Tessuti biologici e approcci di Tissue Engineering. Docente: Prof. Alessandro Sannino

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1 Tessuti biologici e approcci di Tissue Engineering Docente: Prof Alessandro Sannino

2 1Definizione di tessuto biologico 2Strategie dell ingegneria dei tessuti 3Composizione della matrice extracellulare 4Tipi di tessuto 5Criteri di design dello scaffold

3 Un tessuto è una struttura biologica costituita da cellule dello stesso tipo - Cellule dello stesso fenotipo (ie, che esprimono gli stessi geni) - Aggregazione di cellule morfologicamente simili e annessa matrice extracellulare che svolgono una o più funzioni specifiche nell organismo - Esistono 4 tipi di tessuti: tessuto muscolare, nervoso, epiteliale e connettivo - Un organo è una struttura costituita da 2 o più tessuti

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5 TISSUE ENGINEERING TRIAD* MATRICE (SCAFFOLD) - Biomateriali porosi e riassorbibili - Può regolare le funzioni cellulari prima del suo riassorbimento CELLULE REGOLATORI - Chimici: eg citochine (fattori di crescita) - Meccanici: eg carico meccanico e condizioni di flusso in vitro (bioreattori) *Usati individualmente o in combinazione tra loro, ed in genere con una matrice

6 Il tessuto deve essere prodotto in vitro o in vivo? Che scaffold si deve usare? - Materiale, struttura porosa, velocità di riassorbimento, proprietà meccaniche? - Come deve essere prodotto? Quali cellule devono essere usate (se necessarie)? - Sorgente cellulare? - Sotto quali condizioni le cellule possono essere espanse in vitro senza che perdano il loro fenotipo? Quali regolatori sono richiesti per stimolare la proliferazione cellulare e la sintesi di matrice extracellulare e/o facilitare la differenziazione di cellule staminali?

7 Quali tessuti sono in grado di rigenerare spontaneamente? Tessuti connettivi Ossa Cartilagine articolare, legamento, tendine, disco intervertebrale, altri Tessuti epiteliali (eg, epidermide) Tessuti muscolari Muscolo liscio Muscolo striato Tessuto nervoso Sì No

8 Limitata vascolarizzazione di difetti estesi - eg l osso non rigenera nella parte centrale di grandi difetti Collasso di tessuti circostanti nel difetto - eg difetti periodontali Eccessive deformazioni meccaniche nel tessuto riparativo - eg fratture instabili

9 1) prima di essere riassorbito, agisce come matrice per l adesione cellulare al fine di regolare alcuni processi/funzioni cellulari (eg mitosi, sintesi, migrazione, contrazione) delle cellule in vivo o di cellule seminate in vitro 2) rinforza il difetto, mantenendone la forma e prevenendo la distorsione del tessuto circostante 3) funge da barriera per prevenire l ingresso di tessuto circostante nel difetto 4) funge da mezzo per la veicolazione di cellule, fattori di crescita e geni

10 Polimeri sintetici - acido polilattico e acido poliglicolico - policarbonati - polianidridi - poli(propilen fumarato) - polietilenossido e polipropilenossido - altri Polimeri naturali - collagene Componenti della gelatina; reticolato o non reticolato ECM naturale - fibrina - acido ialuronico - cellulosa il più abbondante polimero naturale; meccanismo di assorbimento in vivo? - altri (eg chitosano, alginato, agarosio)

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12 Acido Ialuronico Condroitina Solfato Cheratansolfato Dermatansolfato Nei tessuti essi sono legati a proteine extracellulari per formare i cosiddetti proteoglicani, enormi aggregati di natura covalente e non covalente, dei quali i polisaccaridi spesso rappresentano oltre il 95% del complesso

13 Sono costituiti da una core protein, a cui si legano covalentemente piccole molecole di GAGs (condroitinsolfato, dermatansolfato, eparansolfato, cheratansolfato) Ciascuno di essi si lega non covalentemente (via link protein) a catene molto lunghe di ialuronato ad intervalli di circa 40 nm formando aggregati di proteoglicani Elevata densità di cariche negative dei GAGs VISCOSITA VISCOELASTICITA

14 Dal punto di vista chimico, le proteine sono poliammidi composte da unità monomeriche rappresentate da circa 20 diversi amminoacidi Nelle proteine, gli amminoacidi sono legati tra di loro da legami ammidici derivanti dalla reazione di condensazione dei gruppi carbossilici, detti anche legami peptidici

15 Esse formano un reticolo di legami trasversali che conferisce consistenza e resistenza a tutta la ECM Fibrille ( nm) Fibre (1-12 µm) Striature orizzontali

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18 Le fibre dell elastina sono intrecciate con le fibrille di collagene dotate di scarsa elasticità che limitano l entità della deformazione, evitando così la lacerazione dei tessuti Le fibre di elastina, sono più sottili delle fibre di collagene, non sono organizzate in fasci ma in modo da formare estesi reticoli

19 Modulo elastico (MPa) Carico a rottura (MPa) Allungamento a rottura (%) Limite elastico (%)

20 Cellule contigue a stretto contatto Ridotta sostanza extracellulare amorfa Interstizi intercellulari ( nm) Epitelio semplice pavimentoso: capsula di Bowmann (rene) Azione protettiva (cute) Assorbimento molecolare (rene, intestino) Secrezione (ghiandole) Epitelio cubico: Tubuli renali

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25 Barriera fisica che si oppone alla perdita di acqua ed elettroliti dall organismo; Termoregolazione con l aiuto di ghiandole sudoripare e di vasi sanguigni; Trasduzione di segnali (es pressione, temperatura) dall ambiente esterno Elevata estensibilità per piccole sollecitazioni

26 Skeletal: Striated and voluntary Cardiac: Striated and involuntary Smooth: Nonstriated and involuntary

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28 La denominazione striato deriva dal fatto che le fibre mostrano all'osservazione al microscopio una regolare striatura trasversale

29 Miosina: Filamento spesso (10-12 nm) Actina: Filamento sottile (6-7 nm) TEORIA DEI FILAMENTI SCORREVOLI (Huxley 1954) Lo scorrimento è dovuto alla formazione e alla rottura di ponti tra actina e miosina a seguito di processi biochimici Le proiezioni sulle fibre di miosina si attaccano al sito attivo di actina e lo tirano verso l interno del sarcomero Dopodiché la miosina lo rilascia e si attacca al prossimo sito (power stroke) per ripetere il ciclo

30 fibre muscolari striate trasversalmente Elementi cellulari distinti mononucleati Altamente vascolarizzato Capacità di contrarsi spontaneamente, in maniera autoritimica Incapacità di rigenerazione del tessuto

31 FIBROCELLULE muscoli lisci multiunità: (arterie, quelli ciliari dell'occhio, l'iride e i muscoli piliferi) Attività stimolata da impulsi del sistema nervoso ANS (Sistema Nervoso Vegetativo ) muscoli lisci monounità: (viscere) Attività miogenica (spontanea) Viscere (Tonaca muscolare dell intestino, dello stomaco, etc) Pareti dei vasi sanguigni Ghiandole (surrenali, salivari, etc)

32 Lunghezza dei filamenti di actina e miosina più lunghi Disordine strutturale

33 Cellule separate Abbondante matrice extracellulare Interstizi intercellulari ( nm) Collegamento tra le cellule che formano i tessuti ed i diversi organi Sostegno meccanico

34 Cellule (osteoblasti, osteoclasti, osteociti) ECM mineralizzata

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36 OSTEONI unità strutturali dell osso compatto di forma cilindrica formati da 4 a 20 lamelle organizzate in anelli concentrici al cui centro passa il canale di Havers (diametro µm) Lo spazio compreso tra osteoni è riempito da strati di lamelle ossee parallele (sistemi interstiziali) CANALI DI VOLKMANN Canali di calibro inferiore che attraversano l osso obliquamente o perpendicolarmente al suo asse e provvedono alla nutrizione ed all innervamento del tessuto osseo PERIOSTIO/ENDOSTIO sottili strati di tessuto connettivo non mineralizzato che ricoprono la superficie esterna ed interna delle ossa lunghe, dotata di potere osteogenico

37 Fraz volumetrica ( mm 3 /mm 3 ) 090 ( ) 020 ( ) Superficie/Volume ( mm 2 /mm 3 ) Volume totale ( mm 3 ) 14 x x 10 6 Superficie interna ( mm 2 ) 35 x x 10 6

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39 OSTEOPROGENITRICI: dotate di capacità proliferative producono fattori di crescita e differenziamento che regolano la produzione del tessuto OSTEOBLASTI: regolano la formazione di matrice ossea (collagene e proteoglicani) e regolano la deposizione della parte nonchè la deposizione della parte minerale OSTEOCLASTI: cellule giganti polinucleate, che svolgono un ruolo primario nei meccanismi di riassorbimento della matrice ossea finemente ragolata da ormoni specifici (parataormone, calcitonina) OSTEOCITI: di forma lenticolare appiattita, partecipa alla regolazione omeostatica (Ca 2+ ) attraverso osteolisi OSTEOBLASTI OSTEOCLASTI

40 Rinnovo del tessuto osseo primario, attraverso la formazione di tessuto osseo secondario (osso corticale osteonico), I) attivazione ed azione di osteoclasti (40 µm/giorno) II) vascolarizzazione III) osteoblasti cambiano aspetto e funzioni, trasformandosi in osteociti IV) Mineralizzazione del nuovo tessuto in formazione

41 FASE SOLIDA Cellule - 5% (condrociti) Collagene - 40% Proteoglicani - 35% Acido ialuronico Glicoproteine (osteocalcina, fibronectina) FASE LIQUIDA Acqua Elettroliti Colore bianco bluastro Disposizione random delle fibre Naso Laringe Trachea Bronchi Colore biancastro Fibre altamente elastiche che consentono piegamenti di 90 dei tessuti senza rottura Padiglione auricolare Epiglottide Trachea Colore giallastro Fibre altamente orientate Non vascolarizzato Menisco articolare Dischi intervertebrali Inserzioni tendinee Legamenti

42 Contenuto di H2O (wet) 75% Contenuto organico (wet) 20% Contenuto organico (dry) 90% Modulo a trazione (MPa) 1-10 Resistenza compressione (MPa) 1-5 Coeffi d attrito <001 Spessore film fluido 05 micron

43 Fibre di collagene parallele alla superficie Fibre di collagene orientate random Fibre di collagene perpendicolari alla base

44 Forte anisotropia e disomogeneità dei tessuti: influenza delle percentuali di fase organica ed inorganica sulle proprietà meccaniche in funzione della profondità e della collocazione Proprietà a trazione: a) Dipendenza dal contenuto di collagene b) Indipendenza dal contenuto di proteoglicani c) Dipendenza dalla orientazione delle fibre di collagene Proprietà a compressione: a) Dipendenza dal contenuto di proteoglicani b) Indipendenza dal contenuto di collagene c) Dipendenza dalla profondità Comportamento in condizioni dinamiche: Compressione confinata Studio della permeabilità Creep Stress Relaxation

45 Found in brain, spinal cord and nerves Ability to produce action potentials Cells Nerve cells or neurons Consist of dendrites, cell body, axons Consist of multipolar, bipolar, unipolar Neuroglia or support cells

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50 Proprietà dello scaffold Composizione chimica Struttura dei pori / architettura Velocità di degradazione / riassorbimento Proprietà meccaniche Scaffold biomimetici: uno scaffold ideale deve mimare la struttura e/o le proprietà della matrice extracellulare (ECM) del tessuto che si vuole rigenerare

51 Composizione chimica Lo scaffold può regolare le funzioni cellulari attraverso la sua composizione chimica - Adesione cellulare: può contenere domini che legano le integrine oppure può adsorbire proteine di adesione - Regola le funzioni cellulari mediate da integrine La velocità di riassorbimento e le proprietà meccaniche dipendono dalla composizione chimica

52 Struttura porosa / architettura Lo scaffold può regolare le funzioni cellulari attraverso la sua architettura Percentuale di porosità - Numero di cellule che possono aderire - Resistenza meccanica del materiale Diametro dei pori - Area superficiale e numero di cellule aderite - Infiltrazione cellulare nei pori Interconnettività dei pori Orientazione dei pori - Può direzionare la migrazione e la biosintesi La forma e le dimensioni devono rispecchiare il difetto

53 Struttura porosa

54 Velocità di degradazione Troppo rapida non consente i processi rigenerativi Troppo lenta interferisce col remodeling Per polimeri sintetici viene regolata miscelando polimeri con diverse degradation rate (eg PLA e PGA) Per polimeri naturali viene regolata da trattamenti di reticolazione

55 Proprietà meccaniche Resistenza sufficiente a garantire l integrità dello scaffold fino a quando le cellule sintetizzano la ECM Modulo di rigidezza sufficientemente alto per resistere alle forze di compressione che farebbero collassare la struttura porosa Per polimeri sintetici sono regolate miscelando polimeri con diverse proprietà meccaniche (eg PLA e PGA) o creando materiali compositi (con fibre, particelle) Per polimeri naturali sono regolate da trattamenti di reticolazione, oppure tramite rinforzo con fasi minerali o polimeri sintetici