LAVORO DI LABORATORIO PROTOCOLLO DI ESTRAZIONE ED ANALISI DEL DNA GENOMICO

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1 LAVORO DI LABORATORIO UNIVERSITA DEGLI STUDI DI UDINE CLASSE 3 G DATA 19/03/2018 LUOGO UDINE 1

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3 INDICE 1 - INTRODUZIONE TEORIA IL DNA 2.2 MATERIALI UTILIZZATI PROCEDIMENTO RACCOLTA DELLE CELLULE DALLA MUCOSA BOCCALE 3.2 LISI CELLULARE INATTIVAZIONE DEGLI ENZIMI PROTEICI ISOLAMENTO DEL DNA E PREPARAZIONE DEL PRECIPITATO CORSA ELETTROFORETICA OSSERVAZIONI E CONCLUSIONI 20 5 ESECUZIONE 21 3

4 INTRODUZIONE Lunedi 19 marzo ci siamo incamminati verso l Università degli Studi di Udine accompagnati dalla professoressa Gregori. All arrivo abbiamo composto i gruppi di lavoro e abbiamo scelto in ciascuno di essi due persone. I prescelti non avrebbero dovuto mangiare per non alterare il loro DNA. Dopo questa preselezione siamo entrati nell edificio e subito dopo nel laboratorio. Ad attenderci c era una professoressa e alcuni studenti dell Università che ci avrebbero dovuto assistere durante le varie fasi di lavoro. Ogni gruppo aveva il proprio tutor e, prima di iniziare, abbiamo ripassato il protocollo per poi procedere nel dettaglio alle fasi dell esperimento. 4

5 2 - TEORIA 2.1 IL DNA Il DNA è una lunghissima molecola che contiene tutte le informazioni necessarie al corretto sviluppo e adeguato funzionamento delle cellule di un organismo vivente. E formata da due filamenti di nucleotidi. Questi due filamenti si avvolgono l uno nell altro come una spirale. I nucleotidi costituiscono lo scheletro esterno del DNA e hanno molecole di acido fosforico e di zucchero. Le basi azotate (Adenina, Citosina, Guanina e Timina) sono invece contenute all interno di questo scheletro e si legano fra loro non a caso ma secondo una legge. La molecola di DNA possiede inoltre la capacità di duplicarsi e di costruire una copia esatta di se stessa. 5

6 Adenina Timina Citosina Guanina 6

7 Nella scoperta del DNA ci furono varie ricerche scientifiche; la prima fu nel 1920 da parte di Frederick Griffith che definì il DNA una proteina. Tra il 1930 e il 1940 il biologo americano Oswald Avery dimostrò che Griffith si sbagliava e che il DNA non era una proteina ma un acido nucleico. La precisa struttura del DNA rimase sconosciuta fino al 1953 quando James Watson e Francis Crick esposero un modello della molecola per spiegare la disposizione dei nucleotidi all interno di essa. Watson e Crick ebbero un intuizione incredibile, svelando all intera comunità scientifica ciò che da anni si stava cercando di capire. 7

8 2.2 MATERIALI UTILIZZATI Sono stati disposti in un piano d'appoggio: Acqua; Provette con i nomi degli alunni ; Soluzione di Lisi; Pipetta Pasteur; La nostra saliva; Un bicchierino; Poteasi; Water bath; Etanolo freddo; Provetta a forma di doppia elica; Colorante( Loading Dye); Centrifuga; 8

9 3 - PROCEDIMENTO 3.1 RACCOLTA DELLE CELLULE DALLA MUCOSA BOCCALE Avevamo a disposizione un tubo da 15 ml ed abbiamo scritto su di esso le iniziali delle due persone prescelte con un pennarello indelebile. In seguito le persone hanno masticato gentilmente l interno delle loro guance in modo tale che alcune cellule si staccassero, e hanno fatto vari risciacqui con dell acqua contenuta in un bicchiere. 9

10 3.2 LISI CELLULARE Poi hanno sputato in un bicchiere la saliva e l hanno travasata, facendo molta attenzione, nella provetta da 15 ml. In seguito abbiamo preso la soluzione di Lisi come indicato nelle istruzioni e abbiamo aggiunto 2 ml di questa nella provetta contente la loro saliva. Abbiamo chiuso il tappo e abbiamo invertito gentilmente la provetta per 5 volte 10

11 3.3 INATTIVAZIONE DEGLI ENZIMI PROTEICI Successivamente abbiamo aggiunto 5 gocce di proteasi nella provetta con la saliva, ed abbiamo chiuso il tappo invertendola per 5 volte dolcemente. Infine abbiamo incubato la provetta della Water Bath a 50 C per 10 min. PROVETTE 11

12 Tirata fuori la provetta dal Water Bath abbiamo messo 10 ml di Etanolo freddo usando delle pipette Pasteur. PROVETTE 12

13 3.4 ISOLAMENTO DEL DNA E PREPARAZIONE DEL PRECIPITATO Svolto questo passaggio abbiamo lasciato ferma la provetta per 5 minuti e successivamente abbiamo dovuto invertire dolcemente il tubetto perché così il DNA sarebbe precipitato sul fondo della provetta sotto forma di un aggregato visibile. 13

14 Con una pipetta Pasteur abbiamo trasferito il DNA in una provetta a doppia elica fornita dal kit per poter avere un ricordo e potercelo portare a casa, mentre un altra parte del DNA è stata trasferita in una provetta per poterlo analizzare. 14

15 3.5 CORSA ELETTROFORETICA Abbiamo preso poi l Eppendorf con il DNA e l Etanolo e li abbiamo messi nella centrifuga, (per bilanciarla abbiamo messo un altra Eppendorf contenente acqua) per 1 minuto. 15

16 Terminata la centrifugazione, abbiamo tolto l Etanolo con una pipetta Pasteur e abbiamo lasciato la provetta aperta per farlo evaporare. Per disgregare il DNA abbiamo messo circa 350 μl di acqua pipettando con una micro pipetta. In seguito abbiamo estratto il DNA con una micro pipetta e l abbiamo trasferito in una provetta pulita. 16

17 Poi abbiamo prelevato del colorante (Loading Dye) e l abbiamo aggiunto alla provetta con solo il DNA. 17

18 Poi abbiamo centrifugato la provetta per 10 secondi per mescolare il DNA al colorante. Dopo abbiamo inserito nel gel, con una micro pipetta, il DNA e abbiamo applicato un campo elettrico per 15 min e analizzato i diversi tracciati ottenuti. 18

19 ANALISI FINALE DEI DNA 19

20 4 OSSERVAZIONI E CONCLUSIONI Grazie a questa esperienza abbiamo capito come si estrae il DNA attraverso dei semplici passaggi e, con l aiuto di ricercatori specializzati in questo ambito, abbiamo assistito a una procedura scientifica in un laboratorio di chimica. 20

21 5 ESEGUITO DA: Fico Gaia Marini Cecilia La Pietra Matilde Sallusti Ilenia 21