APPLICAZIONI DELLA SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE. University of Messina, Italy. Analitica 26 16/17
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1 26 APPLICAZIONI DELLA SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE 1
2 Specie molecolari che assorbono la radiazione ultravioletta e visibile Le misure di assorbimento nelle regioni visibile ed ultravioletta dello spettro forniscono informazioni qualitative e quantitative su molecole organiche, inorganiche e biochimiche. 2
3 Assorbimento da parte di composti organici Sono due i tipi di elettroni responsabili dell assorbimento della radiazione ultravioletta e visibile da parte di molecole organiche: elettroni condivisi che partecipano direttamente alla formazione del legame elettroni esterni non condivisi che sono localizzati intorno ad atomi come ossigeno, alogeni, zolfo e azoto 3
4 Assorbimento da parte di composti organici Gli elettroni condivisi in legami singoli come quello caroniocarbonio o carbonio-idrogeno sono così fortemente legati che l assorbimento si ha solo in una regione dello spettro ultravioletto (λ <180nm). In suddetta regione assorbono anche i componenti dell aria; la regione è detta ultravioletto del vuoto. 4
5 Assorbimento da parte di composti organici Gli elettroni coinvolti in legami doppi e tripli di molecole organiche sono legati più debolmente e sono perciò più facilmente eccitati dalla radiazione; le specie con legami insaturi mostrano picchi di assorbimento utili nella regione ultravioletta facilmente accesibile (>180nm). 5
6 Assorbimento da parte di composti organici I gruppi funzionali insaturi organici che assorbono nelle regioni dell ultravioletto e del visibile sono detti cromofori. 6
7 Caratteristiche di assorbimento di alcuni tipici cromofori organici 7
8 Assorbimento da parte di specie inorganiche Gli ioni e i complessi di elementi delle prime due serie di transizione assorbono bande ampie di radiazione visibile in almeno uno dei loro stati di ossidazione. 8
9 Assorbimento a trasferimento di carica Per scopi quantitativi l assorbimento a trasferimento di carica è particolarmente importante perché le assorbanze specifiche molari sono inusualmente grandi (ε max >10000) e portano di conseguenza una alta sensibilità. Molti complessi inorganici ed organici esibiscono questo tipo di assorbimento e sono detti complessi a trasferimento di carica. 9
10 Assorbimento a trasferimento di carica Un complesso a trasferimento di carica consta di un gruppo elettron donatore legato ad uno elettron accettore. Quando questo prodotto assorbe radiazione un elettrone dal donatore è trasferito all accettore. Lo stato eccitato è così il prodotto di un genere di processi ossido-riduttivi interni. 10
11 Specie molecolari che assorbono la radiazione infrarossa Fatta eccezione per pochi composti omonucleari come O 2, Cl 2 e N 2 tutte le molecole organiche ed inorganiche assorbono radiazione infrarossa. L assorbimento di tale radiazione comporta transizioni fra i livelli energetici vibrazionali dei più bassi livelli energetici elettronici delle molecole. 11
12 Specie molecolari che assorbono la radiazione infrarossa Il numero di modi in cui una molecola può vibrare è legato al numero di legami che essa contiene e al numero di atomi che la costituiscono. Spettro infrarosso per l n-butanale 12
13 Spettroscopia di assorbimento molecolare La spettroscopia di assorbimento nell ultravioletto/visibile è utilizzata soprattutto per l analisi quantitativa. La spettroscopia di assorbimento nell infrarosso è invece uno strumento potente per la determinazione qualitativa di composti sia organici che inorganici. 13
14 Caratteristiche importanti della spettrofotometria ultravioletto/visibile estesa applicabilità buona sensibilità limiti di rivelazione da 10-4 a 10-7 M selettività da moderata ad alta ragionevole accuratezza e precisione velocità e convenienza 14
15 Applicazioni a specie assorbenti La determinazione spettrofotometrica di composti organici contenenti uno o più gruppi cromofori è effettuabile così come lo è anche quella di specie inorganiche in grado di assorbire la radiazione ultravioletta e visibile. 15
16 Applicazioni a specie non assorbenti La determinazione spettrofotometrica per questa classe di analiti può essere effettuata previa reazione con reagenti cromofori che porta alla produzione di specie che assorbono fortemente nelle regioni ultraviolette e visibile. E importante che la reazione con l analita da parte dei reagenti sia forzata a completezza. 16
17 Applicazioni a specie non assorbenti Reagenti inorganici tipici sono: ione tiocianato per ferro,cobalto e molibdeno lo ione ioduro per bismuto, palladio e tellurio Tra i reagenti chelanti organici (che formano complessi colorati stabili con i cationi) ricordiamo: dietilditiocarbammato per il rame difeniltiocarbazone per il piombo 1-10-fenantrolina per il ferro dimetilgliossima per il nichel 17
18 Condizioni necessarie per avere una relazione riproducibile tra assorbanza e concentrazione dell analita selezione della lunghezza d onda variabili che influenzano l assorbanza pulizia e maneggio delle cuvette 18
19 Condizioni necessarie per avere una relazione riproducibile tra assorbanza e concentrazione dell analita determinazione della relazione tra assorbanza e concentrazione metodo dell aggiunta standard analisi di miscele 19
20 Selezione della lunghezza d onda Per ottenere la massima sensibilità le misure di assorbanza spettrofotometriche sono ordinariamente eseguite ad una lunghezza d onda corrispondente ad un picco di assorbimento. 20
21 Variabili che influenzano l assorbanza La variazione di uno spettro di assorbimento è dovuta al tipo di solvente utilizzato, al ph della soluzione, alla temperatura, alla concentrazione dell analita e alla presenza di sostanze interferenti. Gli effetti di queste variabili devono essere perfettamente conosciute. 21
22 Pulizia e maneggio delle cuvette E sempre richiesto l uso di cuvette accoppiate di elevata qualità. Esse dovrebbero essere calibrate tra loro per rivelare eventuali differenze causate da graffi, impronte, o più in genere dall uso. 22
23 Determinazione della relazione fra assorbanza e concentrazione Gli standard di calibrazione per una analisi spettrofotometrica e fotometrica dovrebbero approssimare quanto più possibile la composizione complessiva del campione reale. Tuttavia quasi mai è possibile assumere l aderenza alla legge di Beer; meno prudente ancora è basare i risultati su un valore riportato in letteratura. 23
24 Il metodo dell aggiunta standard Le difficoltà legate alla preparazione di standard con una composizione complessiva che approssimi strettamente quella del campione sono enormi se non insormontabili; in tali circostanze l approccio dell aggiunta standard può essere utile. 24
25 Analisi di miscele L assorbanza totale di una soluzione ad una qualsiasi lunghezza d onda è uguale alla somma delle assorbanze dei componenti individuali presenti nella soluzione. Nella figura a fianco viene riportato lo spettro di una soluzione contenente una miscela della specie M e della specie N insieme agli spettri di assorbimento delle componenti individuali. 25
26 Analisi di miscele Per analizzare la miscela, le assorbanze specifiche molari per M e N sono precedentemente determinate alle lunghezze d onda λ 1 e λ 2 con un numero di standard sufficiente ad assicurare il rispetto della legge di Beer in un intervallo di assorbanze che comprende anche l assorbanza del campione. Per completare l analisi si determina l assorbanza della miscela a queste due lunghezze d onda. 26
27 Analisi di miscele Le miscele contenenti più di due specie che assorbono dovrebbero essere analizzate (almeno in teoria) effettuando una misurazione aggiuntiva di assorbanza per ogni componente aggiunto. Le incertezze nei dati risulterebbero però più grandi man mano che aumenta il numero delle misure. 27
28 Applicazioni della spettroscopia di assorbimento nell infrarosso La spettroscopia infrarossa è applicabile sia per l analisi qualitativa che per l analisi quantitativa. Le applicazioni qualitative sono però di gran lunga le più importanti. Spettrometri dispersivi Spettrometri in Trasformata di Fourier Fotometri a filtro 28
29 Spettrometri in trasformata di Fourier Non contegono elementi dispersivi e tutte le lunghezze d onda sono rivelate e misurate contemporaneamente. PER SEPARARE LE LUNGHEZZE D ONDA E NECESSARIO MODULARE IL SEGNALE DELLA SORGENTE CHE ATTRAVERSA IL CAMPIONE, in modo che esso possa essere registrato come INTERFEROGRAMMA. L interferogramma è successivamente decodificato con una trasfprmata di Fourier. 29
30 Spettrometri in trasformata di Fourier Due interferometri paralleli, uno per modulare la radiazione IR proveniente dalla sorgente prima che attraversi il campione e un secondo per modulare la luce rossa proveniente dal laser HE-Ne che fornisce un segnale di riferimento per l acquizione dei dati derivanti dal rivelatore IR. 30
31 Spettri prodotti con uno spettrometro FTIR Segnale in uscita (interferogramma) in funzione del tempo o spostamento dello specchio mobile Spettro IR del cloruro di metilene 31
32 Applicazioni qualitative La spettroscopia infrarossa è un potente metodo a disposizione del chimico per identificare e determinare la struttura di specie organiche, inorganiche e biochimiche poiché tutte le specie molecolari eccezione fatta per alcuni composti omonucleari (idrogeno, ossigeno e azoto) assorbono tale radiazione. 32
33 Applicazioni quantitative Le applicazioni quantitative della spettroscopia infrarossa sono più limitate di quelle analoghe ottenute con la radiazione ultravioletta/visibile in virtù delle basse assorbanze specifiche molari, della larghezza esigua dei picchi infrarossi e delle difficoltà strumentali nel misurare accuratamente le trasmittanze. 33
34 Misure di assorbanza L uso di cuvette appaiate non è conveniente nell infrarosso a causa delle difficoltà di avere celle con caratteristiche di trasmissione identiche. Tale difficoltà deriva dalla degradazione, dovuta all uso, della trasparenza delle finestre delle celle per infrarosso dovuta all attacco di tracce di umidità nell atmosfera e nei campioni. Inoltre il cammino ottico è difficile da riprodurre perché le celle per infrarosso hanno uno spessore < 1mm. 34
35 Applicazioni tipiche Oltre ad avere la capacità di determinare un numero insolitamente elevato di sostanze visto che tutte le specie molecolari assorbono in questa regione, l unicità di uno spettro infrarosso fornisce un grado di specificità eguagliato o superato da pochi altri metodi analitici. 35
36 Errori nelle analisi spettrofotometriche Sono stati paragonati due strumenti: lo Spectronic 20 ed il Cary 118 che è più costoso e viene utilizzato nell ambito della ricerca.dalla figura sottostante si evince che lo Spectronic 20 genera errori elevati anche quando l assorbanza misurata è>1.2 mentre con il Cary 118 questo errore scompare. 36
37 Fotometri Nei casi in cui non è richiesta un alta purezza spettrale (come spesso accade) l accuratezza e la precisione offerte dal fotometro raggiungono quelle fatte da uno spettrofotometro. Gli svantaggi maggiori dei fotometri sono la minore versatilità, l incapacità a produrre spettri interi e la più ampia larghezza di banda effettiva. 37
38 Fotometri Viene qui di seguito riportato a titolo di esempio uno schema ottico di un fotometro infrarosso portatile progettato per la determinazione quantitativa di inquinanti organici nell atmosfera. 38
39 Fotometri La sorgente del fotometro prima illustrato è una barretta di ceramica avvolta da un filo di nichel-cromo e il trasduttore è un rivelatore piroelettrico. Il cammino ottico nella cella è 0.5 m ma una serie di specchi riflettenti (non mostrati in figura) incrementa la lunghezza della cella fino a 20.5 m. Questa caratteristica aumenta enormemente l intervallo di concentrazioni accessibili allo strumento. 39
40 Fotometri Il fotometro infrarosso portatile presentato nei lucidi precedenti è sensibile a pochi decimi di parte per milione di sostanze quali acrilonitrile, idrocarburi clorurati, monossido di carbonio, fosgene e cianuro di idrogeno. 40
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