Diagnostica della Malattia di Pompe (Glicogenosi tipo II)

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1 Diagnostica della Malattia di Pompe (Glicogenosi tipo II) Dott.ssa Angela Amati Servizio di Neurofisiopatologia Azienda Ospedaliera-Universitaria Policlinico di Bari

2 ESAMI DI LABORATORIO Dosaggio del CK Bambini: valore aumentato (< 10x); Adolescenti e adulti (normale o lievemente aumentato (5%); Dosaggio dell attività enzimatica dell alfa glucosidasi acida;

3 MALTASI ACIDA (alfa-glucosidasi acida) enzima lisosomiale; lavora ad un ph compreso tra 4 e 5; dotata di attività alfaglucosidasica può idrolizzare completamente il glicogeno in glucosio; è il solo enzima degradativo del glicogeno presente nei lisososmi; è codificato dal gene GAA;

4 L α-1,4-glucosidasi acida Localizzazione: presente in tutti i tessuti Localizzazione subcellulare: lisosomiale Meccanismo d azione: Idrolizzazione lineare dei legami α1-4 glucosidici dei carboidrati Il sito catalitico dell enzima: Asp-518 Effetti delle mutazioni dell α-1,4-glucosidasi acida: varie Enzima assente: nella forma infantile; Enzima e attività proporzionalmente ridotta: nella forma adulta; Enzima presente ma attività catalitica ridotta: nelle forme infantili, giovanili e adulte;

5 PATOGENESI DELLA MALATTIA DI POMPE PATOLOGIA La GAA è essenziale per la degradazione del glicogeno lisosomiale Il deficit causa accumulo e dilatazione Raben N, Plotz P, Byrne BJ. Acid alfa-glucosidase deficiency (glycogenosis type II, Pompe disease). Curr Mol Med. 2002;2:

6 La progressione della Malattia di Pompe

7 Dosaggio dell attività enzimatica dell α glucosidasi acida Dosaggio dell attività enzimatica della GAA su: Goccia di sangue essiccato (Dried Blood Spot) (tecnologia emergente) Leucociti Fibroblasti cutanei Biopsia muscolare Dosaggio del gluco-tetrasaccaride derivante dal glicogeno nelle urine Analisi delle mutazioni genetiche Diagnosi prenatale tramite Amniocentesi Prelievo dei villi coriali Hirschhorn R, Reuser AJJ. Glycogen storage disease type II: acid alpha-glucosidase (acid maltase) deficiency. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 8th ed. New York: McGraw-Hill; 2001: Umapathysivam K, Hopwood JJ, Meikle PJ. Determination of acid alfa-glucosidase activity in blood spots as a diagnostic test for Pompe disease. Clin Chem. 2001;47: Yijun L, Scott R, Chamoles N, Ghavami A, Pinto B, Turecek F, Gelb M. Direct multiplex assay of lysosomal enzymes in dried blood spots for newborn screening. Clin Chem. 2004;50: Chamoles NA, Niizawa G, Blanco M, Gaggioli D, Casentiini C. Glycogen storage disease type II: enzymatic screening in dried blood spots on filter paper. Clin Chimica Acta. 347, 2004: DIAGNOSI

8 DBS (Dried Blood Spot) Malattia di Pompe identificata dal test di macchia di sangue essiccato per dosaggio enzimatico dell α glucosidasi acida Inviati a: Dott. Severo PAGLIARDINI Ospedale Sant Anna Torino

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12 Il metodo usato per la determinazione dell α glucosidasi acida (GAA) su spot è di tipo fluorimetrico e viene eseguito a ph acido (ph 4) e poi rapportato al ph 6.5 (ph6.5/ph4). Se il valore è basso bisogna confermare il sospetto di patologia di Pompe ripetendo il dosaggio GAA su sangue intero e poi confermando con il dosaggio sui leucociti.

13 Vantaggi DBS 1. Metodo non invasivo; 2. Piccola quantità di sangue usata (200µl) contro i 3-5 ml dei linfociti; 3. L attività dell enzima nello stato di essiccamento rimane stabile a temperatura ambiente quindi lo spot può essere conservato e spedito al laboratorio che esegue il test senza problemi; 4. Tempi di risposta molto brevi.

14 Dosaggio dell attività enzimatica GAA sui leucociti Occorrono 3-5 ml di sangue; Il dosaggio viene eseguito su pappa leucocitaria; La presenza di isoenzimi che interferiscono con l attività della GAA è stata superata usando degli inibitori per cui questo metodo serve a confermare la diminuzione dell attività trovata con il DBS; Tempi di risposta più lunghi (6-8 settimane).

15 Dott.ssa Amelia Morrone Responsabile Laboratorio di Biologia Molecolare

16 Dosaggio dell attività enzimatica GAA su fibroblasti cutanei È un metodo più invasivo; I tempi di risposta sono di 1-2 mesi in quanto è necessario attendere la confluenza cellulare.

17 Dosaggio dell attività enzimatica GAA su biopsia muscolare È un metodo invasivo ma con tempi di risposta più rapidi rispetto a quello eseguito sui fibroblasti

18 Dosaggio del gluco-tetrasaccaride derivante dal glicogeno I pazienti affetti da Malattia di Pompe presentano un aumento dell escrezione di questo metabolita nelle urine. Questo marker è utile per monitorare l efficacia della terapia ma non la diagnosi, anche se la coesistenza di aumentata escrezione di gluco-tetrasaccaride nelle urine e diminuizione dell attività del GAA portano a una conferma della diagnosi.

19 MALATTIA DI POMPE ATTIVITA ENZIMATICA RESIDUA PATOLOGIA INSORGENZA INFANTILE* INSORGENZA TARDIVA 100% 100% STATO CLINICO 40% ATTIVITÀ RESIDUA GAA (FIBROBLASTI CUTANEI) 0% *CARDIOMIOPATIA L attività residua di GAA è generalmente inversamente correlata alla severità della malattia Insorgenza infantile 1 ETÀ (ANNI) Insorgenza tardiva <1% del normale <40% del normale Hirschhorn R, Reuser AJJ. Glycogen storage disease type II: acid alpha-glucosidase (acid maltase) deficiency. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 8th ed. New York: McGraw-Hill; 2001: %

20 EREDITARIETÀ MALATTIA DI POMPE MODELLO DI EREDITARIETÀ Eredità autosomica recessiva Padre portatore Madre portatrice Soggetto affetto (25%) Sani ma portatori (50%) Sani (25%) Allele anormale Allele normale Hirschhorn R, Reuser AJJ. Glycogen storage disease type II: acid alpha-glucosidase (acid maltase) deficiency. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 8th ed. New York: McGraw-Hill; 2001:

21 MALATTIA DI POMPE: GENETICA EREDITARIETÀ Il gene per la GAA è localizzato sul cromosoma 17; Il gene contiene 20 esoni di cui il primo non è codificante Sono circa 200 le mutazioni del gene GAA a tutt oggi identificate; I difetti includono cambi di coppie di base con mutazioni di senso e non senso, difetti di splicing e delezioni e inserzioni di piccole e grandi dimensioni. Alcune mutazioni sono comuni nella popolazione generale o in gruppi etnici specifici; la maggior parte consiste tuttavia in mutazioni identificate in singoli soggetti. Elenco aggiornato delle mutazioni: www2.eur.nl/fgg/ch1/pompe/mutations.html Raben N, Plotz P, Byrne BJ. Acid alfa-glucosidase deficiency (glycogenosis type II, Pompe disease). Curr Mol Med. 2002;2: Mutations in GSD II. Available at:

22 Analisi molecolare Dopo conferma della diagnosi mediante test biochimico, l identificazione della mutazione nel gene GAA non è strettamente necessaria. Tuttavia, il test molecolare è di notevole importanza perché permette di identificare in modo inconfutabile il portatore di una mutazione ed è quindi fortemente consigliato a tutti i parenti prossimi di un paziente, soprattutto nel caso questi avessero l intenzione di avere un figlio. Finora sono state identificate più di 200 mutazioni diverse

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25 Biopsia muscolare La biopsia muscolare viene eseguita: quando non abbiamo dati clinici fortemente indicativi per malattia di Pompe; quando abbiamo dati clinici fortemente indicativi per malattia di Pompe ma il dosaggio dell attività enzimatica è normale;

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27 Forma infantile Ematossilina Eosina e Tricromica di Engel: presenza di vacuoli PAS: i vacuoli appaiono PAS positivi contenenti glicogeno Fosfatasi Acida: i vacuoli sono positivi alla fosfatasi acida lisosomiale

28 Forma adulta Ematossilina Eosina: presenza di vacuoli PAS: i vacuoli appaiono PAS positivi contenenti glicogeno Fosfatasi Acida: i vacuoli sono positivi alla fosfatasi acida lisosomiale

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30 Diagnostica differenziale Vacuoli presenti nella glicogenosi di tipo II sono simili a quelli osservati nei pazienti con Malattia di Danon. Questa malattia è legata alla mutazione del gene LAMP2 che codifica per la proteina 2 associata alla membrana lisosomiale implicata nella maturazione dell autofagosoma e fusione al lisosoma. Le manifestazioni cliniche ed ereditarie però sono diverse.

31 Diagnostica differenziale Glicogenosi dovuta a deficit dell enzima deramificante caratterizzata da vacuoli PAS positivi ma da un piccolo incremento della fosfatasi acida e alla microscopia elettronica il glicogeno non è mai legato alla membrana e non vi è materiale autofagico.

32 MALATTIA DI POMPE A INSORGENZA TARDIVA. Algoritmo diagnostico American Association of Neuromuscular & Electrodiagnostic Medicine Muscle & Nerve, 2009 Ipostenia muscoli cingolo pelvico Valutazione neurologica CK, LDH, AST, ALT Difficoltà respiratorie FCV da posizione seduta e supina ENMG Ipostenia diaframma Elementi suggestivi di una patologia specifica Pattern miopatico Elementi suggestivi di una malattia di Pompe o di una miopatia non specifica Considerare una diagnosi diversa Attività enzimatica GAA su sangue Biopsia muscolare Miopatia vacuolare + accumulo di glicogeno lisosomiale Attività enzimatica normale Attività enzimatica ridotta SI NO Confermare la ridotta attività enzimatica GAA su un secondo campione e/o analisi genetica Attività enzimatica ridotta Attività enzimatica GAA su muscolo o sangue Attività enzimatica normale Malattia di Pompe confermata Positivo Negativo Considerare una diagnosi diversa