Modulo di GENETICA APPLICATA. Esame integrato di METODOLOGIE BIOTECNOLOGICHE CORSO DI LAUREA IN BIOTECNOLOGIE. Docente: FLAVIA CERRATO

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1 Modulo di GENETICA APPLICATA Esame integrato di METODOLOGIE BIOTECNOLOGICHE CORSO DI LAUREA IN BIOTECNOLOGIE Docente: FLAVIA CERRATO a. a

2 PROGRAMMA 1. Tecniche di base. Taglio e saldatura di molecole di DNA 2. Vettori di clonaggio 3. Strategie di clonaggio - Genoteche 4. Sequenziamento e mutagenesi in vitro 5. Trasferimento genico in cellule animali Animali transgenici 6. Trasferimento genico nelle piante Piante transgeniche 7. Applicazioni della tecnologia del DNA ricombinante Testi consigliati: Sandy Primrose, Richard Twyman and Bob Old. INGEGNERIA GENETICA principi e tecniche. Zanichelli Richard J. Reece. Analisi dei geni e genomi. Edises Edoardo Boncinelli, Antonio Simeone. Ingegneria Genetica. Idelson-Gnocchi

3 BIOTECNOLOGIA 1917 Karl Ereky conia la parola biotecnologia Tutte le linee operative che rendono prodotti a partire dalle materie prime con l ausilio di organismi viventi 1961 Carl Goran Heden cambia il titolo di un giornale scientifico da Journal of Microbiological and Biochemical Engineering and Technology in Biotechnology and Bioengineering Studio della produzione industriale di merci e di servizi mediante processi che utilizzano organismi, sistemi e procedimenti biologici

4 METODOLOGIE BIOTECNOLOGICHE Metodologie microbiologiche Metodologie biochimiche INGEGNERIA GENETICA TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE GENETICA APPLICATA

5 La TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE nasce nel 1973 quando Herb Boyer e Stanley Cohen clonano la prima molecola di DNA Cohen SN, Chang ACY, Boyer HW, Helling RB PNAS, 70, (1973). A COSA SERVE L INGEGNERIA GENETICA? DNA al microscopio elettronico

6 ELETTROFORESI DEGLI ACIDI NUCLEICI

7 Elettroforesi degli acidi nucleici L elettroforesi è una tecnica biochimica che permette di separare le molecole dotate di carica in base al loro diverso peso molecolare. Le separazioni elettroforetiche vengono fatte in gel. La matrice del gel può essere costituita da agarosio (range di separazione: kb) poliacrilammide (range di separazione bp) I gel di poliacrilamide si formano per la copolimerizzazione di acrilamide e di un agente che forma legami trasversali (generalmente N,N -metilene bisacrilamide) a formare un reticolo tridimensionale.

8 Elettroforesi orizzontale

9 Elettroforesi verticale

10 L elettroforesi è utilizzata sia a scopo analitico che preparativo Rivelazione degli acidi nucleici Separazione di frammenti di dimensioni diverse coloranti degli acidi nucleici: etidio bromuro sybr green

11 In un gel sottoposto ad elettroforesi la mobilità di un frammento di DNA è inversamente proporzionale al logaritmo del peso molecolare Unknown DNA

12 Pulsed Field Gel Electrophoresis Elettroforesi in campo pulsato Permette di separare frammenti di DNA molto lunghi (centinaia di kb)

13 Elettroforesi di molecole di RNA La velocità di migrazione delle molecole nell elettroforesi non dipende solo dalla dimensione della molecola ma anche dalla loro forma e struttura secondaria. Molecole di DNA lineari a doppia elica hanno una struttura secondaria uniforme e la loro velocità di migrazione in elettroforesi è proporzionale al peso molecolare. Le molecole di RNA sono a singola elica e pertanto possiedono una grande quantità di strutture secondarie che ne influenzano la migrazione. Per ovviare a questo problema si utilizzano gel denaturanti, aggiungendo formaldeide al gel di agarosio e formammide all RNA, prima del caricamento.

14 TRASFERIMENTO DEGLI ACIDI NUCLEICI SU MEMBRANA: BLOTTING

15 Il Southern blotting Con il termine blotting si intede il trasferimento e l immobilizzazione di acidi nucleici da un gel o una soluzione acquosa a un supporto solido, generalmente una membrana di nitrocellulosa o nylon. Gli acidi nucleici così trasferiti sono poi usati come bersaglio in esperimenti di ibridazione.

16 Procedure di trasferimento e ibridazione degli acidi nucleici Trasferimento di acidi nucleici da gel: Southern e Northern blot Trasferimento di acidi nucleici da soluzione acquosa: Slot e Dot blot Trasferimento di colonie (di batteri o lieviti) o placche di lisi Ibridare vuol dire immergere la membrana a cui è fissato il DNA in una soluzione contenente una sonda, ossia una segmento di DNA o RNA (opportunamente marcato) la cui sequenza sia complementare alla sequenza dei frammenti che si vogliono identificare.

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18 Preparazione di sonde Marcatura degli acidi nucleici Traccianti radioattivi Traccianti non radioattivi Marcatura terminale Marcatura interna Sonde a DNA Sonde a RNA

19 Nucleotidi marcati con radioisotopi

20 Traccianti radioattivi Vantaggi: molto sensibili Svantaggi: pericolosi poiché mutageni vita breve Traccianti non radioattivi Vantaggi: non pericolosi lunga durata del segnale Svantaggi: meno sensibili dei traccianti radioattivi

21 Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive Fluorocromi (marcatura diretta) Digossigenina (riconosciuta da anticorpi specifici marcati con fluorocromi o enzimi) Biotina (riconosciuta da avidina marcata con fluorocromi o enzimi)

22 A. Ibridazione della sonda marcata con biotina al DNA bersaglio B. Si aggiunge avidina (o streptavidina) che va a legarsi alla biotina C. Si aggiunge un enzima marcato con biotina come la fosfatasi alcalina o la perossidasi D. Si aggiunge un substrato cromogeno o chemioluminescente dell enzima. Si rileva il cambiamento di colore o l emissione di luce per effetto della trasformazione del substrato in prodotto

23 Marcatura interna Random priming (innesco casuale) Il frammento di Klenow è la DNA polimerasi di E.coli, privata della sua attività esonucleotidica 5 3

24 Marcatura terminale Marcatura al 5 5 La polinucleotide chinasi catalizza il trasferimento di un gruppo fosfato (in posizione γ) dall ATP ad un terminale 5 OH di un segmento di DNA o RNA. Se il segmento ha un terminale 5 P allora bisogna prima rimuovere il gruppo fosfato utilizzando la fosfatasi alcalina. Marcatura al 3 3 La terminal trasferasi catalizza l aggiunta di nucleotidi all estremità 3 OH di una molecola di DNA.

25 Sonde a RNA

26 Controllo della stringenza La specificità con cui una sonda si lega alla sua sequenza bersaglio è influenzata dalla temperatura e dalla salinità (forza ionica) del tampone di ibridazione Calcolo della temperatura di melting (Tm): temperatura alla quale sonda e DNA bersaglio sono dissociate al 50% Sonde > 100 nucleotidi: M: forza ionica del tampone espressa in moli /litro Temperatura di ibridazione: Tm 25 C Oligonucleotidi: Temperatura di ibridazione: Tm 5 C

27 PCR: POLYMERASE CHAIN REACTION. LE ESTENSIONI

28 Polimerase Chain Reaction Elementi necessari per la PCR DNA contenente il segmento da amplificare Coppia di inneschi (o primers) : TAQ DNA POLIMERASI dntp Mg2+ Termociclatore

29 PCR

30 Le estensioni della PCR Nested PCR Reverse transcriptase PCR Real time PCR

31 Nested PCR Vantaggio: aumenta la specificita e la sensibilita dell amplificazione. Infatti eventuali prodotti secondari della prima reazione non vengono amplificati nella seconda.

32 Sintesi di cdna ReverseTranscriptase-PCR DNA polimerasi RNA-dipendenti più utilizzate nei laboratori: AMV: Virus della Mieloblastosi Aviaria MuLV: Virus della Leucemia Murina di Moloney

33 Real Time PCR o PCR Quantitativa Proporzione diretta tra segnale luminoso liberato e DNA bersaglio amplificato

34 Le applicazioni della PCR Nella ricerca: clonare, sequenziare e modificare i geni o in generale segmenti di DNA studi evoluzionistici In medicina: diagnosi pre e post-natale di malattie genetiche (es. Anemia falciforme) diagnosi di tumori (es. linfomi) diagnosi di malattie infettive In medicina legale: attribuzione di paternità Identificazione di individui sospetti Nell industria: identificazione degli Organismi Geneticamente Modificati (OGM)

35 Clonare (dal greco, klon: ramoscello) significa produrre copie identiche di una molecola o di una cellula o di un intero organismo Il clonaggio del DNA consiste nella separazione di uno specifico gene o segmento di DNA dal suo cromosoma, nell unirlo a una piccola molecola di DNA che serve da trasportatore, e che permette la replicazione di questo DNA modificato migliaia o addirittura milioni di volte Il risultato è un amplificazione selettiva di quel particolare gene o segmento di DNA.

36 Il clonaggio di un segmento di DNA, sia procariotico che eucariotico,, utilizza 6 metodologie generali: 1. Isolamento del DNA da un organismo 2. Taglio del DNA in frammenti 3. Legame dei frammenti di DNA con un vettore di clonaggio opportunamente scelto 4. Trasferimento del vettore ricombinante nell organismo ospite 5. Selezione del clone contenente il gene di interesse 6. Recupero del vettore ricombinante e del frammento di DNA di interesse

37 TAGLIO DEL DNA: I SISTEMI DI RESTRIZIONE E MODIFICAZIONE DEI BATTERI

38 Sistema di restrizione e modificazione

39 Gli enzimi di restrizione di tipo II tagliano il DNA in corrispondenza di specifiche sequenze

40 Nomenclatura delle endonucleasi di restrizione di tipo II -Servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile -Sono stati isolati più di 3500 enzimi da procarioti -Riconoscono più di 200 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze palindromiche di 4,6 o 8 nucleotidi). EcoRI E = genere Escherichia co = specie coli G/AATTC R = ceppo RY13 CTTAA/G I = prima endonucleasi isolata BamHI B = genere Bacillus am = specie amyloliquefaciens G/GATCC H = ceppo H CCTAG/G I = prima endonucleasi isolata

41 Siti di riconoscimento, taglio e modificazione di vari enzimi di restrizione

42 Le estremità generate dal taglio degi enzimi di restrizione Estremità piatte o blunt ends Estremità coesive o sticky ends: 5 sporgenti o 5 protruding 3 sporgenti o 3 protruding

43 Sebbene gli enzimi di restrizione isolati siano oltre 3500, le sequenze bersaglio che possono essere tagliate sono molte di meno (appena più di 200). E evidente che molti enzimi isolati da batteri diversi hanno la stessa specificità di sequenza, ossia riconoscono la stessa sequenza. Gli isoschizomeri sono enzimi di restrizione di diversa origine che però riconoscono la stessa sequenza e generano lo stesso taglio. Esempio: HpaII II: : C/CGG C CGG (Haemophilus parainfluenzae) MspI: : C/CGG C CGG (Moraxella species) I neoschizomeri sono enzimi di restrizione che riconoscono la stessa sequenza ma generano tagli diversi. Esempio: SmaI: : CCC/GGG (genera estremità piatte) (Serratia marcescens) XmaI: C/CCGGCCGG (genera estremità 5 sporgenti) (Xantomonas malvacearum) Isoschizomeri e neoschizomeri

44 Numero e dimensione dei frammenti di restrizione La maggior parte degli enzimi di restrizione riconosce palindromi di 4 o 6 nucleotidi. Se assumiamo che i 4 nucleotidi siano distribuiti a caso nelle molecole di DNA: -per enzimi che riconoscono palindromi di 4 nt si avrà IN MEDIA un taglio ogni 256 nucleotidi (4 4 =4x4x4x4) -per enzimi che riconoscono palindromi di 6 nucleotidi avremo IN MEDIA un taglio ogni nucleotidi (4 6 )

45 SALDATURA DEL DNA. GLI ENZIMI CHE UNISCONO COVALENTEMENTE DUE MOLECOLE DI DNA

46 Gli enzimi utilizzati per saldare le molecole di DNA DNA ligasi T4 DNA ligasi Terminal deossinucleotidil-trasferasi (TdT) DNA topoisomerasi I

47 La biochimica della DNA ligasi di E. coli e della DNA ligasi del fago T4 cofattore della T4 DNA ligasi: ATP cofattore della DNA ligasi: NAD+ La DNA ligasi unisce due molecole di DNA con estremità sporgenti compatibili La T4 DNA ligasi unisce due molecole di DNA con estremità sporgenti compatibili o con estremità piatte

48 Utilizzo delle DNA ligasi nel clonaggio

49 Unione di due molecole di DNA con estremità sporgenti compatibili La temperatura ideale per una reazione di ligasi è di circa 15 C Svantaggio: il plasmide può richiudersi senza incorporare l inserto Soluzioni al problema: 1. utilizzare un eccesso di molecole di inserto rispetto alle molecole di plasmide 2. trattare il plasmide con fosfatasi alcalina per rimuovere il gruppo P all estremità 5

50 Utilizzo della fosfatasi alcalina per prevenire la chiusura del plasmide senza l incorporazione l dell inserto

51 Unione di due molecole di DNA con estremità piatte. Le varie strategie I linkers (T4 DNA ligasi) Gli adattatori (T4 DNA ligasi) Le code omopolimeriche (TdT)

52 Utilizzo dei linkers e della T4 DNA ligasi per il clonaggio di molecole di DNA con estremità piatte

53 Utilizzo degli adattatori e della T4 DNA ligasi per il clonaggio di molecole di DNA con estremità piatte

54 Utilizzo di code omopolimeriche sintetizzate dalla TdT per il clonaggio di molecole di DNA con estremità piatte La TdT catalizza l aggiunta di nucleotidi alle estremità 3 sporgenti di una molecola di DNA Le estremità 3 sporgenti possono essere generate da alcuni enzimi di restrizione o dalla esonucleasi del fago λ

55 Clonaggio dei prodotti di PCR

56 Inserimento di siti di restrizione alle estremità 5 dei primer per PCR

57 Utilizzo dei vettori T/A cloning per il clonaggio dei prodotti di PCR Le DNA polimerasi termostabili comunemente utilizzate per la PCR possiedono anche un attività di terminal transferasi, pertanto aggiungono un singolo datp alle estremità 3 dei DNA amplificati. E possibile clonare gli amplificati utilizzando due diverse strategie: 1. Si creano estremità piatte con il frammento di klenow o con polimerasi termostabili con attività esonucleasica 3-5 ; 2. Si utilizzano vettori di clonaggio che espongono un singolo dttp sporgente alle estremità 3

58 La DNA topoisomerasi I del virus Vaccinia taglia e salda molecole di DNA La topoisomerasi I del virus Vaccinia è in grado sia di tagliare che di saldare molecole di DNA. La sequenza del sito di taglio della topoisomerasi I è: CCCTT 1. l enzima riconosce il sito e taglia il plasmide generando estremità 3 coesive di timina, alle quali è attaccato. 2. In seguito all aggiunta di un inserto con estremità 3 coesive di adenina, l enzima catalizza la saldatura delle due estremità. Vantaggi: 1. la reazione avviene in 5 contro le ore di una reazione di ligasi 2. la percentuale di molecole di plasmide che ricircolarizzano è quasi zero