La regolazione della trascrizione nei procarioti. Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie

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1 La regolazione della trascrizione nei procarioti

2 La regolazione della trascrizione Concetti di base Sequenze cis-agenti le sequenze cis-agenti non vengono convertite in nessuna altra forma, ma funzionano direttamente in situ nel DNA, e hanno efffetto esclusivavemte sul DNA (o RNA) al quale sono fisicamente legate Sequenze che codificano per prodotti trans-agenti un gene è una sequenza di DNA che codifica per un prodotto diffusibile. Il prodotto può essere una proteina (nella maggioranza dei casi) o un RNA (nel caso dei geni che codificano per trna o per rrna). il concetto cruciale è che il prodotto del gene diffonde dal sito di sintesi per agire altrove. Geni strutturali codificano per proteine (o RNA). I geni strutturali codificano per una enorme varietà di proteine, tra cui sia proteine strutturali vere e propie che enzimi con attività catalitica. Geni regolatori codificano per proteine la cui funzione è di regolare l espressione di altri geni. Un gene regolatore codifica una proteina che controlla la trascrizione legandosi a uno o più siti specifici sul DNA i siti bersaglio si trovano di solito (ma non sempre) subito a monte del gene bersaglio della regolazione. Il promotore ed il terminatore che segnano l inizio e la fine di una unità di trascrizione sono tipici esempi di sequenze cis-agenti.

3 Regolazione negativa La regolazione negativa è il modo classico di regolare l espressione genica nei batteri Nella regolazione negativa una proteina repressore impedisce ad un gene di essere espresso. Nello stato basale il gene è espresso grazie al riconoscimento diretto del suo promotore da parte della RNA polimerasi. Vicino al promotore c è un altro sito cis-agente, chiamato operatore, che il sito bersaglio del repressore. Quando il repressore lega l operatore, la RNA polimerasi non può iniziare la trascrizione e di conseguenza, non c è espressione genica.

4 Regolazione positiva La regolazione positiva viene utilizzata anche dai batteri, ma è la maniera di gran lunga più frequente con cui gli eucarioti regolano l espressione dei loro geni. Un fattore di trascrizione è necessario per aiutare la polimerasi ad iniziare la trascrizione. Nello stato basale il gene è inattivo e la polimerasi non può iniziare la trascrizione al promotore. Uno o più fattori trans-agenti hanno il loro sito bersaglio nelle vicinanze del promotore, ed il loro legame permette alla polimerasi di iniziare la trascrizione. In entrambi i tipi di regolazione, delle proteine trans-agenti riconoscono delle sequenze cis-agenti. Queste proteine riconoscono sequenze molto corte, in genere meno di 10 paia di basi (la polimerasi copre 70 paia di basi, ma le sequenze cruciali per il riconoscimento sono i due esameri). Una differenza importane tra l organizzazione genica dei procarioti e quella degli eucarioti è che i geni dei batteri sono organizzati in gruppi (clusters), mentre quelli degli eucarioti sono singoli. Il raggruppamento dei geni permette il controllo coordidato dei geni raggruppati da un solo promotore.

5 L operone I geni strutturali dei batteri sono spesso organizzati in gruppi (clusters) contenenti geni che codificano per proteine le cui funzioni sono collegate. Un caso tipico è il gruppo (cluster) dei 3 geni strutturali lac, laczya. Il gruppo di geni è trascritto in un singolo mrna policistronico da un singolo promotore regolato. Le proteine del gruppo permettono al batterio di metabolizzare i β-galattosidi (es. lattosio) lacz codifica per la β-galattosidasi, che divide i β-galattosidi in zuccheri semplici per esempio il lattosio è scisso in glucosio e galattosio, che viene poi ulteriormente metabolizzato lacy codifica per la β-galattoside permeasi, che trasporta i β-galattosidi nella cellula laca codifica per la β-galattoside transacetilasi, un enzima che trasferisce un gruppo acetilico dall acetil-coa ai β-galattosidi. L intero sistema, compresi gli elementi che controllano l espressione genica, forma una unità di regolazione che si chiama operone. L attività dell operone è controllata dai geni regolatori, le cui proteine interagiscono con le sequenze cis-agenti del promotore. La trascrizione dei geni laczya è controllata da una proteina regolatrice sintetizzata dal gene laci. Il gene laci si trova vicino ai geni strutturali, ma è una unità di trascrizione indipendente con il propio promotore e terminatore codificando per un prodotto diffusibile potrebbe essere ovunque anche su un altra molecola di DNA

6 L espressione dei geni lac è controllata da un repressore I geni lac sono controllati da regolazione negativa: sono trascritti a meno che non vengano spenti da una proteina regolatrice. Il prodotto del gene laci è chiamato repressore lac perchè la sua funzione è di impedire l espressione dei geni strutturali. Ci sono 10 repressori in una cellula batterica normale. Il repressore agisce legandosi ad un operatore (O lac ) situato al inizio del gruppo di geni laczya. L operatore si trova in questo caso tra il promotore ed i geni strutturali. Quando il repressore si lega all operatore, impedisce alla RNA polimerasi di iniziare la trascrizione al promotore. L operatore si estende dalla posizione -5 alla posizione +21 dell unità di trascrizione. Quindi la sequenza dell operatore si sovrappone alla sequenza della parte destra del promotore.

7 L operone lac può essere indotto La sintesi di un enzima in risposta alla comparsa di un substrato specifico si chiama induzione (in assenza di β-galattosidi, non c è necessità di β-galattosidasi, e il batterio contiene <5 copie dell enzima). In assenza del substrato, l operone è trascritto ad un livello basale molto basso. La trascrizione comincia appena il substrato è aggiunto i livelli dello mrna lac aumentano rapidamente fino ad un livello dettato dal bilanciamento tra la sintesi dell RNA e la sua degradazione l RNA lac è estremamente instabile, con una emivita di 3 min La trascrizione cessa non appena il substrato è rimosso, in breve tempo tutto il mrna lac è degradato ed il contenuto cellulare ritorna a livello basale. La traduzione dell RNA lac produce β-galattosidasi l enzima compare 2-3 minuti dopo l agginta del substrato, e in breve ci sono 5000 copie dell enzima per batterio nelle condizioni appropiate, la β-galattosidasi può rappresentare fino al 5-10% delle proteine totali del batterio se il substrato è rimosso dal mezzo di cultura, la sintesi dell enzima cessa con la stessa rapidità con cui era iniziata l enzima è più stabile dell RNA, quindi rimane più a lungo. Le molecole che inducono la sintesi di enzimi in grado di metabolizzarle si chiamano induttori.

8 L attività del repressore è controllata dall induttore a basso peso molecolare Solamente il substrato o una molecola molto simile può agire da induttore. L attività di induttore non dipende dall interazione con l enzima. Alcuni induttori assomigliano agli induttori naturali dell operone lac, ma non sono metabolizzabili; per esempio, l isopropiltiogalattoside (IPTG) non lega la β-galattosidasi, ma è un induttore molto efficiente. Le molecole che inducono l espressione genica ma non vengono metabolizzate si chiamano induttori gratuiti. Quindi una componente diversa dall enzima riconosce l induttore. La componente che è regolata dall induttore è il repressore laci. In assenza dell induttore, il repressore è legato all operatore ed i geni laczya non sono espressi.

9 L attività del repressore è controllata dall induttore a basso peso molecolare Quando l induttore lega il suo sito, esso cambia la conformazione del repressore in maniera tale da influenzare l attività del sito di legame all operatore: controllo allosterico. Quando viene aggiunto l induttore, il repressore si stacca dall operatore e la trascrizione ha inizio. La struttura dell operone permette una regolazione coordinata: tutti i geni sono (o non) espressi assieme. Se l operatore è represso, come fa l induttore a entrare nel batterio? Livello basale e diverso sistema di trasporto Le caratteristiche essenziali del circuito di controllo risiedono nelle duplici proprietà del repressore: può impedidire la trascrizione; può riconoscere l induttore. Il repressore ha due siti di legame: uno per l operatore; uno per l induttore.

10 Lo stesso repressore può agire su più siti Il repressore lac agisce solo sull operatore del gruppo di geni laczya. Alcuni repressori controllano invece geni strutturali dispersi nel genoma, legandosi a più di un operatore. Il repressore trp controlla 3 gruppi di geni dispersi: un operatore nel gruppo di geni trpedbca controlla la sintesi del triptofano dall acido corismico; un operatore controlla il gene aroh, che codifica uno dei tre enzimi che catalizzano la reazione iniziale della biosintesi dei tre amminoacidi aromatici; infine il gene regolatore trpr è represso dal suo prodotto, il repressore trp. Quindi il repressore riduce la propia sintesi. Questo circuito di controllo è un esempio di controllo autogeno. Una sequenza conservata di 21 paia di basi (operatore) è presente in ciascuna delle tre regioni sulle quali agisce il repressore trp. Tra i nucleotidi conservati ci sono i punti di contatto del repressore trp.

11 Gli operatori possono trovarsi in posizioni diverse rispetto ai promotori Anche nel caso di operatori riconosciuti dallo stesso repressore, la posizione non è sempre la stessa rispetto al promotore: nel gene trpr un operatore si estende da -12 a +9; nell operone trp l operatore occupa le posizioni da -23 a -3; nel gene aroh si trova più a monte, tra -49 e -29. In alcuni casi l operatore si trova a valle del promotore (come nell operone lac). In altri casi l operatore si trova a monte del promotore (come nell operone gal). La capacità dei repressori di agire su operatori le cui posizioni sono così diverse rispetto ai promotori suggerisce che ci sono delle differenze nei dettagli del mecanismo di repressione, ma il comune denominatore è che viene impedito alla RNA polimerasi l inizio della trscrizione al promotore.

12 laci rtpr Regolazione positiva e negativa I gene sotto controllo negativo sono espressi salvo essere spenti da un repressore sicurezza: se il regolatore è inattivato, il batterio non perde enzimi essenziali. Per i geni sotto controllo positivo l espressione è posibile solo in presenza dell attivatore anzichè interferire con l attivazione, il regolatore è essenziale perchè essa avvenga il regolatore si chiama attivatore di solito l attivatore supplisce ad una carenza del promotore, per esempio una cattiva sequenza di consenso a -35 o a -10. Gli operoni sono definiti anche inducibili o repressibili.