Determinazione dei livelli di citochine in concentrati eritrocitari sottoposti a filtrazione e lavaggio

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1 Determinazione dei livelli di citochine in concentrati eritrocitari sottoposti a filtrazione e lavaggio Rita Scocchera, Paola Iudicone, Antonella Matteocci, Filomena Terlizzi, Marinella Piccari, Maria Graziella Dionisi, Daniela Fioravanti, Marina Guglielmetti, Emilio Mannella Centro Nazionale Trasfusione Sangue - Croce Rossa Italiana, Roma Although the procedures of leucodepletion and washing of red blood cells (RBCs), occasionally febrile non haemolytic transfusion reactions (FNHTRs) can occur. Pro-inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α) have been described to play a relevant role in these reactions. The leucodepletion could be considered as an inductor mechanism of the cytokine synthesis in the RBC concentrates by the residual white cells (WBCs). During the last year some FNHTR occurred in β-thalassaemic patients followed in our Centre after infusion of leucodepleted or leucodepleted and washed RBCs. On the basis of this observation, we investigated the IL-1β, IL-6, IL-8 and TNF-α levels in RBC concentrates before and after leucodepletion/ washing. The results showed that the levels of proinflammatory cytokines in leucodepleted and washed RBC were higher than those found in the control samples, as well as the cytokine levels measured before RBCs leucodepletion were higher than those observed following the leucodepletion and washing procedures, with the exception for the TNF-α. These data suggest that leucodepletion do not induce the synthesis of cytokines by residual WBCs and thus they seem to exclude the cytokine involvement in the FNHTRs that we observed. Further research is required to explain these transfusion related unfavorable effects that still occur. Parole chiave: citochine proinfiammatorie, concentrati eritrocitari, leucodeplezione, reazioni febbrili post trasfusionali non emolitiche Key words: Proinflammatory cytokines, red cell(s), leucodepletion, febrile non haemolytic transfusion reactions Ricevuto: 24 agosto Accettato 30 settembre 2002 Corrispondenza: Dott.ssa Rita Scocchera Via Lamporecchio Roma Introduzione Le citochine sono mediatori solubili che esercitano funzioni prevalentemente di tipo regolatorio su una grande varietà di processi fisiologici, fra cui il controllo del sistema immune, l'emopoiesi e la risposta infiammatoria. In quest'ultimo processo sono implicate citochine con attività prevalentemente pro-infiammatoria, quali l'interleuchina 1 beta (IL1-β), l'interleuchina 6 (IL-6), il Fattore di Necrosi Tumorale alfa (Tumor Necrosis Factor alfa, TNF-α), o con funzione attivante o chemiotattica per i neutrofili, come l'interleuchina 8 (IL-8). In considerazione delle suddette caratteristiche funzionali, l'il1-β, l'il-6, il TNF-α e l'il-8 sono stati oggetto di grande interesse nello studio delle reazioni trasfusionali non emolitiche (febrile non haemolytic transfusion reactions, FNHTR). Vari Autori 1-3 hanno, infatti, osservato una correlazione tra la presenza di elevate quantità di citochine pro-infiammatorie negli emocomponenti conservati e l'incidenza di FNHTR. Poiché i globuli bianchi (GB) sono le cellule maggiormente responsabili della sintesi di tali citochine, la loro presenza all'interno di concentrati eritrocitari e piastrinici, dovrebbe essere causata dai GB, o in forma di rilascio passivo a seguito del danno cellulare durante il periodo di conservazione o a seguito di una loro attivazione indotta dalle procedura di raccolta e separazione. La quantità di GB residui negli emocomponenti può, quindi, influenzare notevolmente la sintesi e il rilascio di citochine ad azione infiammatoria. La filtrazione dei GB prima della conservazione, riducendo la quantità di leucociti negli emocomponenti, sicuramente può prevenire questo inconveniente, pur non eliminandolo completamente. Nei concentrati eritrocitari (CE) la conservazione a 4 C riduce il rischio di accumulo di citochine, contrariamente a quanto accade nei concentrati piastrinici conservati a temperatura ambiente. LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol num. 5 settembre-ottobre 2002 ( ) 463

2 R Scocchera et al. Tabella I: livelli medi di citochine proinfiammatorie in CE, CEF, CEFL e controlli* CE pg/ml CEF pg/ml CEFL pg/ml Controlli pg/ml IL-6 9,8 ± (9,8) 0,6 ± (1,1) 1,2 ± (2,9) 1,4 ± (1,8) IL ± (888,2) 114 ± (373) 33,3 ± (53,2) 170 ± (510,3) IL-1β 6,0 ± ( 7,5) 2,97 ± (2,6) 0,77 ± (2,4) 2,8 ± (3,3) TNF-α 0,21 ± (0.82) 0 ± (0) 0,0 ± (0,2) 0,37 ± (1,5) *I valori mostrati nella tabella sono le medie e i valori in parentesi le deviazioni standard CE : Concentrati Eritrocitari CEF : Concentrati Eritrocitari Post Filtrazione CEFL: Concentrati Eritrocitari Post Filtrazione e Lavaggio Nonostante ciò, una presenza rilevante di citochine nei concentrati eritrocitari conservati, è stata ripetutamente osservata 4,5 ma non sempre correlata a manifestazioni cliniche. Nel nostro Centro, in un periodo di circa un anno, sono state osservate reazioni post-trasfusionali non emolitiche in soggetti β-talassemici trasfusi con CE privi di buffy coat e sottoposti a leucodeplezione mediante filtrazione con o senza lavaggio. Nell'ipotesi che tra i meccanismi responsabili delle suddette reazioni trasfusionali si possa individuare nella filtrazione un ruolo citochino-induttore, abbiamo esaminato i livelli plasmatici di IL-1β, IL-6, IL-8 e TNF-α in sacche di CE, buffy coatdeplete, prima della filtrazione e dopo la filtrazione, con o senza lavaggio. Materiali e metodi Campioni I CE sono stati separati da unità di sangue intero prelevato in sacche quadruple e privato del buffy coat. La leucofiltrazione post-storage dei globuli rossi (GR), eseguita mediante filtri Biofil-Fresenius (Medolla, Modena) ed il lavaggio, effettuato dopo centrifugazione e allontanamento del plasma, con soluzioni isotoniche, sono stati condotti in conformità alle Linee-Guida allegate alla Raccomandazione N R (95) 15 del Consiglio d'europa 6. Le sacche di CE sono state conservate fino ad un massimo di 5 giorni prima della filtrazione, e per un tempo massimo di 6 ore dopo la filtrazione/lavaggio. Sono stati esaminati complessivamente: - 35 concentrati eritrocitari prima della filtrazione (CE); - 18 concentrati eritrocitari dopo la filtrazione (CEF); - 31 concentrati eritrocitari dopo la filtrazione e il lavaggio (CEFL). Da ogni singola unità di CE, CEF, e CEFL sono stati prelevati 2-5 ml di sangue al termine del periodo di conservazione. Al fine di valutare un livello base di citochine circolanti in soggetti presumibilmente sani, 42 campioni di sangue intero in Na Eparina sono stati prelevati da donatori, quale popolazione di controllo. Il plasma dei CE, CEF e CEFL e dei campioni di controllo è stato separato mediante centrifugazione a rpm per 12 minuti a 20 C, suddiviso in aliquote da 500 µl e conservato a 25 C fino al momento dell'esecuzione del test. I controlli relativi ai GB residui nei concentrati di emazie filtrate sono regolarmente effettuati in modo casuale e nella percentuale dell'1% di unità, secondo il protocollo standard previsto dalle linee guida per la produzione di emocomponenti 6 mediante citometria a flusso. Il controllo delle proteine residue nelle emazie filtrate e lavate è stato determinato con metodo colorimetrico BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce, Biotechnologies, Rockford, IL, USA). Dosaggio di citochine La determinazione quantitativa delle citochine nei campioni in esame è stata eseguita mediante test immunoenzimatici secondo le istruzioni della ditta produttrice dei kit (Bender Med System, Vienna, Austria). Il valore medio dei limiti di sensibilità nei test impiegati era rispettivamente: IL-6 IL-1ß IL-8 TNF-α 1,4 pg/ml <1 pg/ml <11 pg/ml <5 pg/ml Analisi statistica I risultati sono stati espressi come media dei valori ottenuti ± deviazione standard. I livelli medi di citochine, rilevati nei quattro diversi gruppi di campioni CE, CEF, CEFL e controlli sono stati confrontati mediante l'analisi della varianza ad una via ed il t-test di Student Newman- Keuls. Risultati La conta dei GB nelle unità di emazie filtrate, valutata in 53 unità testate nel corso di un anno, è risultata compresa tra una valore minimo di 1,4x10 3 /unità ed un massimo di 408x10 3 /unità. Il contenuto di proteine residue, valutato in 53 unità di 464

3 Citochine in concentrati eritrocitari Figura 1 - Valori medi di IL-6 in sacche di RBC pre e post filtrazione/lavaggio e nei controlli emazie filtrate e lavate, è risultato compreso in un range tra 0,07 e 0,490 g/u. In Tabella I sono riportati i valori medi dei livelli di IL1- β, IL-8, IL-6 e TNF-α. I dati indicano che nei CE le citochine, ad eccezione del TNF-α, sono presenti in quantità medie più elevate rispetto ai valori riscontrati nei campioni di controllo. Il periodo di conservazione di 1-5 giorni è un intervallo di tempo sufficiente per la sintesi di IL1-β, IL-8 e IL-6. È, infatti, riportato in letteratura che queste citochine raggiungono i loro massimi livelli entro ore dopo stimolazione delle cellule produttrici in coltura, per poi diminuire gradualmente 7-9. Un discorso a parte merita il TNF-α che, avendo un emivita molto breve (18,2 min), presenta un picco di produzione a 2 ore dalla stimolazione, seguito da un rapido declino 10. Nei CEF si riscontra una riduzione delle quantità di tutte le citochine in esame fino a livelli comparabili con quelli riscontrati nella popolazione di controllo. Nei CEFL la riduzione dei livelli di citochine è ancora più marcata. IL-6 Come mostrato nella figura 1, il livello medio di IL-6 nei CE risulta aumentato significativamente rispetto ai controlli (9,8 pg/ml ± 9,8 vs 1,4 pg/ml ± 1,8; p<0,05). Il confronto tra i valori medi riscontrati nei CE e quelli dei CEF e CEFL, mette in evidenza una significativa riduzione del contenuto medio di IL-6 dopo la filtrazione (9,8 pg/ml ± 9,8 vs 0,6 pg/ml ± 1,1; p<0,05) e dopo filtrazione e lavaggio (9,8 pg/ml ± 9,8 vs 1,2 pg/ml ± 2,9 p<0,05). IL-8 I livelli medi di IL-8 nei controlli e nei CE presentano un ampio intervallo di distribuzione dei dati con un range di valori compreso tra pg/ml e pg/ml rispettivamente. È stata rilevata, tuttavia, una differenza significativa tra il contenuto medio di IL-8 riscontrato nei controlli e quello riscontrato nei CE (170 pg/ml ± 510,3 vs 750 pg/ml ± 888,2; p<0,05). La quantità media di IL-8 ritrovata nei CE si riduce significativamente dopo fitrazione (750 pg/ml ± 888,2 vs 114 pg/ml ± 373; p<0,05) e ulteriormente dopo filtrazione lavaggio (750 pg/ml ± 888,2 vs 33,3 pg/ml ± 53,2; p<0,05) (Figura 2). IL-1β Il livello medio di IL-1β nei CE (6 pg/ml ± 7,5) è circa il doppio di quello riscontrato nei controlli (2,8 ± 3,3) e nei CEF (2,97 ± 2,6) tali differenze sono risultate significative (p<0,05). Dopo filtrazione e lavaggio i livelli di questa citochina si riducono a valori minimi (0,77 pg/ml ± 2,4) (Figura 3). Il confronto tra il contenuto medio delle 3 citochine: IL- 6, IL-8, IL1-β, presente nei CEF e quello presente nei CEFL non ha messo in evidenza differenze significative. 465

4 R Scocchera et al. Figura 2 - Valori medi di IL-8 in sacche di RBC pre e post filtrazione/lavaggio e nei controlli Figura 3 - Valori medi di IL1-β in sacche di RBC pre e post filtrazione/lavaggio e nei controlli 466

5 Citochine in concentrati eritrocitari Figura 4 - Valori medi di TNF-α in sacche di RBC pre e post filtrazione/lavaggio e nei controlli TNF-α Nelle unità di GR esaminate e nei controlli non è stata riscontrata una quantità rilevante di TNF-α. (Figura 4). Discussione I risultati dello studio indicano che il contenuto medio di IL-1β, IL-6, IL-8 nelle sacche di CE conservate non oltre 5 giorni, si riduce notevolmente dopo la filtrazione o dopo la filtrazione e il lavaggio, fino a raggiungere livelli comparabili o addirittura inferiori a quelli riscontrati nel campione di controllo. Il contenuto medio di TNF-α, probabilmente a causa della sua breve emivita 10, non mostra variazioni di rilievo. Contrariamente a quanto ipotizzato, la filtrazione non sembra indurre, da parte dei leucociti residui, una sintesi di citochine che possono essere direttamente coinvolte nelle FNHTR. Le reazioni febbrili osservate nei talassemici politrasfusi, dopo infusione di unità di emazie filtrate o di emazie filtrate e lavate, non sembrerebbero, dunque, riconducibili alla presenza di citochine ad azione pro-infiammatoria. È, tuttavia, opportuno fare alcune considerazioni. In primo luogo è necessario ricordare che le citochine, come altre molecole, possono presentarsi in una forma biologicamente attiva e, pertanto, immunologicamente modificate, per cui i test immunoenzimatici impiegati, basati sull'identificazione di siti antigenici ben determinati, potrebbero non essere in grado di rilevare il fattore solubile bersaglio. Inoltre è possibile, come osservato anche da altri Autori 11, che questi mediatori biologici non siano sempre presenti in forma solubile nel plasma, ma che spesso possano circolare legati alla membrana di alcune cellule ematiche 12 o addirittura penetrare all'interno di esse per poi essere rilasciate solo successivamente 13. È stato osservato che IL-8 ha una particolare affinità per l'antigene Duffy presente sulla membrana del globulo rosso 14,15. In tal caso, la quantità di citochina rivelata potrebbe costituire solo una minima parte della quantità realmente presente, non rivelabile in quanto veicolata in forma "mascherata". Metodiche di rivelazione più complesse quali i bio-assay o test per la rilevazione di citochine intracellulari potrebbero fornire ulteriori informazioni utili per una valutazione più attenta del problema La filtrazione degli emocomponenti, comunque, anche se rappresenta il rimedio più utilizzato per eliminare il pericolo di reazioni avverse, non annulla completamente i problemi generati dalla presenza di leucociti e piastrine residui e, di conseguenza, di prodotti del loro metabolismo. Alcuni Autori 16 riferiscono che non esiste una significativa differenza tra incidenza di FNHTR dopo trasfusione di RBC- WBC ridotti e RBC non WBC ridotti. Kluter et al. 17 hanno ritrovato la stessa incidenza di reazioni avverse, prevalentemente di origine allergica, dopo infusione di concentrati piastrinici WBC-ridotti pre- o post-storage (bedside) e, in particolare, hanno attribuito a chemochine 467

6 R Scocchera et al. di derivazione piastrinica la responsabilità delle reazioni osservate. In realtà le chemochine, al pari delle citochine, devono essere considerate ugualmente responsabili delle suddette reazioni. Esse, infatti, si possono accumulare nel plasma degli emocomponenti durante la conservazione di questi e generare effetti indesiderati: alte concentrazioni di vascular endothelial growth factor (VEGF), e plasminogen activator inhibitor (PAI)-1 sono state ritrovate nel plasma di concentrati piastrinici durante la loro preparazione e conservazione, a seguito di una probabile distruzione di elementi piastrinici 18. Platetelet factor 4 (PF4), β-thromboglobulin (β-tg) e regulated on activation T expressed and secreted (RANTES) sono rilasciate dalle piastrine attivate in quantità notevoli durante la conservazione di concentrati piastrinici ed alla loro presenza è stato attribuito il fallimento di molteplici eventi trasfusionali 19. Inoltre, è questione dibattuta il ruolo rivestito dalla filtrazione nei confronti delle piastrine: secondo alcuni Autori sembra che essa possa attivare o comunque danneggiare le piastrine anche in relazione alle caratteristiche dei filtri usati 20,21. Altri studi hanno mostrato che la filtrazione non ha significativi effetti sull'attivazione delle piastrine e sul rilascio dei loro granuli Comunque, filtrazione e conservazione sono entrambe imputate come causa primaria dell'attivazione o della lisi delle piastrine mediante induzione, rispettivamente, del rilascio attivo o passivo di chemochine. È da tenere presente la possibilità che gli effetti indesiderati delle reazioni trasfusionali non siano dovuti all'accumulo di una sola sostanza bioattiva di origine piastrinica o leucocitaria, ma ad una miscela di queste, con conseguente sinergismo di varie componenti cellulari e di mediatori chimici da esse prodotti. Nel nostro studio, l'incremento del livello medio di citochine riscontrato nei CE rispetto ai controlli, indica che la leucoriduzione introdotta prima della conservazione, e non al momento dell'infusione dell'emocomponente, potrebbe essere una procedura idonea per prevenire l'accumulo di molecole prodotte e rilasciate sia dai GB che da piastrine all'interno di emocomponenti conservati. Inoltre, un controllo random dei valori di citochine proinfiammatorie e di chemochine, in unità di emazie o di piastrine, potrebbe contribuire a migliorare la qualità dei prodotti trasfusionali e fornire un valore aggiunto ai dati raccolti nei protocolli di emovigilanza delle reazioni posttrasfusionali. Alcuni Autori 24 identificano IL-8, RANTES e TGF-1β come utili indicatori per la validazione di concentrati eritrocitari. È, infine, da ricordare che le citochine generate in seguito a reazione post-trasfusionale, oltre che di provenienza esogena (veicolate, quindi, all'interno dell'emocomponente trasfuso), possono essere anche di provenienza endogena, prodotte, cioè, all'interno dell'organismo ricevente. In particolare, nei soggetti politrasfusi, un aumento di citochine circolanti potrebbe essere correlato con l'attivazione del sistema immune già osservato in questi soggetti. Lo studio intrapreso è stato completato con un altro 25, in cui l'attenzione è stata focalizzata sui livelli di citochine nel siero di pazienti ripetutamente sottoposti a trasfusione, con particolare riferimento ai soggetti che mostrano reazione post-trasfusionale non di tipo emolitico. Riassunto Nonostante le procedure di filtrazione e lavaggio dei concentrati eritrocitari, occasionalmente si verificano in soggetti politrasfusi reazioni trasfusionali febbrili non emolitiche. Tali reazioni possono essere mediate dalla presenza di citochine pro-infiammatorie quali l'il-1β, l'il-6, l'il-8 e il TNF-α. La leucodeplezione può essere considerata un meccanismo di innesco per la sintesi di tali citochine da parte dei globuli bianchi residui. Il presente studio si propone di verificare questa ipotesi e, a tale scopo, sono stati determinati i livelli di IL-1β, IL-6, IL-8 e TNF-α in unità di globuli rossi concentrati, buffy coat depleti, prima e dopo filtrazione o dopo filtrazione e lavaggio. I risultati ottenuti sono stati, inoltre, confrontati con una popolazione di controllo. Lo studio ha messo in evidenza che nelle unità di globuli rossi conservate fini a 5 giorni prima della filtrazione, si verifica un aumento, rispetto ai controlli, dei valori di tutte le citochine esaminate, eccetto il TNF-α. Nelle unità di globuli rossi filtrati con o senza lavaggio, il contenuto di citochine si riduce a livelli paragonabili o inferiori a quelli riscontrati nei controlli. Nonostante questi risultati, nel corso del nostro studio si sono verificate FNHTR in pazienti β-talassemici politrasfusi, dopo infusione di globuli rossi filtrati e di globuli rossi filtrati e lavati. I risultati dello studio suggeriscono che la causa delle FNHTR osservate non sembrerebbe da attribuire alla procedura di filtrazione. Ulteriori studi potranno consentire di individuare altri fattori responsabili di questi incidenti trasfusionali. 468

7 Citochine in concentrati eritrocitari Ringraziamenti Gli Autori ringraziano la Sig.ra Antonella Aliberti per il prezioso supporto tecnico fornito nell'allestimento dei grafici. Bibliografia 1) Muylle L: The role of cytokines in blood transfusion reactions. Blood Reviews, 9, 77, ) Muylle L, Wouters E, Peetermans ME: Febrile reactions to platelet transfusion: the effect of increased interleukin 6 levels in concentrates prepared by the platelet-rich plasma method. Transfusion, 36, 886, ) Heddle NM, Klama LN, Griffith L et al.: A prospective study to identify the risk factor associated with acute reactions to platelet and red cell transfusion. Transfusion, 33, 794, ) Shanwell A, Kristiansson M, Remberg M, Ringden O: Generation of cytokines in red cell concentrates during storage is prevented by prestorage white cell reduction. Transfusion, 37, 678, ) Stack G, Baril L, Napychank P, Snyder EL: Cytokine generation in stored, white cell reduced, and bacterially contaminated units of red cells. Transfusion, 35, 199, ) Raccomandazione n R(95)15 del Consiglio d'europa sulla Preparazione, Uso e Garanzia di Qualità degli Emocomponenti. Il Servizio Trasfusionale, 28, 1, ) Shindler R, Mancilla J, Endres S et al.: Correlations and interactions in the production of Interleukin-6 (IL-6), IL-1, and Tumor necrosis Factor (TNF) in human blood mononuclear cells: IL-6 suppresses IL-1 and TNF. Blood, 75, 40, ) Hazuda DJ, LeeJC, Joung PR: The kinetics of interleukin 1 secretion from activated monocytes. Differences between interleukin 1 alpha and interleukin 1 beta. J Biol Chem, 263, 8473, ) DeForge LE, Remick DG: Kinetics of TNF, IL-6, and IL-8 gene expression in LPS-stimulated human whole blood Biochem Biophys Res Commun, 174, 18, ) Oliver JC, Bland LA, Oettinger CW et al.: Citokine kinetics in an in vitro whole blood model following an endotoxin challenge. Lymphokine Cytokine Res, 12, 115, ) Borzini P: Le citochine in medicina trasfusionale. La Trasf del Sangue, 43, 131, ) Cavaillon JM, Munoz C, Fitting C et al.: Circulating cytokines: the tip of the iceberg. Circ Shock, 38, 145, ) Christelle M, Fitting C, Cheval et al.: Presence of high levels of leukocyte-associated interleukin-8 upon cell activation and in patients with sepsis syndrome. Infect Immun, 65, 865, ) Horuk R, Chitnis CE, Darbonne WC et al.: A receptor for the malarian parasite Plasmodium vivax: the erithrocyte chemokine receptor. Science, 261, 1182, ) Seghatchian J, Wadhwa M, Dilger P et al.: Generation of cytokines in stored red blood concentrates: the role of the Duffy antigen receptor. Vox Sang, 74(S1), ) Uhlmann EJ, Isgriggs E, Wallhermfechtel M et al.: Prestorage universal WBC reduction of RBC unit does not affect the incidence of transfusion reactions. Transfusion, 41, 997, ) Kluter H, Bubel S, Kirkner H et al.: Febrile and allergic transfusion reactions after the transfusion of white cell-poor platelet preparations. Transfusion, 39, 1179, ) Edvarsen L, Taaning E, Dreier B et al.: Extracellular accumulation of bioactive substances during preparation and storage of various platelet concentrates. Am J Hematol, 67, 157, ) Boehlen F, Clemetson KJ: Platelet chemokines and their receptors: what is their relevance to platelet storage and transfusion practice? Transfus Med, 11, 403, ) Krailadsiri P, Seghacthian J: Negatively charged leucocyte filter significantly enhances kallikrein and thrombine-like activities of platelet concentrates Thrombosis Research, 83, ) Colman RW, Scott CF, Brandwein H et al.: More on kininogen measurements in platelet concentrates that are white cell (WBC) reduced with WBC-reduction filters. Transfusion, 36, 939, ) Aye MT, Palmer DS, Giulivi A et al.: Effect of filtration of platelet concentrates on the accumulation of cytokines and platelet release factors during storage. Transfusion, 35, 117, ) Muylle L, Peetermans ME: Effect of prestorage leukocyte removal on the cytokine levels in stored platelet concentrates. Vox Sang, 66, 14, ) Seghatchian J, Krailadsiri P, Dilger P et al.: Cytokines as quality indicators of leucoreduced red cell concentrates Transfus Apheresis Sci, 26, 43, ) Matteocci A, Scocchera R, Cianciulli P et al.: Reazioni trasfusionali non emolitiche e citochine in pazienti β- talassemici. La Trasf del Sangue, 47, 470,