dipartimento di Produzioni Animali, Epidemiologia ed Ecologia, Facoltà di Medicina Veterinaria, Università di Torino e Centro Tutela Biodiversità degli Ambienti Acquatici Bertassi di Avigliana (TO) Progetto finanziato da: Regione Piemonte - Direzione Agricoltura Settore Tutela e gestione della Fauna Selvatica e Acquatica OBIETTIVI DELLO STUDIO Lo studio è finalizzato a definire se la trota fario di ceppo mediterraneo (Salmo trutta trutta), che presenta caratteri esteriori simili a quelli presenti nelle popolazioni autoctone che fanno capo al bacino del Rodano in Francia, debba essere considerata forma autoctona anche nel versante alpino italiano e nei distretti occidentali del bacino del fiume Po. L attribuzione di entità zoologica autoctona ha importanti risvolti naturalisti e conservazionistici in quanto le popolazioni di questa semispecie si trovano negli stessi corsi d acqua popolati dalla trota marmorata (Salmo trutta marmoratus). Questa semispecie è un sicuro endemismo italiano nei corsi d acqua del versante alpino del bacino del fiume Po e già sta soffrendo pesanti problemi conservazionistici a causa della contrazione numerica delle popolazioni, contrazione di areale e perdita dell identità genetica, dovuta all ibridazione con altri ceppi di trota fario (ceppi atlantici alloctoni) che sono stati immessi nei corsi d acqua a scopo di pesca sportiva. Se in Italia si dimostrasse l autoctonia della trota fario di ceppo mediterraneo francese, sarebbe necessario attivare programmi di conservazione che rendano compatibile il recupero sia della trota fario mediterranea che della trota marmorata poichè in diversi casi condividono medesime zone di corsi d acqua in Piemonte. In caso contrario, dal momento che le semispecie Salmo trutta marmoratus e Salmo trutta (fario) mediterranea sono in grado di incrociarsi dando progenie fertile (fenomeno dell ibridazione), per la conservazione dell identità genetica della trota marmorata diventerebbe indispensabile rimuovere dalle acque condivise ogni altro salmonide tra cui la trota fario mediterranea. La conservazione delle specie autoctone è di primaria importanza rispetto a qualsiasi altra problematica gestionale delle attività ludico-sportive legate alla fauna selvatica, tra cui la pesca dilettantistica; Per questo si comprende quanto sia importante definire se la trota fario di fenotipo mediterraneo, di ceppo genetico riferibile a quello autoctono francese, sia autoctona anche in Piemonte per gli importanti risvolti gestionali faunistici e della pesca che ne derivano. A livello filogenetico, lo studio si è anche posto l obiettivo di fornire un contributo conoscitivo per la ricostruzione delle principali direttrici di colonizzazione dei salmonidi lungo le acque dolci nell intero bacino alpino italiano. 1

2 CONSIDERAZIONI STORICHE, CULTURALI, NATURALISTICHE E GESTIONALI Nel distretto occidentale del bacino del fiume Po, insieme alla trota marmorata (Salmo trutta marmoratus) che è sicuramente un salmonide autoctono, è attualmente presente anche la trota fario (Salmo trutta trutta, brown trout in lingua anglosassone) distinta in almeno due grandi gruppi genetici: il primo comprendente ceppi originari del Nord Europa e il secondo comprendente ceppi del bacino Mediterraneo (maggiormente diffuso) e Adriatico (meno diffuso). Il ceppo nordeuropeo, denominato ceppo atlantico è quello generalmente allevato nelle pescicolture ed è attualmente presente in tutte le Regioni attraversate dal fiume Po o dai suoi sistemi affluenti. Questa presenza è certamente alloctona e giustificata solo dal fatto che da diversi decenni trote fario o uova embrionate importate dai Paesi nordeuropei, vengono cresciute ed allevate nelle pescicolture italiane ed immesse nelle acque dolci interne per soddisfare le esigenze dei pescatori dilettanti e sportivi. Anche per la trota fario di ceppo mediterraneo francese esistono prove certe e storicamente documentate, di immissioni in Piemonte, Liguria e Valle d Aosta, con avannotti o uova embrionate trasportate dai corsi d acqua transalpini, in particolare da quelli dell Alta Savoia. Poiché preferita, per la maggior rusticità, dai pescatori dilettanti e sportivi, la trota fario di ceppo mediterraneo viene da diversi anni anche riprodotta negli allevamenti italiani, talvolta ibridata con la fario di ceppo atlantico per ottimizzarne le performance riproduttive e produttive. Anche questo materiale ittico è stato purtroppo largamente impiegato nelle immissioni per la pesca e si presume pertanto che il quadro distributivo dei ceppi genetici attualmente presente nei distretti occidentali del bacino del Po sia stato profondamente modificato rispetto a quello che sarebbe dovuto essere in assenza di immissioni ittiche e senza le modificazioni delle naturali dinamiche idrologiche dei corsi d acqua determinate da sbarramenti, derivazioni e modifiche agli alvei. La trota fario di ceppo mediterraneo francese è distinguibile da quella di ceppo atlantico per una caratteristica puntinatura più fitta della livrea laterale, sovente per la presenza di una macchia preopercolare e di macchie parr che spesso permangono anche nei soggetti sub adulti. Dal momento che le prime immissioni documentate risalgono a circa un secolo fa, i pescatori delle generazioni attuali sono propensi a considerare la fario mediterranea come una forma autoctona, semplicemente perché sin dall infanzia ne ricordano la presenza nelle zone più a monte dei torrenti alpini, aree sovente scarsamente occupate dalla trota marmorata che raggiungendo taglie maggiori tende a preferire i tratti più a valle dove trova acque più profonde e rifugi naturali tra i massi di maggiori dimensioni. Sotto il profilo naturalistico, faunistico ed evoluzionistico, viene considerato generalmente valido il principio secondo cui le differenze morfologiche, genetiche ed ecologiche, vengono acquisite dalle specie viventi con il passare del tempo e con il progressivo isolamento tra le diverse popolazioni; in termini più tecnici questo fenomeno prende il nome di riduzione del flusso genico, fenomeno che porta ad un progressivo isolamento genetico tra popolazioni che si distribuiscono in corsi d acqua differenti e pone le basi per l instaurarsi di un fenomeno più complesso che va sotto il nome di speciazione. Nella trota, il processo di speciazione non è stato completato e molte forme, anche fenotipicamente e biologicamente molto diverse, devono essere considerate come semispecie o ecotipi di una unica grande specie altamente polimorfa, in quanto conservano la capacità di incrociarsi dando origine a progenie fertile generalmente definita ibrida. In specie caratterizzate da elevate capacità di spostamento attivo e migratorio, il differenziamento tra popolzioni per riduzione del flusso genico è sempre piuttosto lento ma nei pesci d acqua dolce, vincolati negli spostamenti in sole due dimensioni 2

3 e forzatamente lungo le vie d acqua, il fenomeno dell isolamento genetico può essere stato accelerato. Date le peculiarità ecologiche e riproduttive della trota, nei salmonidi dulciacquicoli l isolamento per distanza geografica lungo le vie d acqua rappresenta un principio di differenziamento genetico e morfologico ormai universalmente riconosciuto, in quanto la validità dei suoi fondamenti sono stati più volte dimostrati in queste specie anche sotto il profilo genetico. Sulla base di queste ultime considerazioni, parrebbe alquanto poco probabile la presenza di un ceppo genetico mediterraneo di trota nella parte orientale delle Alpi piemontesi e valdostane del tutto simile a quello originario dei distretti francesi che fanno capo al bacino del Rodano nel versante opposto degli stessi rilievi. Infatti, escludendo la presenza per transfaunazione operata dall uomo, sulla base delle linee di spartiacque riferibili all attuale morfologia dei rilievi, la trota fario di ceppo mediterraneo potrebbe essere presente in Piemonte per vie naturali solo attraverso il Mar Adriatico, provenendo dal Mar Tirreno, dopo aver circumnavigato l intera Penisola Italica ed aver disceso i torrenti d acqua dolce francesi. Questo lungo percorso potrebbe anche essere stato favorito dal variare piuttosto repentino dei profili di costa delle terre emerse nei periodi glaciali e interglaciali, ma dovrebbe essere tenuto in considerazione anche un passaggio attraverso l acqua salata, con adattamento all ambiente salino e ritorno ad abitudini riproduttive dulcacquicole. Se è pur vero che i salmonidi mostrano una buona tolleranza alle variazioni di salinità dell acqua, è anche vero che è difficile ipotizzarne una rapida evoluzione fisiologica che abbia consentito a questo ipotetico salmonide ancestrale di riprodursi in acque marine durante le migrazioni. In alternativa la colonizzazione potrebbe essere stata estremamente rapida e condotta da soggetti di una sola generazione che dopo aver attraversato i mari sono tornati a riprodursi in acque dolci. Forse però, quello che maggiormente fa ritenere altamente poco probabile questa ipotesi di colonizzazione del bacino padano, è la pressoché totale assenza di popolazioni residue di trota fario di ceppo mediterraneo francese in tutto il bacino del fiume Po se si escludono i torrenti alpini Piemontesi. Alcune di queste ipotetiche popolazioni migratrici attraverso il mare, nel passaggio per raggiungere i distretti padani orientali, avrebbero dovuto poter mantenersi, con almeno qualche popolazione relitta, anche nelle zone centrali o occidentali del bacino del Po, ma negli studi finora eseguiti in Veneto, Trentino-Alto Adige e Lombardia sono solo stati trovati sporadici individui con genotipo mediterraneo, verosimilmente presenti per recenti immissioni di materiale ittico eterogeneo fornito dalle piscicolture. Una spiegazione più verosimile, che giustificherebbe la presenza del genotipo mediterraneo francese in Piemonte e la sua assenza nel restante bacino del Po, deve considerare l ipotesi di una o più repentine variazioni della linea di spartiacque lungo i rilievi alpini occidentali. Alcune popolazioni di trota dei più alti torrenti del versante francese prossimi alla linea di spartiacque, potrebbero essere rimaste intrappolate in pozze alpine o sistemi carsici che successivamente hanno trovato sbocco naturale in torrenti che scendevano il versante est delle Alpi verso il bacino padano, riversando con le proprie acque anche gli organismi in esse contenuti. In questo modo, la trota fario di ceppo mediterraneo francese potrebbe effettivamente aver colonizzato inizialmente i soli tratti superiori dei torrenti Piemontesi e Valdostani, ma in questo caso è ragionevole aspettarsi di trovare ancora precise tracce genetiche della presenza di popolazioni ancestrali francesi nelle popolazioni di trota attualmente presenti anche nel fondovalle dei torrenti piemontesi. Pertanto, sulla base del modello appena ipotizzato, nelle popolazioni di trota dei torrenti alpini piemontesi con fenotipo riferibile a quello mediterraneo francese, sono attesi genotipi somiglianti a quelli presenti nei torrenti francesi del versante alpino opposto più prossimo, sia sotto il profilo mitocondriale che nucleare ed allo-enzimatico. Sarebbe inoltre ragionevole attendersi la 3

4 presenza di tracce genetiche francesi nelle popolazioni di trota marmorata della parte più occidentale dell areale distributivo di questa specie, in quanto vi è sempre stata la tendenza a generare forme ibride nelle aree in cui questa semispecie autoctona è in contatto con la trota fario, sia di ceppo mediterraneo che di ceppo atlantico. Tenuto debitamente conto delle naturali evoluzioni genetiche a cui vanno incontro le popolazioni isolate, ma anche dell ibridazione con altri ceppi di trota che sicuramente devono essere avvenuti nel tempo, se questa corrispondenza tra le popolazioni di trota dei due versanti alpini dovesse essere confermata, allora l ipotesi di autoctonia della trota fario di ceppo mediterraneo francese prenderebbe consistenza anche nella porzione occidentale del versante alpino del bacino del fiume Po. Nel caso in cui si dovesse invece riscontrare somiglianza genetica tra popolazioni di trota presenti in un versante e nell altro del sistema alpino Nordoccidentale (sicuramente attesa in quanto le transfaunazioni di trota, documentate o quelle conservate nella memoria storica degli abitanti delle valli alpine, fanno esplicitamente riferimento a trote provenienti da popolazioni di corsi d acqua francesi) ma non corrispondenza geografica a livello di linea dello spartiacque e correlazione tra distanze genetiche e distanze geografiche, allora si dimostrerebbe la presenza di ceppo fario mediterraneo francese solo per transfaunazione operata dall uomo: Ne conseguirebbe l attribuzione di forma zoologica alloctona, con le importanti ripercussioni a livello gestionale e conservazionistico sopracitate. Un ulteriore conferma dell ipotesi di presenza della trota fario di ceppo mediterraneo francese in Piemonte e Valle d Aosta per spostamento delle linee di spartiacque durante le ultime glaciazioni, si potrebbe ricercare a titolo di verifica, sempre con strumenti genetici, studiando popolazioni di altri organismi che non sono stati sottoposti a transfaunazioni o translocazioni da parte dell uomo, come ad esempio gli invertebrati acquatici o le popolazioni di alghe unicellulari o coloniali. Il Piemonte in questo senso sembra essere un laboratorio di ricerca sempre di maggiore interesse geologico e naturalistico Sotto il profilo conservazionistico, poiché che la presenza della trota fario nelle zone in cui è presente la trota marmorata rappresenta un insidia in quanto determina un degrado genetico nella specie attraverso l ibridazione, dal momento che per la conservazione della biodiversità è prioritario preservare le forme autoctone ed endemiche, se trota fario di ceppo mediterraneo francese non dovesse rivelarsi autoctona, diventerebbe necessario intraprendere piani d azione che portino alla sua progressiva eradicazione nelle aree in cui è, ed era in passato, presente la trota marmorata, in modo da non ostacolare la riespansione delle residue popolazioni. Come diretta conseguenza, nei torrenti delle alpi occidentali, ogni piano gestionale già operativo e finalizzato al recupero e dispersione della trota fario di ceppo mediterraneo francese dovrebbe essere rivisto o dismesso in funzione della sua compatibilità con i piani di recupero della trota marmorata, che devono restare prioritari in quanto riguardano una forma sicuramente autoctona e di indubbio pregio naturalistico. Se riconosciute alloctone, le popolazioni di trota mediterranea francese potrebbero rimanere limitate ad aree non popolate dalla trota marmorata e comunque sicuramente isolate, in modo da non consentire il contatto fra le due semispecie, impedire il raggiungimento dei medesimi siti riproduttivi e scongiurare quindi l ibridazione. 4

5 ATTUALI CONOSCENZE Allo stato attuale, nell ambito di diverse ricerche conoscitive ed applicative condotte a livello locale in Valle d Aosta e in Piemonte, sono state studiate a livello morfologico, morfometrico e genetico, le popolazioni di trota fario (ceppo atlantico e ceppo mediterraneo) presenti in buona parte dei sistemi a cui affluiscono i torrenti più prossimi al confine francese. Il quadro generale vede una presenza prevalente della trota fario dei ceppi atlantici (sicuramente alloctoni) e una diffusa regressione delle aree storicamente occupate dalla trota marmorata, per la quale si è osservata negli anni una progressiva diminuzione in termini di areale, di consistenza numerica all interno delle popolazioni e di aumento dell ibridazione con introgressione genetica da parte di salmonidi alloctoni. Per quanto riguarda la trota fario di ceppo mediterraneo francese, esistono delle popolazioni che sembrano in grado di auto mantenersi in torrenti alpini piuttosto remoti e si tratta di trote dal fenotipo caratteristico conosciute dai locali pescatori come trote della regina ; in ogni caso però è spesso presente ibridazione con la trota fario allevata di ceppo atlantico. Più spesso, trote fario con genotipo mediterraneo vengono rinvenute mescolate a trote fario prodotte in allevamento in aree in cui vengono effettuate immissioni a scopo di pesca; in queste popolazioni miste costituite da soggetti immessi e altri derivati da riproduzione naturale, le tipiche livree che contraddistinguono le due forme sono sempre più spesso presenti in uno stesso individuo ibrido anche sotto forma di mosaicismi, segno evidente di pregressa introgressione genetica tra le due semispecie sia in allevamento che in natura. Nei distretti occidentali e Nord-occidentali padani, per le immissioni a scopo di pesca, molto spesso viene espressamente richiesta la trota fario di ceppo mediterraneo, perché più rustica ma anche perché ritenuta una forma originariamente presente in questi distretti geografici. Questa considerazione ha fondamenti principalmente storico-culturali e poco oggettive, in quanto se è pur vero che non si è ancora stati in grado di dimostrarne l autoctonia, è cosa quanto mai certa che dai distretti transalpini sono state introdotte in passato quantità consistenti e ripetute di trote fario. Giustificata dalla mancanza di dati certi sulla effettiva origine autoctona della trota fario di ceppo mediterraneo francese e per ragioni storiche e culturali, si è nel tempo affermata una gestione di riguardo per questo ceppo di trota, volto in qualche modo a conservarne le popolazioni esistenti se non ad espanderne l areale mediante immissioni mirate, per disporre nei fiumi piemontesi di una trota diversa da quella di allevamento di ceppo nordeuropeo meno eccitante sotto il profilo pescasportivo. Per questioni legate alla conservazione delle trote di ceppo autoctono è diventato di fondamentale importanza stabilire se la trota fario di ceppo mediterraneo è effettivamente autoctona o meno nei distretti piemontesi e valdostani, in modo da poter decidere se esistano i presupposti per elevare l attuale gestione di riguardo con finalità puramente estetiche, a vera e propria gestione con finalità conservazionistiche basata su presupposti scientifici. In caso o nei contesti geografici in cui venga riconosciuta alloctona, invece la trota fario di ceppo mediterraneo deve essere considerata un ostacolo alla conservazione o ricolonizzazione e al recupero delle forme sicuramente autoctone ancora presenti nei distretti Nord Occidentali con popolazioni residue, in primis la trota marmorata. Nel corso dei vertici e convegni internazionali in materia di conservazione e gestione della fauna, si è discusso molto con i colleghi ricercatori francesi sull importanza di queste problematiche e si è quindi convenuto che l unico modo per poter dare chiarimenti in merito all origine delle attuali popolazioni di fario di ceppo mediterraneo francese presenti in Italia, sia quello di procedere ad un confronto su base morfologica e genetica tra le residue e meglio 5

6 conservate popolazioni di trota, dei torrenti presenti sul versante francese e le popolazioni di trota dei torrenti presenti sul versane italiano delle Alpi Occidentali. 6

7 OBIETTIVI DELLA RICERCA IN SINTESI 1) Stabilire se la trota fario di ceppo mediterraneo francese sia autoctona nei distretti Nord occidentali della regione alpina (Piemonte) e quindi nel bacino del fiume Po. 2) Estrapolando dati e informazioni ottenute in questo studio, dal confronto con i dati genetici e morfometrici raccolti in più di un decennio di studi sulle popolazioni di salmonidi del bacino padano centrale e orientale, giungere a fornire un contributo o forse solo generare ipotesi alternative, sulla ricostruzione filogenetica e zoogeografica della specie Salmo trutta, così da poter meglio definire le direttrici di colonizzazione da parte dei salmonidi nel bacino del fiume Po. 3) Nel caso si riesca a dimostrare l origine autoctona della fario di ceppo mediterraneo francese, definirne il grado di purezza genetica residua nelle popolazioni naturali attualmente presenti, così da poter fornire le linee guida di un piano conservazionistico strategico che integri le esigenze di salvaguardia di tutti i salmonidi autoctoni in Piemonte. 4) fornire indicazioni e strategie gestionali in funzione della pesca nelle acque interne, in modo che l attività alieutica venga esercitata garantendo la conservazione delle forme autoctone e.in modo eco-compatibile. 7

8 AREA DI STUDIO E COLLABORAZIONI NEL PROGETTO DI RICERCA Per poter dare una corretta collocazione evoluzionistica e zoogeografica alle popolazioni di trota fario di ceppo mediterraneo francese presenti in Italia, allo stato delle conoscenze odierne, si rendeva indispensabile un confronto diretto con le attuali popolazioni, verosimilmente meglio conservate, di trota di ceppo mediterraneo presenti in territorio francese. Si rendeva cioè necessario ricercare una corrispondenza genetica e fenotipica tra le popolazioni residue di trota faro di ceppo mediterraneo che attualmente popolano rispettivamente le zone più a monte dei torrenti alpini dei versanti francese ed italiano, che hanno area sorgentizia prossima allo spartiacque, definito dall attuale linea di cresta delle Alpi che unisce le sommità dei rilievi alpini occidentali e transita attraverso i passi montani. E stato pertanto attivato un accordo di collaborazione con l Università di Montpellier (FR) che nella ricerca ha collaborato al reperimento dei campioni e nello svolgimento delle analisi genetiche e morfometriche sulle popolazioni di trota francesi. Sono stati congiuntamente definiti i materiali e i metodi di studio necessari per giungere agli obiettivi prefissati ed è stata concordata l uniformità dei protocolli di studio e di analisi di laboratorio, integrando da ambo le parti protocolli e marcatori genetici non ancora utilizzati dai rispettivi gruppi di ricerca. L obiettivo è stato quello di rendere i dati prodotti confrontabili in un unico database ed inoltre di giungere a poter confrontare anche i dati storici, genetici e morfometrici, raccolti in anni di studio precedenti. Proprio da studi recenti, era emerso che nel bacino della Dora Baltea in Regione Valle d Aosta non sono presenti popolazioni di trota fario di ceppo mediterraneo, anche se sono stati trovati sporadici individui che portano genotipo mitocondriale mediterraneo presenti all interno di poche popolazioni costituite quasi totalmente da trota dei ceppo atlantico, allevata nelle piscicolture ed immessa a scopo di pesca. Conseguentemente, a livello di accordo preliminare con i partner francesi, si è stabilito di concentrare le ricerche lungo il confine tra la Francia e la Regione Piemonte, interessando i tratti più a monte dei bacini del Chiusella, Soana e Orco, dello Stura di Valgrande, di Ala e di Viù, i torrenti Cenischia, Rochemolles, Thuras e Ripa per il bacini della Dora Riparia, i torrenti Chisone, Germanasca, Angrogna, Pellice con il tratto superiore del Po, proseguendo verso Sud con i torrenti Varaita, Maira, Grana, Stura di Demonte, Gesso e Vermenagna, per concludere con le valli dell alto Pesio e dell alto Tanaro. Da parte francese, sulla base di un compromesso fra obiettivi minimi della collaborazione, autorizzazioni ai campionamenti e risorse economiche destinabili a questa estensione del progetto inizialmente non prevista, si è pianificato di investigare sui tratti superiori dei bacini dell Isere, della Durance, dell Ubaye e della Roya. 8

9 MATERIALI E METODOLOGIE UTILIZZATE NELLA RICERCA Sono stati eseguiti campionamenti di tipo prevalentemente qualitativo nei tratti superiori dei torrenti, selezionando nelle popolazioni di salmonidi presenti i soggetti che maggiormente mostrano nella livrea laterale i tratti caratteristici del fenotipo fario mediterraneo. In fase di campionamento i soggetti catturati mediante pesca elettrica, sono stati blandamente sedati per effettuare il prelievo di un piccolo pezzo di pinna anale per le analisi genetiche e per ritrarre una foto o ripresa video su cui verranno in una fase successiva, quando il campione raccolto sarà di dimensioni idonee per essere elaborabile, effettuati i rilevi morfometrici al calcolatore dopo aver eseguito le opportune analisi d immagine. I campioni sono stati raccolti in più campagne di campionamento eseguite nei due anni dello studio, nei torrenti dei versante alpino francese ed italiano, partendo da un criterio di supposta vicinanza genetica sulla base della minor distanza geografica tra i siti di campionamento, tenendo conto sia dell attuale orografia del territorio alpino e sia delle più probabili evoluzioni orografiche occorse negli ultimi 20 mila anni. La strategia della scelta dei siti di campionamento è stata quella di poter successivamente, con i dati ottenuti, dare una risposta alle due principali ipotesi formulate: la prima di presunta autoctonia, secondo la quale si deve trovare correlazione statisticamente significativa fra distanze genetiche e distanze lungo le vie d acqua, nelle popolazioni naturali di trota a fenotipo mediterraneo francese; la seconda, di supposta manipolazione e transfaunazione da parte dell uomo, in cui tale correlazione, confrontata con quella presente tra la popolazioni di trota transalpina, viene a mancare. Raccolta di nuovi campioni Sono state effettuate missioni di campionamento sia in Francia che in Italia e precisamente: Francia: bacino del fiume Roya, bacino del fiume Ubaye, bacino superiore della Durance, bacino dell Isere. Italia: bacino dello Stura (valli di Lanzo, Valgrande e valle di Viù), bacino della Dora Riparia con scarsissimo successo in termini di presenza della trota fario di fenotipo mediterraneo; sono stati recuperati alcuni soggetti nel Ripa dove ne è stata segnalata la presenza sin dal secolo scorso; bacino del Maira, bacino del Vermenagna e bacino del Gesso; bacino dello Stura di Demonte; altri campionamenti in provincia di Cuneo sul bacino del Tanaro. Nei torrenti piemontesi la presenza di soggetti di trota fario di fenotipo mediterraneo è stata generalmente riscontrata, ma non strutturata in popolazioni e bensì dovuta quasi sempre alle immissioni effettuate a scopo di pesca. Sulla base dei dati raccolti nel corso degli ultimi decenni e quanto riportato nella Carta Ittica del Piemonte, le popolazioni di trota fario mediterranea un tempo strutturate appaiono ai giorni nostri in declino o del tutto scomparse in alcune valli (Germanasca, Chisone a valle del Parco della Val Troncea, Val Clarea e altre). Specificatamente per questo progetto sono stati raccolti complessivamente 725 nuovi campioni di Salmo trutta di fenotipo e semispecie diversi, provenienti da diversi bacini e corsi d'acqua, italiani e francesi, così suddivisi: Chiusella: Dora Riparia: Po: Stura di Demonte: Stura di Lanzo: Tanaro: 31 campioni 44 campioni 57 campioni 195 campioni 94 campioni 48 campioni 9

10 Durance: Iserè: Roya: Ubaye: 65 campioni 33 campioni 55 campioni 41 campioni Il confronto fra le popolazioni è stato effettuato su base genetica mediante marcatori nucleari (loci microsatellite), mitocondriali (regione del D-loop), concordati con i partner francesi. Per la parte morfologica, il confronto è stato finora possibile solo sulla base dei caratteri cromatici della livrea classificati secondo un criterio ben collaudato. ll campione che si è potuto trattare è risultato ancora numericamente insufficiente e troppo eterogeneo per poter utilizzare come discriminante lo strumento dell analisi della forma e il metodo della morfometria geometrica. Le analisi sul materiale fotografico e video raccolti sono stati comunque effettuati sia sui campioni italiani che su quelli francesi ma si è concordato con partner di ricerca che le analisi morfometriche verranno eseguite in una fase successiva, per l esiguità di dati sulle popolazioni di trota francese disponibili per un confronto con quelli italiani. Nello studio sono stati utilizzati anche dati raccolti negli ultimi decenni nell ambito di altri progetti, e i dati genetici così ottenuti dai diversi gruppi di ricerca sono stati per quanto possibile uniformati ed integrati in un unico database, in modo da poter essere confrontati con approccio statistico. E stato quindi necessario eseguire ulteriori analisi sui campioni storici già studiati nel corso di precedenti studi, anche alla luce dei nuovi marcatori genetici che sono stati recentemente messi a punto. Analisi di laboratorio Notevoli difficoltà di reperimento dei campioni per la difficoltà di trovare popolazioni strutturate di trota fario a fenotipo mediterraneo in Piemonte. Sui campioni raccolti sono stati ulteriormente messi a punto i protocolli di analisi per adattarli all interscambio di dati con i partner francesi e sono state svolte nuove analisi genetiche di integrazione con altri marcatori genetici sui campioni già raccolti nel corso di studi precedenti. Si è successivamente concordato con i partner francesi di incrementare ulteriormente il numero di marcatori nucleari da utilizzare in questo studio al fine di poter giungere ad un maggior livello di approfondimento dei dati di genetica di popolazione di questa specie, effettuando però una selezione sul set di campioni disponibili. in sintesi, per le analisi di laboratorio si è provveduto a: Estrazione acidi nucleici: Il DNA è stato estratto da tutti i 632 nuovi campioni di trota raccolti e provenienti da 9 differenti corsi d'acqua, 5 aventi il loro corso nel versante italiano delle Alpi (Dora Riparia, Po, stura di Demonte, stura di Lanzo e Tanaro) per un totale di 438 nuovi campioni italiani e 4 corsi d acqua che hanno il decorso nel versante francese (Durance, Iserèe, Roya e Ubaye) per un totale di 194 campioni francesi. All'interno del progetto sono stati inseriti anche 528 campioni provenienti da fiumi piemontesi raccolti negli anni precedenti e solo parzialmente già analizzati. Il totale dei 10

11 campioni presi in esame per il progetto è superiore al migliaio e si tratta di campioni provenienti dai corsi d'acqua seguenti: Dora Riparia: Pellice: Pesio: Po: Stura di Demonte: Stura di Lanzo: Tanaro: Val Maira: Val Troncea: Durance: Iserè: Roya: Ubaye: 44 campioni 130 campioni 84 campioni 57 campioni 299 campioni 211 campioni 48 campioni 12 campioni 84 campioni 65 campioni 33 campioni 55 campioni 41 campioni Il DNA è stato estratto immergendo un frammento di pinna anale in 350µl di soluzione Chelex5% (Buffer 0,01M Tris/Cl ph8; 0,001M EDTA; 0,1% Na Azide) con l aggiunta di 3,5 µl di Proteinasi K (10mg/ml). I campioni sono stati posti ad incubare a 56 C overnight ed infine portati a 95 C per inattivare la Proteinasi K. - Analisi dei marcatori genetici nucleari: E' stata eseguita l'analisi di 9 loci microsatellite per ciascun campione ed è stato completato il pannello di 9 loci per i campioni raccolti in Piemonte nel corso di studi precedenti. I loci sono stati amplificati mediante l impiego delle seguenti coppie di primers in cui il primer forward presenta in 5 l aggiunta di un fluoroforo: 11

12 L amplificazione dei loci è avvenuta impiegando sia PCR singleplex sia multiplex utilizzando l enzima GoTaq Flex DNA Polymerase PROMEGA seguendo le istruzioni indicate del produttore. Gli amplificati sono stati sottoposti a elettroforesi in capillare e i dati delle corse sono stati utilizzati nel nostro centro per l identificazione degli alleli tramite il software PeakScanner v1.0, i risultati sono stati quindi introdotti in tabelle di fogli di calcolo per successive elaborazioni. Oltre ai primi 9 loci microsatellite, sono stati impiegati anche altri 9 loci addizionali facenti parte di un pannello solitamente utilizzato per distinguere il genotipo atlantico da quello mediterraneo e adriatico nelle popolazioni di trota fario francesi ed italiane. Il budget disponibile ha consentito di effettuare le analisi solo su di un subset di campioni (vedasi tabelle dei risultati). Al termine del lavoro di laboratorio, integrando in un unico database le analisi svolte nei laboratori italiani e francesi, ma solo per un numero ridotto di campioni, è stato possibile disporre di dati provenienti dalle analisi di 18 loci nucleari microsatellite. Pur consci di aver ottimizzato i budget disponibili in funzione della massimizzazione dei dati ottenibili c è la consapevolezza che l estensione di tutte le analisi su tutti i campioni raccolti metterebbe in condizione di confermare i risultati e ottenere ovviamente indicazioni maggiori. - Analisi marcatori genetici mitocondriali: Basandoci su sequenze di DNA mitocondriale ottenute da precedenti studi, nel nostro centro di bioinformatica è stata disegnata una coppia di nuovi primers capaci di amplificare l intera Per l amplificazione è stata impiegata la GoTaq Flex DNA Polymerase PROMEGA secondo le istruzioni del produttore utilizzando il seguente protocollo. 12

13 Dloop Protocol denaturazione iniziale 95 C per 5' PCR 94 C per 30" Cicli C per 40" 72 C per 70" estensione finale 72 C per 5' I prodotti di amplificazione sono stati purificati mediante gli enzimi Shrimp Alcaline Phosphatase e Exonuclease I (Fermentas) secondo le istruzioni del produttore e sequenziati utilizzando gli stessi primer impiegati nell amplificazione. Per ogni campione è stata ottenuta una sequenza con il primer AlfaTroutPrimerDloopF ed una con AlfaTroutPrimerDloopR. Tramite il software BioEdit , le sequenze sono state allineate tra loro e con le sequenze di riferimento per i differenti aplotipi mitocondriali reperibili su GeneBank. Alla data odierna è stato amplificato il DNA mitocondriale dell'intera regione di controllo di Dloop per circa 500 campioni di trota (160 francesi e i restanti italiani). Sono stati così identificati gli aplotipi mitocondriali dei differenti soggetti analizzati e mediante software di analisi filogenetiche e di genetica di popolazione (ClustalW, Mega, Arlequin) sono state calcolate le distanze molecolari sia tra i diversi aplotipi trovati e le distanze genetiche tra i campioni rappresentativi dei diversi corsi d acqua studiati. Mediante altri software (Mega, Treefit e Treeview) si è proceduto ad ottenere rappresentazioni grafiche (alberi filogenetici e di distanza genetica) utilizzando gli algoritmi di calcolo UPGMA, Neighbour Joining e Maximum Likelihood. I dati mitocondriali sono stati analizzati dapprima utilizzando anche quelli ottenuti da soggetti portatori di genotipo mitocondriale atlantico, tipico delle popolazioni nordeuropee e Atlantiche francesi, quindi sicuramente alloctono nei distretti Padani. Successivamente sono stati analizzati togliendo dai database gli aplotipi atlantici in modo da poter meglio stimare le relazioni fra li campioni provenienti dai diversi siti di campionamento senza il disturbo dei genotipi alloctoni. Le analisi sono anche state condotte distinguendo i fenotipi mediterranei da quelli atlantici al fine di verificare se è ancora presente una correlazione stretta tra caratteri cromatici della livrea e genotipo in popolazioni soggette a forte introgressione genetica di genotipi alloctoni, come sono quelle della trota fario piemontese. 13

14 RISULTATI E DISCUSSIONE Analisi loci nucleari microsatellite. Per quanto riguarda le analisi sul DNA nucleare, non è stato possibile analizzare, con lo stesso numero di loci microsatellite, tutte le 464 trote campionate. Per questo, sono stati eseguiti tre livelli di analisi, con 9 loci (464 trote), 12 loci (362 individui) e 18 loci (solo alcuni individui). L intero campionamento e il numero di trote analizzate è riportato in tabella 1. Bacino FiumePrincip Corso d acqua sigla sample N Sample size 9 loci 12 loci 18 loci Rhône Isère Isère ISE xx Rhône Durance Durance Clarèe confl. DUC xx Rhône Durance Durance Guil confl. DUG xx Rhône Durance Ubaye Col de larc UBA xx Roya Roya Roya downstream ROB Roya Roya Roya upstream ROT Po Dora Riparia Ripa e Val Clarea DRP xx Po Pellice Pellice EPE xx Po Pellice Pellice Germanasca EPG xx Po Pellice Pellice Chisone EPH xx Po Pesio Pesio upstream PES xx Po Pesio Pesio Certosa PET xx Po Po Po upstream POB xx Po Po Po rio Giulian POG xx Po Po Po Lenta POL xx Po St. Demonte Gesso SDG xx Po St. Demonte upstream & tribut SDM xx Po St. Lanzo S.Lanzo downstream SLM xx Po St. Lanzo S. Lanzo upstream SLN xx Po Tanaro Tanaro Casotto TAC xx Po Tanaro Tanaro Negrone TAN xx Po Maira Maira VMA xx Po Chisone Chisone Val Troncea VTR xx 14

15 Tabella 1-descrizione dei campioni Ciascuno dei 3 livelli è stato studiato dapprima con (i) una prima analisi multidimensionale (in realtà un analisi delle corrispondenze fattoriali FCA) utilizzando il programma Genetix poi (ii) mediante un programma di assegnazione con il programma STRUCTURE. 1 step: Risultati delle analisi con i primi 9 loci Analisi Multidimensionale Un totale di 464 trote sono state sottoposte ad analisi su 9 loci permettendo di descrivere una struttura generale delle popolazioni di trota campionate. Nelle figure da 1 a 15, i fiumi: Pellice, Pesio, PO, Stura di Demonte, Stura di Lanzo e Tanaro sono stati considerati come ciascuno un singolo campione, nonostante i loro 2-3 sottocampioni. La capacità di discriminazione limitata della FCA rende tuttavia questa semplificazione non determinante per un primo approccio analitico generale La struttura globale descrive un trend genetico lungo il primo asse (orizzontale), tranne per i campioni del Roya che vengono discriminati lungo le coordinate positive dell'asse 2 (verticale) (Figure 5 e 6). Gli altri campioni sono invece posizionati principalmente lungo l asse orizzontale. Figura 1 - Position of the trout of the Isère French sample in the whole diversity described in the 9 loci analysis. 15

16 Figura 2 - Position of the trout of the Durance (DUC upstream) French sample in the whole diversity described in the 9 loci analysis. Figura 3 - Position of the trout of the Durance (DUG downstream) French sample in the whole diversity described in the 9 loci analysis. 16

17 Figura 4 - Position of the trout of the Ubayette French sample in the whole diversity described in the 9 loci analysis. Figura 5 - Position of the trout of the Roya (ROT upstream) French sample in the whole diversity described in the 9 loci analysis. 17

18 Figura 6 - Position of the trout of the Roya (ROB downstream) French sample in the whole diversity described in the 9 loci analysis. Figura 7 - Position of the trout of the Dora Riparia DRI Italian sample in the whole diversity described in the 9 loci analysis. 18

19 Figura 8 - Position of the trout of the Pellice Italian sample EPE in the whole diversity described in the 9 loci analysis. Figura 9 - Position of the trout of the Pesio Italian sample PES in the whole diversity described in the 9 loci analysis. 19

20 Figura 10 - Position of the trout of the Po Italian sample in the whole diversity described in the 9 loci analysis. Figura 11 - Position of the trout of the Stura di Demonte SDM Italian sample in the whole diversity described in the 9 loci analysis. 20

21 Figura 12 - Position of the trout of the Stura di Lanzo Italian sample in the whole diversity described in the 9 loci analysis. Figura 13 - Position of the trout of the Tanaro Italian sample TAN in the whole diversity described in the 9 loci analysis. 21

22 Figura 14 - Position of the trout of the Maira Italian sample VMA in the whole diversity described in the 9 loci analysis. Figura 15 - Position of the trout of the Troncea Italian sample VTR in the whole diversity described in the 9 loci analysis. 22

23 Isère Durance Durance Ubaye Dora Riparia Pellice Pesio Po Stura di Demonte Stura di Lanzo Tanaro Maira Chisone Val Troncea Figura 16 - Range di coordinate dei campioni lungo l asse delle ascisse. I campioni francesi in verde e i campioni italiani in azzurro. Il range dei campioni francesi è generalmente più ristretto e localizzato nella parte negativa dell asse X. I campioni italiani invece tendono ad occupare tutto l asse, mostrando una maggior variabilità intra-campione e verosimilmente una maggiore eterogeneità. Test di assegnazione sui 9 loci. I test di assegnazione sono stati eseguiti con il programma STRUCTURE versione 2.1 che permette di stimare i più probabili sotto gruppi di individui che possono essere identificati perché in condizione di equilibrio di Hardy-Weinberg e di Linkage (Linkage Disequilibrium). Abbiamo assunto che tutti gli individui del campione fossero mescolati ed un modello di correlazione con le frequenze alleliche come metodo di assegnazione degli individui ai diversi gruppi. Per esperienze pregresse in questo tipo di analisi, si è deciso di impostare la durata della simulazione a e ripetizioni, rispettivamente. Abbiamo predeterminato K (numero di logici sotto-gruppi) come il valore più in alto che consenta a tutti i sottogruppi di essere predominante in almeno uno dei campioni in analisi. In altre parole, abbiamo coerentemente assecondato la partizione proposta dal programma con quella geografica e di campionamento. Nelle figure che seguono sono riportati i grafici dei risultati utilizzando K da 2 a 8. 23

24 Figura 17 - K = 2, per i campioni (numero in ascissa) fare riferimento alla tabella 1 Figura 18 - K = 3;, per i campioni (numero in ascissa) fare riferimento alla tabella 1 Figura 19 - K = 4 I colori dei sottogruppi sono assegnati a caso e non hanno relazione con le figure precedenti) 24

25 Figura 20 - K = 5;, per i campioni (numero in ascissa) fare riferimento alla tabella 1 Per k= 6, si distinguono chiaramente solo 5 sottogruppi ed il sesto appare una forzatura, quindi il valore migliore di K per le analisi è uguale a 5. I valori di assegnazione di ciascun campione ai 5 sottogruppi sono indicati come percentuali nella tabella 2. Le celle colorate indicano il sottogruppo a cui ogni campione è prevalentemente assegnato. Interpretazione dei risultati ottenuti (rif Tab 2) Per quanto riguarda sia le analisi multidimensionale che di assegnazione, appare chiara la presenza di una struttura di popolazione: - nelle popolazioni di trota francese la logica del differenziamento su base geografica appare rispettata. Nella tabella 2, il campione Isère è principalmente assegnato al sottogruppo 5, la Durance all 1 e il Roya al 2. - La logica geografica di differenziamento su base geografica dei campioni italiani invece nell insieme non viene rispettata. Le principali discordanze sono che il Pellice è stato assegnato ai sottogruppi 3 o 4 e la Stura di Demonte a 1 o 3; questo parrebbe da potersi imputare alla presenza di genotipo marmoratus che è certamente presente nelle popolazioni ibride di questi distretti. Esistono anche altre discrepanze meno importanti riconducibili a: - la somiglianza tra I campioni della Val Troncea e dell Isere è da imputarsi alla presenza di alcuni alleli verosimilmente nulli e condivisi a carico di 1 o 2 loci microsatellite; Dopo la rimozione il campione della Val Troncea viene assegnato al gruppo 1 (Durance e Ubayette). - Il gruppo 3 è quello caratterizzato da campioni in cui è, o è stata, consistente la presenza di popolazioni di trota marmorata di cui verosimilmente i campioni raccolti portano segni di introgressione - Se le attuali popolazioni francesi e italiane si trovassero nei loro rispettivi fiumi naturali, la differenziazione dovrebbe rispettare l'isolamento genetico che si è venuto a determinare nei tempi a causa dell isolamento geografico (ridotto flusso genico) tra le popolazioni naturali. È per questo che i campioni dello stesso bacino dovrebbero essere geneticamente più vicini rispetto ai campioni di bacini diversi. In generale si può quindi concludere da queste prime 25

26 analisi preliminari che la struttura genetica tra le popolazioni francesi è chiaramente più in accordo con la topografia dei corsi d acqua rispetto a quella italiana. Inoltre, la distribuzione di trote di ceppo mediterraneo è in accordo con la distribuzione francese di questa trota (Berrebi, comunicazione personale), e meno con quelle italiane. - Se ipotizziamo che le popolazioni italiane siano autoctone allora si dovrebbe aver trovato una maggior coerenza tra distanze genetiche e distanze geografiche lungo tutto l areale della trota fario presente nei fiumi alpini del Piemonte. Questa correlazione tra distanze genetiche e geografiche pare non esserci oppure in alcuni bacini è fortemente mascherata dalla presenza di genotipo marmoratus ma principalmente da quello atlantico (vedasi analisi successive e risultati delle analisi sul DNA mitocondriale) - Se ipotizziamo invece che le popolazioni italiane sono artificiali, cioè frutto di transfaunazione dai corsi d acqua transalpini, le somiglianze tra la Durance in Francia e Dora Riparia e Stura di Demonte (sottogruppo 1) e tra Isère e Chisone e Val Troncea (sottogruppo 5) sono il risultato di spostamenti tra corsi d acqua di versanti opposti (francese ed italiano) ma più vicini; pertanto, almeno tra questi siti italiani la traslocazione di popolazioni parrebbe essere stata contenuta. - Le popolazioni italiane sono per lo più assegnate ai sottogruppi 3 e 4. Questa linea è una naturale o corrisponde alla principale linea introdotta in Italia. 26

27 River Locality sample sample AD01z ME11y MA02 AT0x AD01w N size ME01x ME11y cluster cluster AD01z Isère ISE Durance DUC, Clarée confl Durance DUG, Guil confl Durance UBA, Ubaye Roya ROT, Upstream Roya ROB, downstream Dora Riparia DRP Pellice EPE Pellice EPG Germanasca Pellice EPH Chisone Pesio PES Pesio PET Po POB Po POG Po POL Lenta Stura di Demonte SDG, Gesso Stura di Demonte SDM Stura di Lanzo SLM Stura di Lanzo SLN Upstream Tanaro TAC Casotto Tanaro TAN Negrone Maira VMA Chisone Val Troncea VTR atteso Tabella 2 - percentuali di assegnazione per ogni gruppo. I campioni costituiti da un numero limitato di soggetti (Sample Size) devono essere considerati solo come indicativi, come le percentuali di assegnazione inferiori al 10%. In ocra le principali assegnazioni e in giallo quelle secondarie. I valori inferiori al 20% non vengono considerati e quando non esiste un gruppo di assegnazione primario vengono indicati i due maggiori gruppi in colore giallo. Nella seconda riga sono indicati i principali aplotipi (vedasi successive analisi mitocondriali) a cui i diversi gruppi, prodotti dalle analisi di assignement, verrebbero correlati 27

28 2 step: individuazione genotipi atlantici; Analisi progettuale. Il primo step è stato quello di analizzare i campioni francesi ed italiani utilizzando 9 loci microsatellite. Alcune similitudini sono state osservate con la possibilità di translocazioni tra Durance in Francia e Dora Riparia e Stura di Demonte, sottogruppo 1 del primo test di assegnazione, e tra Isère e Chisone Val Troncea, sottogruppo 5. Verosimilmente però alcune somiglianze genetiche emerse sono dovute alla presenza di alleli nulli nei marcatori microsatellite, quindi condizione imprevedibile da verificare in futuro. Quanto emerge potrebbe essere interpretato come un primo segno di possibili translocazioni di trote, avvenute in passato, dai distretti vicini francesi verso i torrenti alpini piemontesi. In questo secondo step si è voluto invece indagare la presenza di trota domestica (ceppi atlantici prodotti in allevamento) utilizzata nelle immissioni, lungo tutti i siti di campionamento indagati nel presente studio. Per questo, i nove loci utilizzati sono stati diversi e i campioni della Roya non sono stati utilizzati. Quando sarà possibile utilizzare i dati di tutti i campioni analizzati per tutti i loci, i dati comprenderanno 18 loci microsatellite e come termine di confronto sono stati usati campioni raccolti presso 4 allevamenti francesi che producono trota di allevamento di ceppo atlantico. Fanno seguito figure e tabelle analoghe a quelle presentate per l analisi dello step 1 Basin Main River River Locality sample N 9 loci N commercial farms All around France Rhône Durance Durance Clarée confluence 2 11 Rhône Durance Durance Guil confluence 3 14 Rhône Isère Isère upstream 4 32 Rhône Durance Ubaye Ubayette 5 33 Dora Riparia DRI 6 1 Dora Riparia DRP 7 32 Pellice EPE 8 6 Pellice EPG 9 14 Pellice EPH 10 1 Pesio PES Pesio PET Po POB Po POG Po POL

29 Stura di Demonte SDG 16 9 Stura di Demonte SDM Stura di Lanzo SLM 18 6 Stura di Lanzo SLN Tanaro TAC 20 6 Tanaro TAN Maira VMA 22 6 Chisone Val Troncea VTH 23 2 Chisone Val Troncea VTR Tabella 3 - nuova descrizione dei campioni per l analisi di secondo step Multidimensional analysis Figura 21 - le trote di allevamento (ceppo atlantico)sono rappresentate in rosso,quindi l area a sinistra dei grafici rappresenta la nuvola di individui che portano un genotipo nucleare simile a quello delle trote di allevamento. 29

30 Molte trote presenti nei corsi d acqua naturali risultano portare genotipo atlantico. e l analisi di assegnazione fornirà una misura più precisa del grado di presenza di genotipi alloctoni nei campioni presi in esame. Le due altre nuvole di distribuzione degli individui sono in alto a destra (campioni dell Ubayette e Stura di Demonte), e in basso a destra (campioni della Durance nel tratto più a monte alla confluenza con la Clarèe, Dora Riparia e Chisone Val Troncea. Questo non è esattamente quanto osservato con l analisi dei 9 loci precedenti ma la sostanza è la medesima. Assegnazione Nell analisi di assegnazione utilizzando il software STRUCTURE, i risultati ottenuti sembrano abbastanza diversi: - L'impatto presente a carico della trota di allevamento (ceppo atlantico) pare trascurabile, e cioè inferiore al 15% in generale, con l'eccezione di SLM in cui si raggiunge il 40% (Stura di Lanzo nel tratto medio-basso). - I tre fiumi francesi qui analizzati vanno a corrispondere a un diverso gruppo ciascuno (Durance sottogruppo = 2; Isère = 4; Ubaye = 5). Quando ad un gruppo non è assegnato alcun fiume francese, allora risultano attribuiti diversi fiumi italiani (TAC-PET-POL-POB-PES = gruppo 3; EPE-SDG-TAN-VMA-SLN= 6). Il gruppo 6 viene riferito all aplotipo mitocondriale marmoratus (vedasi analisi mitocondriale in seguito) maggiormente presente in quei corsi d acqua e pertanto è verosimile che parte del genotipo sia identificabile dall analisi del DNA nucleare (introgressione tra la trota marmorata e la trota fario) Le percentuali di assegnazione risultano essere molto alte, con il valore più basso per lo Stura di Lanzo nel tratto più a monte, corso d acqua che comunque, nel tratto più a valle (SLM) presenta valori di stima di introgressione con ceppo atlantico piuttosto consistenti, quindi verosimilmente sia le originarie popolazioni di trota marmorata che quelle di trota fario di ceppo mediterraneo (se presenti) hanno subito fortemente l introgressione genetica da parte di ceppi di allevamento. Il gruppo 3 invece viene riferito all aplotipo mitocondriale atlantico (alloctono, vedasi analisi mitocondriale in seguito) e a quel gruppo sono assegnati infatti i campioni che maggiormente presentavano una livrea tipica delle forme allevate. -Chiari collegamenti genetici sono invece dimostrati tra alcuni campioni italiani e francesi: Durance Claree+Doria Riparia (DRP) + Chisone Val Troncea (VTR) nel gruppo 2; Ubaye + Stura di Demonte(SDM) nel gruppo 5. Confrontando le due tabelle 1 e 4, ottenute utilizzando set di marcatori microsatellite diversi, si conclude che: è scomparso un gruppo assegnabile al fiume Roya non presente in queste analisi, mentre il gruppo 1 della tabella 1 viene splittato in tabella 4 nei due gruppi riferibili ai raggruppamenti mitocondriali delle trote mediterranee (gruppo 2 in tabella 4) e adriatiche (gruppo 5 in tabella 4). Altra considerazione importante è che in questo caso, non essendoci evidentemente l influenza di alleli nulli in questi diversi loci microsatellite, il campione della Val Troncea (VTR) viene dissociato da quello dell Isère (ISE) per essere compreso in quello di Durance upstream (DUC) e Dora Riparia (DRP). 30