Le colture cellulari. L isolamento virale: aspetti innovativi. Le colture cellulari. Le colture cellulari. A.Azzi
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- Placido Renzi
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1 Le Le colture colture cellulari cellulari L isolamento virale: aspetti innovativi A.Azzi Colture primarie Colture primarie Linee continue In monostrato In sospensione Primo passaggio di cellule ottenute dalla disaggregazione di un tessuto espiantato Rappresentative del tessuto d origine Laboriose da preparare Molto variabili Firenze, 19/11/2004 Le colture cellulari Le colture cellulari Colture primarie Linee continue Linee continue In monostrato In sospensione linee di cellule trasformate e immortalizzate per mutazione spontanea o indotta da carcinogeni chimici radiazioni ionizzanti infezione in vitro con agenti immortalizzanti. Linee subcontinue: possono essere subcoltivate per un limitato numero di passaggi dopo la coltura primaria, prime del fenomeno di senescenza mantengono il fenotipo normale Colture primarie Le colture cellulari Linee continue In monostrato In sospensione Aderenti al supporto Es HeLa, Hep-2, KB, MRC 5 WI38.. 1
2 Rene di coniglio Fibroblasti di polmone umano Hep-2 Fornitori di colture cellulari I terreni per le colture cellulari ATCC American Type Culture Collection ECACC European Collection of (Animal) Cell Culture DSMZ Deutsche Sammlung vov Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Centro Substrati Cellulari-Istituto Zooprofilattico di Brescia Terreni di crescita + siero bovino fetale al 10 % Terreni di mantenimento + siero bovino fetale al 2 % Terreni serum-free Principali componenti Sol. salina bilanciata Sistemi tampone (bicarbonato/co 2, Hepes) Carboidrati o glutamina Aminoacidi Vitamine Ormoni e fattori di crescita Proteine e peptidi Acidi grassi e lipidi Fattori accessori (tracce di elementi, nucleotidi) Antibiotici??? 2
3 La coltura tradizionale Asportazione del terreno Lavaggi Inoculazione del campione (pre-trattato) Adsorbimento (incubazione x 1 ora a 37 C) Asportazione dell inoculo Aggiunta del terreno di mantenimento Incubazione per giorni, fino a comparsa dell ECP Identificazione del virus e tipizzazione Limite dei sistemi tradizionali di isolamento Esperienza Shell vial Tempo Necessità di mantenere diverse linee Inoculazione in shell vials (Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital) 3
4 Linee cellulari per l isolamento di virus Alcune linee particolari HCE (human corneal epithelial): da coltura primaria da donatore cornea cellule immortalizzate con vettore ricombinante SV 40- adenovirus per HSV-1 Linea B95-8: linea linfoblastoide trasformata da EBV Per virus del morbillo Valutazione della linea Inoculazione campioni (corneal scraping) in shell vials di HCE e Vero Incubazione ore IF con sieri policlonalianti-hsv-1 Valutazione qualitativa = presenza di cellule con IF specifica Valutazione quantitativa = n foci IF in ciascun preparato (shell vial) Risultato HCE monostrato Vero: 4 pos /17 HCE: 10 pos /17 HCE cells ECP ECP in shell vial 4
5 IF su HCE infettate con HSV 1 Colture cellulari Transgenic cell lines for detection of animal viruses Olivo 1996 Espressione di recettori virali Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of poliovirus in vitro. Pipkin et al 1993 Cellule transgeniche che favoriscono l individuazione del virus Rapid detection of HSV with an enzyme-linked virus inducible system (ELVIS) employng a genetically modified cell line Profitt and Schindler
6 Isolamento dei virus respiratori Influenza A Influenza B Virus respiratorio sinciziale V.parainfluenzale 1 V.parainfluenzale 2 V.parainfluenzale 3 Adenovirus Isolamento di virus respiratori Necessità di allestire colture con diverse linee cellulari Coltura tradizionale Hep-2, LLC-MK2, MDCK su vetrino Inoculazione Centrifugazione a 700 x g Incubazione per ore e ore Centrifugation-enhanced shell vial culture Coltura simultanea di più linee cellulari Hep-2, LLC-MK2, MDCK :sospensione mista contenente cellule di ciascuna linea /vetrino Inoculazione Incubazione per 48 ore IF con pool monoclonali 1 R-Mix e R-Mix shell vial Coltura simultanea di più linee cellulari 2 IF 7 diversi monoclonali: Flu A, Flu B, RSV, Para 1,Para 2, Para 3, Ad R-MIX Shell vial: cellule di polmone di visone (ceppo Mv1Lu) e cellule di adenocarcinoma umano (A549) Inoculazione Centrifugazione (1 ora a 700x g) Incubazione per 24 ore - 48ore IF Isolamento dei virus respiratori La coltura tradizionale a tempi lunghi rimane il test di riferimento IFD < CM < CT Monostrati di cellule criopreservati HELVIS R-mix Stabili a -80 C per oltre 4 mesi 6
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