METODI ALTERNATIVI. PCR digitale per la rilevazione e quantificazione. assoluta del DNA

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1 METODI ALTERNATIVI PCR digitale per la rilevazione e quantificazione assoluta del DNA Roma, 25 settembre 2013 Giuseppina Buonincontro IZS PLV- S.S. Controllo Alimenti

2 La prima generazione di PCR consente l'ottenimento di risultati qualitativi, attraverso analisi end- point tramite gel elettroforesi La Real Time PCR consente la quantificazione degli acidi nucleici tramite monitoraggio della progressione dell'amplificazione dopo ogni ciclo, usando probes fluorescenti Combinando diluizioni limite, PCR end-point e statistiche di Poisson, si può ottenere una misurazione assoluta della concentrazione degli acidi nucleici digital PCR (dpcr)

3 dpcr 8 reazioni DNA templato Mastermix TaqMan + Olio con surfattanti per stabilizzare la soluzione cartuccia

4 In seguito all applicazione di vuoto, vengono creati all incirca droplet monodispersi. Il campione così preparato viene pipettato in una piastra da 96 wells e viene sottoposto a PCR end-point (40 cicli)

5 I droplet vengono separati e riorganizzati a formare una singola fila, che viene fatta passare in un detection system per determinare quali droplet contengono il target (+) e quali no (-)

6 Un software legge le positività in ogni droplet e crea un grafico. La frazione di positivi determina la concentrazione del target nel campione di partenza.

7 Il software di analisi per la dpcr applica, quindi, al dato ottenuto il calcolo statistico della distribuzione di Poisson e esprime il risultato in numero di copie di templato per ul di reazione (copie/ul). Il numero totale di copie amplificate può essere facilmente ricavato moltiplicando il dato espresso in copie/ul per il volume di reazione che è pari a 20 ul.

8 Metodologia seguita nel progetto di ricerca I campioni contenenti crostacei preparati per il ring test sono stati estratti ed analizzati nuovamente con due diversi kit in: - PCR REAL-TIME - DIGITAL PCR (dpcr)

9 Risultati Real-time

10 Piastra dpcr 400 ng 80 ng H2O H2O x x X X X X CoZZA 50 9B 9B x x 9B 9B 2B 2B CoZZA 50 9C 9C 2C 2C 9C 9C 2C 2C COZZA 5 9D 9D 2A 2A 9D 9D 2A 2A COZZA 5 ctrl+ 9A 9A 2E 2E 9A 9A 2E 2E GAMB 50 ctrl+ 9E 9E 2D 2D 9E 9E 2D 2D GAMB 50 SUGO SUGO PESCE PESCE SUGO SUGO PESCE PESCE GAMB 5 ctrl+ H2O H2O x x X X X X GAMB 5 ctrl+

11 Risultati preliminari dpcr I dati ottenuti rivelano: - il sistema non è in grado di amplificare in maniera efficiente il DNA di crostaceo eventualmente presente in tracce in un alimento; - non è possibile evidenziare una linearità del dato associabile a dosi crescenti di DNA di crostaceo presenti nei campioni; - il controllo positivo del kit amplifica

12 Considerazioni preliminari dpcr La natura del campione può interferire in qualche modo con la reazione di droplet digital PCR. Infatti, il numero di droplet totali che erano state generate era molto variabile da un campione all altro e inoltre in alcuni campioni era inferiore al limite di accettabilità del dato (8000 droplet/campione)

13 Considerazioni preliminari dpcr II Verifica dell ipotesi: - purificazione applicando il protocollo basato sull utilizzo del fenolo e del cloroformio con precipitazione salina degli acidi nucleici. - Si sono ripetuti con i due kit disponibili.

14 Risultati dpcr kit 1

15 Analisi risultati dpcr - kit 1 Il sistema risulta inefficiente nell amplificare la sequenza target di crostaceo in campioni di DNA estratti da alimenti, come si desume dalla scarsissima amplificazione del controllo positivo (150 copie vs oltre copie attese) oltreché dei campioni. Inoltre, non è possibile evidenziare una linearità nella risposta di amplificazione in campioni con dosi crescenti di DNA di crostaceo.

16 Risultati dpcr kit 2 S UG O 200 copie totali R 2 = 0,989 R 2 = 0, ng 80 ng Lineare (400 ng) Lineare (80 ng) P P M

17 Risultati dpcr kit 2 P OL PE T TE Copie Totali R 2 = 0,994 R 2 = 0, P P M 400 ng 80 ng Lineare (400 ng) Lineare (80 ng)

18 Analisi risultati dpcr - kit 2 I campioni spiked con il controllo hanno mostrato una ottima linearità e il limite di rilevazione del sistema è risultato essere di almeno 5 ppm, cioè il punto meno concentrato del pannello in esame.

19 CONCLUSIONI E SVILUPPI FUTURI Il sistema innovativo della dpcr sembra essere efficace ed efficiente per la ricerca di allergeni in alimenti; Come per altri sistemi di screening per la ricerca di allergeni è necessario mettere a punto protocolli di estrazione diversi e specifici per le varie matrici alimentari Stiamo valutando la possibilità di applicare il protocollo a tutti o (quasi) gli allergeni dell allegato II

20 Un grazie particolare a Walter Vencia; Sandra Fragassi;Alberto Parisi; Sara Monfardini