Analisi spettrofotometrica dell Albumina di siero bovino: applicazione della legge di Lambert-Beer:

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1 Analisi spettrofotometrica dell Albumina di siero bovino: applicazione della legge di Lambert-Beer: Introduzione: La spettrofotometria o fotometria è una tecnica analitica che sfrutta il fenomeno dell'assorbimento di radiazioni elettromagnetiche da parte delle soluzioni. Questo tipo di analisi è particolarmente utile: a) nell'identificazione qualitativa di sostanze (in special modo nella regione dell'infrarosso); b) nella determinazione quantitativa di sostanze in soluzioni diluite. Ogni sostanza ha una caratteristica "carta d'identità", detta spettro di assorbimento, l'entità dell'assorbimento dipende dalla concentrazione e dallo spessore di soluzione attraversato. In questa tecnica la quantità di luce che un campione assorbe ad una data lunghezza d'onda (in nm) viene misurata ed impiegata per determinare la concentrazione di una specie molecolare nel campione. Se indichiamo con I0 l'intensità di un raggio incidente e con I l'intensità del raggio trasmesso da uno spessore d di una soluzione con concentrazione c, si definisce come trasmittanza (T) il rapporto: T = I/I0 Il logaritmo negativo della T è detto assorbanza (A o Abs) (o densità ottica o estinzione): A= log (I0/I) = - log T Abs di un campione può essere messa in relazione alla concentrazione della molecola assorbente attraverso l'utilizzo della legge di Lambert-Beer: A = log (I0/I) = c d Dove: Abs = quantità di luce assorbita dal campione ad una determinata lunghezza d onda. In genere verrà scelta una lunghezza d'onda in modo che l'assorbimento sia massimo. Questo può variare tra 0.0 e 2.0. La lettura è attendibile per valori di Abs sotto 1.2 (valori ancora più accurati

2 tra Abs). Inoltre, la lettura deve essere al centro di un picco 'largo' per motivi di precisione, in modo che piccole variazioni di lunghezza d'onda comportino errori minimi sulla misura dell'assorbanza. c = concentrazione della molecola assorbente in moli Litro -1 (M); d = lunghezza del cammino ottico di solito 1 cm; = coefficiente di estinzione molare. Questo valore è una costante per una sostanza in un dato solvente ad una specifica lunghezza d'onda. Corrisponde all Abs di una soluzione 1 M della sostanza. Si esprime in Litro moli -1 cm -1 (o M -1 cm -1 ). La legge di Lambert-Beer permette di calcolare la concentrazione di una specie molecolare in soluzione misurando l Abs: c = A/ d e dall Abs si può calcolare l : = A/dc Per questo tipo di analisi viene impiegato uno strumento: a) lo spettrofotometro, utilizza radiazioni UV, del visibile e nell'infrarosso, per la misura dell'assorbanza; Materiali: - Albumina (MW: 69293) - H2O - Tubi 1.5 ml (per curva standard) - Portaprovette - Pipette - Cuvette per spettrofotometria visibile - Spettrofotometro

3 Procedura: Misura dello spettro di assorbimento dell albumina 1. Preparare una soluzione di albumina concentrata 1 mg/ml in H2O 2. fare diluizioni seriali di albumina 3. Riempire con H2O una cuvetta da spettrofotometro e inserirla nell apposito alloggiamento dello strumento (bianco) e misurare l assorbanza a lunghezze d onda comprese tra 220 e 320 nm (azzerare lo spettrofotometro). L'azzeramento e taratura normale di uno strumento si basa sulle definizioni di T e Abs. Per una soluzione con concentrazione infinita la T deve essere uguale a 0 e l Abs infinita. Per una soluzione con concentrazione nulla si deve avere T=1 e Abs=0. Interponendo sul cammino ottico uno schermo perfettamente opaco (che rappresenta una soluzione a concentrazione infinita ) lo strumento deve segnare 0 sulla scala della T. La taratura a concentrazione nulla (Abs = 0) invece viene effettuata con il cosiddetto azzeramento contro il bianco. Quando il raggio di luce monocromatica arriva alla celletta contenente il campione, avvengono diversi fenomeni quali, la riflessione, la rifrazione, l assorbimento da parte delle pareti della celletta, del solvente e di tutti i reattivi aggiunti per formare il composto in esame. L'Abs effettivamente misurata risentirebbe quindi di numerosi fattori non legati alla concentrazione della sostanza in esame, portando quindi ad errori nella determinazione della concentrazione di quest'ultima. Per aggirare questo problema, prima di misurare l'assorbanza del campione in esame, si azzera l'abs introducendo il bianco, cioè una cuvetta identica a quella del campione e che contiene tutti i reagenti tranne il campione stesso. Non effettuando l'azzeramento contro il bianco si perderà la proporzionalità diretta tra Abs e concentrazione. 4. Dopo aver azzerato lo spettrofotometro (bianco con H2O) procedere alla lettura dell Abs delle soluzioni di albumina, trascrivere i valori nella tabella sotto e calcolare la concentrazione dell albumina corrispondente a ogni diluizione.

4 Abs 280 nm Abs 280 nm campione Albumina (mg/ml) Abs a 280 nm Lo spettro di assorbimento è caratteristico per ogni molecola (in un dato solvente) e può essere utilizzato, assieme ad altre caratteristiche, come criterio di identificazione di quella sostanza. Si riporta su un grafico Excel l Abs in funzione della concentrazione e si traccia una retta. Si calcola la pendenza della retta che corrisponderà al coefficiente di estinzione molare per quella lunghezza d onda e per un cammino ottico di 1 cm. Un calcolo pratico può essere fatto conoscendo l Abs e la concentrazione di due punti della retta applicando direttamente la legge di Lambert-Beer: = A/dc 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 calcolato in H 2 O y = 0,604x + 0,0007 R² = 1 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 calcolato in PBS y = 0,5602x - 0,0074 R² = 0, ,5 1 1,5 mg/ml di BSA 0 0 0,5 1 1,5 mg/ml di BSA

5 Fonte: UniProtKB - P02769 (ALBU_BOVIN) (ProtParam) ALBU_BOVIN (P02769) Extinction coefficients: Extinction coefficients are in units of M -1 cm -1, at 280 nm measured in water. Ext. coefficient: Abs 0.1% (=1 g/l) 0.720, assuming all pairs of Cys residues form cystines Ext. coefficient: Abs 0.1% (=1 g/l) 0.690, assuming all Cys residues are reduced

6 Domande: 1) A quale lunghezza d onda deve essere settato lo spettrofotometro per costruire la retta di taratura dell albumina? 2) In spettrofotometria, che cosa si intende per bianco e qual è la sua utilità? 3) Facendo riferimento alla curva di taratura, se la concentrazione di albumina è 0.2 mg/ml, quale sarà la sua Abs? 4) Quali sono i principali errori sulla misura dell'abs?

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