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1 LABORATORIO 2: ESTRAZIONE ED ANALISI ELETTROFORETICA DI DNA GENOMICO Come fare? Seguiamo 3 semplici passaggi: Detergente enzimi (es. preparato per ammorbidire la carne) Alcol Cooome?? E' così facile?? Vediamo... 1) E' necessario avere qualcosa che contiene DNA. Poichè il DNA è alla base della vita, ogni organismo vivente contiene DNA In questo esempio si possono usare dei piselli Ma in cucina si possono prendere molti altri materiali come fonte di DNA: spinaci fegato di pollo cipolle broccoli... Ora la parte pratica e divertente. Mettere in un frullatore: il materiale fonte di DNA (100 g di piselli rigonfiati in acqua, circa 100 ml) un pochino di sale (circa metà di un cucchiaio da te') acqua calda in proporzione circa doppia rispetto al volume del materiale fonte di DNA (circa 200ml)

2 secondi Frullare alla massima velocità per Il frullatore separa le cellule della sospensione di piselli in maniera da avere un omogenato utilizzabile per le successive fasi dell'esperimento. Ed ora... in tre semplici passaggi Filtriamo la nostra zuppetta di piselli usando un colino e raccogliendo il tutto in un contenitore di plastica, possibilmente graduato per misurare il volume Quanta zuppetta abbiamo? Aggiungiamo circa 1/6 del volume di detergente liquido e mescoliamo vigorosamente. Lasciamo riposare la miscela per 5-10 minuti. Versiamo la miscela in delle provette o in piccoli contenitori di vetro, riempiendoli fino a circa 1/3. Potete usare un qualunque detergente da cucina.

3 danneggiare il DNA. 2. Aggiungiamo adesso un pizzico di enzimi a ciascuna provetta e mescoliamo leggermente, ma non troppo violentemente per non Potete usare a questo scopo la schifezza Americana (preparato per ammorbidire la carne), oppure potreste provare con del succo di ananas o con la soluzione che serve per pulire le lenti a contatto. 3. Piegate ora la vostra provetta e aggiungete lentamente una soluzione alcolica (70-95% di alcol isopropilico o alcol etilico) facendola colare sul bordo della provetta, in maniera che formi uno strato sulla nostra zuppetta. Dovete aggiungerne fino ad avere circa lo stesso volume della sospensione di cellule frullate che avete nella provetta A questo punto il DNA tenderà a salire dalla soluzione acquosa alla fase alcolica. Usate un bastoncino di legno (esempio uno stuzzicadenti oppure una bacchettina di vetro per raccogliere il DNA semplicemente creando un piccolo vortice nella provetta.

4 Perchè stiamo facendo questo? Utilizzo dei detergenti e degli enzimi Le cellule che noi abbiamo separato sono ancora intatte sono delimitate da una membrana cellulare. Il DNA è a sua volta contenuto in una struttura membranosa, quindi per estrarlo abbiamo bisogno di rompere queste membrane. I detergenti ed i grassi hanno in comune la struttura molecolare, costituita da una testa idrofilica ed una coda idrofobica. Le molecole di saponi e di grassi tendono a formare delle micelle, con le teste rivolte verso l'ambiente acquoso e le code riunite a formare una struttura idrofoba. Se un detergente viene a trovarsi vicino ad un grasso, è in grado di inglobare la molecola di grasso nella micella.

5 Dopo l'aggiunta del detergente, la domanda che ci siamo posti era: cosa è rimasto nella nostra zuppetta? A questo punto le cellule e le membrane nucleari sono state rotte, così come quelle degli altri organelli cellulari (mitocondri, cloroplasti). Quello che rimane è quindi: proteine carboidrati (zuccheri) DNA Il DNA nel nucleo è ricoperto da proteine, ripiegato ed impacchettato. Lo scopo degli enzimi (proteasi) è quello di tagliare le proteine e liberare il DNA. Come si arriva a questa "magia"? L'alcol è meno denso dell'acqua così tende a galleggiare sopra lo strato acquoso. Si formano così due strati separati con caratteristiche diverse. I grassi, le proteine ed il DNA devono quindi decidere dove distribuirsi. La scelta è dettata da motivi di preferenza per l'ambiente. In questo caso le proteine ed i grassi rimangono nella fase acquosa, mentre il DNA si sposta nella fase contenente l'alcol. Complimenti! A questo punto siete riusciti ad effettuare una estrazione di DNA totale.

6 Estrazione del DNA dalla banana - Handout L isolamento del DNA da cellule è il primo passaggio importante nell analisi del DNA. Questo protocollo è utilizzato per estrarre grandi quantità di DNA dalle cipolle, ma protocolli simili si possono utilizzare per isolare il DNA da altre fonti cellulari, come ad esempio un campione di sangue. In questa procedura vedrete come si possono utilizzare sostanze di uso comune in laboratorio per purificare il DNA. Procedura 1. Aggiungere pezzetti di banana fino al livello di 10 ml in un tubo da 50. Aggiungere 25 ml di soluzione di lisi. Mescolare bene girando il tubo diverse volte. La soluzione di lisi contiene: sodio lauril solfato, sodio cloruro, sodio citrato, e EtileneDiamminoTetraAcetato (EDTA).In alternativa si può utilizzare una miscela contenente: 3%NaCl, 10 % detergente per stoviglie. 2. Incubare la miscela per 10 minuti a 60 C. 3. Raffreddare la miscela immergendo nel ghiaccio il tubo. Mantenere in ghiaccio finché non risulta freddo al tatto. 4. Mettere nel frullatore ed omogeneizzare per 30 secondi a bassa velocità. Apparirà della schiuma. 5. Mettere la miscela frullata in un beaker da 500 ml o 1000 ml. Trasferire il contenitore in un bagno di ghiaccio per raffreddare e mantenere in ghiaccio fino a completo raffreddamento. Si dovrebbe formare una separazione tra la schiuma e il liquido sottostante. 6. Centrifugare la miscela a rpm per 10 minuti. Dopo la centrifugazione con una pasteur recuperare il surnatante. 7. Dividere il liquido filtrato in aliquote da 5 ml in provette di vetro da 10 ml. Ciascun gruppo dovrebbe avere un tubo con il filtrato. 8. Aggiungere un volume di etanolo alla miscela. Tappare bene il tubo e mescolare gentilmente girando il tubo più volte, finchè non compare una massa gelatinosa e bianchiccia. Questo è il DNA della banana. 9. Estrarre il DNA ruotando una pasteur in una sola direzione, per far arrotolare il DNA intorno ad esso. Scuotere poi la pasteur (gentilmente) in una provetta da 2 ml contenente 1,5 ml di 50% etanolo. 10. Trasferire il contenuto in una provetta da 2 ml (tipo eppendorf) e centrifugare a rpm per 5 minuti in una centrifuga da tavolo. 11. Eliminare il liquido rivoltando rapidamente la provettina. Si dovrebbe vedere un precipitato. Far evaporare bene l etanolo immergendo la provetta nel bagnetto a 60 C per 10 minuti con il tappo aperto (le provette verranno inserite in un galleggiante appositamente preparato). 12. Risospendere il precipitato in un tampone Tris/HCl 20 mm ph 7.4 ( µl). Diluire poi 1:100 in una cuvetta da spettrofotometria in quarzo ed effettuare la lettura dell assorbanza a 260 nm. Calcolare la concentrazione del DNA. 13. Preparare un gel di agarosio al 1% in TBE. Caricare nel pozzetto il DNA estratto dalla banana. Correre il gel ed osservare il campione al trans-illuminatore UV (questa parte verrà effettuata dal personale di laboratorio).

7 Determinazione della concentrazione di DNA in soluzione attraverso metodi spettrofotometrici µ µ

8 ELETTROFORESI DNA GENOMICO Composizione del Gel: 0.5 % AGAROSIO 100 ml TAE 1X 6 µl Etidio Bromuro [stock 10 mg/ml] Composizione del CAMPIONE da caricare su gel: VOLUME: 30 µl/pz (+ 5 µl BBF) Concentrazione DNA max 3 µg/pz Corrente V costante durante tutta la corsa (circa 1 ora) Dopo la corsa rivelare sotto irraggiamento UV Composizione TAE Buffer (10X) Il tampone Tris-Acetato-EDTA è usato per l elettroforesi degli acidi nucleici. Tris (0.4 M) EDTA-Na 2 -salt (0.01 M) Acetic acid (0.2 M) g/l (PM ) 3.72 g/l (PM 372.2) g/l (99.7%; d=1.049; PM M)

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